木霉菌與殺菌劑聯合使用對水稻紋枯病菌的抑制效果

張亞玲，唐雪婷，王 兵，候鈺煊，趙羽涵，靳學慧

（黑龍江八一農墾大學/黑龍江省植物抗性研究中心/黑龍江省作物-有害生物互作生物學及生態防控重點實驗室，黑龍江 大慶 163319）

水稻紋枯病是由立枯絲核菌（Rhizoctonia solaniKühn）引起的土傳病害，嚴重影響水稻生產安全[1]。生產上對水稻紋枯病的防治仍以化學防治為主，趙敏等[2]研究表明，30%肟菌·戊唑醇、5%已唑醇對水稻紋枯病的防效分別達到76.3%、83.8%。唐正合等[3]通過離體抑菌試驗研究了丙環唑對水稻紋枯病菌的抑制作用，結果表明，丙環唑能夠強烈抑制水稻紋枯病菌菌絲生長。近年來，利用有益微生物對水稻紋枯病進行生物防治取得了明顯的效果，木霉屬(Trihcoderma)真菌是對水稻紋枯病防治應用研究較多的一種真菌。周曉梅等[4]研究表明，哈茨木霉、綠色木霉、長枝木霉對多種病原細菌有拮抗作用，其中，哈茨木霉對水稻紋枯病菌具有很強的重寄生能力。但這些有益微生物在田間使用過程中存在防效低、藥效易受環境條件影響等缺點，尚無法完全替代化學殺菌劑[5]。如果能將有益生物農藥與化學農藥聯合使用，或進行減量復配，實現增效的目的，則是解決該問題的重要途徑[6]。胡婕等[7]、GUPTA 等[8]、張蜻迪等[9]研究表明，化學殺菌劑與木霉菌聯合后對植物病害的防治具有協同作用，即兩者聯合使用比單獨一種藥物作用效果更好。目前，關于木霉菌與防治水稻紋枯病的常用化學藥劑聯合使用的協同作用研究尚未系統報道，鑒于此，初步探索了3種木霉菌和防治水稻紋枯病常用殺菌劑及其聯合使用對水稻紋枯病菌的抑制作用，以期為生產上合理使用生防菌劑和化學藥劑防治水稻紋枯病提供參考。

1 材料和方法

1.1 供試菌株

供試生防菌株：哈茨木霉菌HZT-1、長枝木霉CZT-2和綠色木霉菌LZT-3由黑龍江八一農墾大學植物抗性研究中心實驗室分離、鑒定并保存；供試水稻紋枯病菌由黑龍江八一農墾大學植物抗性研究中心研究人員田間采集病株，經實驗室分離、鑒定并保存。

1.2 供試藥劑

供試化學殺菌劑為生產上防治水稻紋枯病的常用化學藥劑：20%丙環唑乳油（北京中農藥工有限公司）、25%嘧菌酯懸浮劑（浙江博仕達作物科技有限公司）、20%噻唑鋅懸浮劑（浙江新農化工股份有限公司）、125 g/L 氟環唑懸浮劑（江蘇七洲綠色化工股份有限公司）。

1.3 供試培養基

PDA 培養基：馬鈴薯200 g，加水1 000 mL，煮沸30 min，冷后用雙層紗布過濾，濾液內加15 g 瓊脂、20 g 葡萄糖，加水補足至1 000 mL，高壓滅菌30 min后備用。

1.4 試驗方法

1.4.1 殺菌劑對水稻紋枯病菌的室內毒力測定

用無菌水在無菌條件下配制不同質量濃度的化學殺菌劑溶液，采用菌絲生長速率法[10]測定參試4種化學殺菌劑對水稻紋枯病菌菌絲生長的抑制作用。具體方法如下：準確量取各藥劑母液，分別用滅菌水稀釋成5個不同的質量濃度梯度。取稀釋后的藥液加入到已滅菌的PDA 培養基中（V藥劑∶V培養基=1∶9），制成含藥PDA 平板，以PDA 培養基中加入等量滅菌水為空白對照。用打孔器打取培養在PDA培養基中的水稻紋枯病菌菌餅（直徑5 mm），將菌絲面向下接種于含藥PDA 培養基平板中央，每個藥劑質量濃度處理重復4次，試驗重復3次，在25 ℃恒溫培養箱中培養3 d 后用十字交叉法測量菌落直徑，按照公式（1）計算抑菌率（I）。

式中，Dc 為對照組菌落直徑（cm），Dt 為處理組菌落直徑（cm）。

1.4.2 木霉菌對水稻紋枯病菌的抑菌研究 采用對峙培養法研究木霉菌對水稻紋枯病菌的抑制作用[11]。將直徑為5 mm 的3 種木霉菌菌餅和水稻紋枯病菌菌餅分別組合接種到距離平板中央相等的2 個點上，以不接種木霉菌菌餅為對照，每個處理重復3 次，25 ℃恒溫培養3 d 后，測定菌落直徑，按照公式（2）計算抑菌率（I）。

式中，RCK為對照病原菌菌落直徑(mm)，RB為與木霉菌對峙培養的紋枯病菌菌落直徑(mm)。

1.4.3 殺菌劑與木霉菌聯合使用對水稻紋枯病菌的抑制作用測定

1.4.3.1 殺菌劑對木霉菌的抑菌作用 在化學藥劑與生防菌聯合使用之前首先要明確二者相容性。將4 種化學殺菌劑按照需要分別配制成母液，量取各化學殺菌劑母液，用無菌水分別稀釋成5 個不同質量濃度梯度，25%嘧菌酯1.25～20.0 μg/mL，20%丙環唑0.32～20 μg/mL，125 g/L 氟環唑0.003 2～20 μg/mL，20%噻唑鋅0.37～30.0 μg/mL。取1 mL 稀釋后的藥液加入到已滅菌的9 mL PDA 中，制成含藥PDA 平板，分別接種經活化培養（25 ℃，2 d）的3 種木霉菌（菌餅直徑=5 mm，菌餅間相距3 cm），以不含藥PDA 平板上接種3 種木霉菌菌餅為空白對照。每個質量濃度處理重復4 次，試驗重復3 次。將PDA 平板倒置于25 ℃恒溫培養箱中培養48 h 后，測量菌落直徑，參考公式（1）計算抑制率。

1.4.3.2 殺菌劑與木霉菌聯合使用相容性評價標準 參照馬志強等[11]的試驗方法，根據化學殺菌劑對木霉菌的EC50（TEC50）與該殺菌劑對致病菌的EC50（REC50）比值（VEC50，公式3）篩選可與木霉菌聯合使用的殺菌劑，若VEC50＞1，認為該化學殺菌劑可與生防木霉菌聯合使用。

1.4.3.3 木霉菌和殺菌劑聯合使用對水稻紋枯病菌菌絲生長抑制作用 根據1.4.3.2 殺菌劑與生防木霉菌的相容性測定結果，選擇相容性好的25%嘧菌酯、20%噻唑鋅與3 種木霉菌聯合使用評價效果。研究方法參考牛芳勝[12]的試驗方法。分別量取25%嘧菌酯和20%噻唑鋅，用滅菌水稀釋成5 個不同質量濃度梯度制成含藥PDA 平板，25%嘧菌酯質量濃度梯度為1.25、2.5、5、10、20 μg/mL，20%噻唑鋅質量濃度梯度為10、20、30、40、50 μg/mL。同時接種經活化培養（25 ℃，2 d）的木霉菌和水稻紋枯病菌菌餅（菌餅直徑5 mm，菌餅間相距3 cm）。以含藥PDA 平板上單獨接入木霉菌或水稻紋枯病菌菌餅和不含藥PDA 平板上同時接種木霉菌和紋枯病菌為對照。每個處理重復3 次，試驗重復3 次。將PDA 平板倒置于25 ℃恒溫培養箱中培養3 d，測量兩菌菌落的相向半徑。

1.4.3.4 木霉菌與化學殺菌劑聯合使用增效作用的評價方法 木霉菌與化學殺菌劑聯合使用是否產生增效作用的評價方法參考牛芳勝[12]的協同系數法，協同系數（S）的計算見公式（4）。

式中，RTCK和RRCK分別表示木霉菌和水稻紋枯病菌的對照菌落半徑；RTt和RRt分別表示木霉菌和水稻紋枯病菌的對峙菌落相向半徑。S≥1.5，表示木霉菌和化學藥劑具有增效作用；1≤S＜1.5，表示木霉菌和化學藥劑具有相加作用；S＜1，表示木霉菌和化學藥劑具有拮抗作用。

本試驗以S值作為篩選可與木霉菌聯合使用的殺菌劑標準，若S≥1，則認為該化學藥劑可與生防木霉菌聯合使用。

2 結果與分析

2.1 殺菌劑對水稻紋枯病菌菌絲生長的抑制作用

由表1 可見，4 種殺菌劑對水稻紋枯病菌都有較強的抑制活性，4 種殺菌劑中，EC50值從小到大依次為25% 嘧菌酯（0.001 4 μg/mL）、20% 丙環唑（0.003 7 μg/mL）、125 g/L 氟環唑（0.222 0 μg/mL）、20%噻唑鋅（20.750 0 μg/mL）。25%嘧菌酯、20%丙環唑和125 g/L 氟環唑均表現出良好的抑菌效果，20%噻唑鋅的抑制效果相對較低。

表1 4種化學殺菌劑對水稻紋枯病菌菌絲生長的抑制作用Tab.1 Inhibitory effect of four fungicides to Rhizoctonia solani by mycelium growth rate method

2.2 木霉菌對水稻紋枯病菌菌絲生長的抑制作用

由圖1 可見，3 種木霉菌對水稻紋枯病菌均具有較好的抑制作用，其中，長枝木霉CZT-2 的抑制作用最好，抑制率達93.25%；其次為綠色木霉LZT-3，抑制率為76.45%；哈茨木霉菌HZT-1對水稻紋枯病菌的抑制率相對較低，為53.54%。

2.3 殺菌劑與木霉菌聯合使用對病原菌的抑制作用

2.3.1 殺菌劑與木霉菌的相容性 殺菌劑與木霉菌聯合使用時，需盡量避免殺菌劑影響木霉菌的活性。聯合應用時原則上應選擇對木霉菌無抑制作用的殺菌劑，但在實際中這類化學殺菌劑和生防菌為數不多。本研究利用VEC50＞1 作為篩選可與木霉菌聯合使用的殺菌劑標準，結果見表2。由表2可見，4 種化學殺菌劑對3 種木霉菌和水稻紋枯病菌菌絲生長均有抑制作用，25%嘧菌酯和20%噻唑鋅對水稻紋枯病菌菌絲生長的抑制作用始終大于對木霉菌的抑制作用，其VEC50＞1；20%丙環唑和125 g/L氟環唑對水稻紋枯病菌菌絲生長的抑制作用始終小于對木霉菌的抑制作用，其VEC50＜1。說明25%嘧菌酯和20%噻唑鋅可與3種木霉菌聯合使用。

從表2 還可以看出，綠色木霉菌LZT-3 對25%嘧菌酯最敏感，EC50值為0.522 3 μg/mL，長枝木霉菌（CZT-2）和哈茨木霉菌（HZT-1）對25%嘧菌酯的敏感 性 相 對 較 差，EC50值 分 別 為40.738 0 μg/mL 和34.673 6 μg/mL。長枝木霉菌（CZT-2）對20%噻唑鋅相對較敏感，其EC50值是32.700 3 μg/mL，綠色木霉菌（LZT-3）和哈茨木霉菌（HZT-1）的EC50值分別為128.820 4 μg/mL 和549.541 1 μg/mL。20%丙環唑和125 g/L氟環唑對木霉菌均有較強的抑制作用。

表2 4種殺菌劑對水稻紋枯病菌和木霉菌的抑制作用Tab.2 Inhibition effect of four fungicides against R.solani and Trichoderma by mycelial growth rate method

續表2 4種殺菌劑對水稻紋枯病菌和木霉菌的抑制作用Tab.2（Continued） Inhibition effeit of four fungicides against R. solani and Trichoderma by mycelial growth rate method

2.3.2 木霉菌與殺菌劑聯合使用對水稻紋枯病菌菌絲生長抑制的增效作用 通過殺菌劑與生防木霉菌的相容性測定，選擇相容性好的25%嘧菌酯、20%噻唑鋅與3 種木霉菌聯合使用，應用協同系數法評價聯合使用后的增效作用，結果見表3，其培養生長狀況見圖2 和圖3。表3 表明，綠色木霉LZT-3、長枝木霉CZT-2 與25%嘧菌酯、20%噻唑鋅聯合使用的協同系數（S）均大于1，說明二者聯合使用后有增效作用，且隨著25%嘧菌酯質量濃度增加，協同系數（S）值增大，在低質量濃度（1.25 μg/mL）25%嘧菌酯下表現相加作用，在高質量濃度（≥2.5 μg/mL）25%嘧菌酯下表現為增效作用。哈茨木霉菌與低質量濃度25%嘧菌酯（1.25 μg/mL）、20%噻唑鋅（10 μg/mL）聯合使用表現出拮抗作用，與高質量濃度25%嘧菌酯（≥2.5 μg/mL）、20%噻唑鋅（≥20 μg/mL）聯合使用表現相加作用和增效作用。

表3 木霉菌與殺菌劑聯用對水稻紋枯病菌菌絲的抑制及增效作用評價Tab.3 Inhibition and synergism of Trichoderma and fungicides on mycelium of R.solani

3 結論與討論

本研究采用3 種木霉菌分別與4 種常用化學殺菌劑相組合，研究其對水稻紋枯病菌（立枯絲核菌）的抑制效果，通過EC50值比值(VEC50)判斷化學殺菌劑與3種生防木霉菌的相容性，利用協同系數（S）比較其聯合使用后是否有增效作用。結果表明，參試4種化學殺菌劑和3 種木霉菌對水稻立枯絲核菌均有抑制作用；通過VEC50值分析，25%嘧菌酯和20%噻唑鋅與3 種木霉菌的相容性好，可與木霉菌聯合使用。通過協同系數（S）分析聯合使用后的增效作用，發現綠色木霉、長枝木霉分別與25%嘧菌酯、20%噻唑鋅聯合使用有相加作用和增效作用，哈茨木霉菌與高質量濃度25%嘧菌酯、20%噻唑鋅聯合有增效作用。長枝木霉、綠色木霉可與25%嘧菌酯、20%噻唑鋅聯合使用，作為防治水稻紋枯病的優良微生物資源，具有良好的開發前景。

木霉菌主要是以強大的競爭能力和重寄生特性實現其生物防治作用[13?14]，其對多種植物病原菌表現出拮抗作用[15?19]。如景芳等[20]、牛鑫斌等[21]利用長枝木霉T6 制成水分散粒劑，其產孢量大、孢子萌發率高，田間競爭力較強，對Fusariumspp.、Pythiumspp.、Phytophthoraspp.、R.solani等多種土傳病害病原菌均有較好的抑制作用。本試驗中，參試3種木霉菌株對水稻紋枯病菌均有抑制作用，其中長枝木霉CZT-2 的抑制效果最好，抑制率達93.25%。因此，長枝木霉CZT-2 菌株可作為防治水稻紋枯病的生防菌種資源。

化學藥劑是田間防治水稻紋枯病的常用藥劑。本研究采用的丙環唑和氟環唑為三唑類廣譜殺菌劑，其作用機制是影響甾醇的生物合成，從而導致細胞死亡[22]；嘧菌酯屬于甲氧基丙烯酸酯類殺菌劑，作用機制主要是抑制線粒體呼吸產生ATP 來抑制病原菌的能量合成[23]。本研究發現，25%嘧菌酯、20%丙環唑和125 g/L 氟環唑對水稻紋枯病菌抑制效果較好，這與劉顯良等[24]的研究結果一致。噻唑鋅結構由2個功能基團組成，一是噻唑基團，病原菌沒有侵染進入前，該基團對致病菌無抑制作用，但病原菌侵入植物體后有較好的抑菌作用；二是鋅離子，既具有保護作用又有治療作用[25]。本研究發現，20%噻唑鋅的抑制效果較其他3 種藥劑差些，這可能是因為在植物體外的抑菌試驗中只有1個功能基團（鋅離子）起作用，可進一步進行田間防治試驗明確其防效。

在研究化學藥劑與生防菌劑聯合使用時首先要明確2 種物質的相容性。本研究測定了3 種木霉菌和水稻立枯絲核菌對4 種化學殺菌劑的敏感性，利用EC50值比值（VEC50）確定化學殺菌劑與生防菌劑的相容性。研究發現，4 種化學殺菌劑中25%嘧菌酯和20%噻唑鋅對水稻紋枯病菌的抑制作用強于對木霉菌的抑制作用，VEC50＞1，表明這2 種殺菌劑雖對木霉菌和水稻紋枯病菌均有抑制作用，但對木霉菌的抑制作用小于對水稻紋枯病菌的抑制作用，木霉菌可發揮其生防作用。牛芳勝[12]研究嘧菌酯對木霉菌和灰霉病菌的抑制作用，發現其VEC50＞1，與本研究結果相似。20%丙環唑和125 g/L 氟環唑對木霉菌的抑制作用大于對水稻紋枯病菌的抑制作用，VEC50＜1，說明二者對木霉菌的毒力大于對水稻紋枯病菌的毒力，殺菌劑在抑制水稻紋枯病菌的同時也抑制了木霉菌的生長，因此不能充分利用木霉菌的生防活性。如果殺菌劑對木霉菌無抑制作用時，VEC50值趨于無限大，聯合后木霉菌將不受藥劑的影響，能充分發揮兩者的聯合作用。

從4 種化學殺菌劑與生防菌的相容性結果發現，3 種木霉菌對25%嘧菌酯和20%噻唑鋅的耐受能力更強，可聯合使用。本研究采用協同系數法評價殺菌劑與木霉菌聯合使用的協同增效作用，結果發現，在殺菌劑一定質量濃度下存在協同增效作用。謝立等[26]研究了殺菌劑與生防菌聯合使用后對植物病害防治具有協同作用，兩者聯合使用可以提高防治效果。李敏等[27]研究了哈茨木霉與多菌靈復合使用對水稻苗期立枯病的防治效果，結果表明，聯合使用比單獨使用多菌靈和哈茨木霉防治效果分別提高26.87%和9.90%。本試驗結果表明，相比于單獨使用殺菌劑和木霉菌，綠色木霉LZT-2、長枝木霉CZT-2 與殺菌劑嘧菌酯、噻唑鋅聯合使用抑菌效果更好，具有增效作用和相加作用，下一步將進行田間試驗，評價二者聯合使用后的田間效果。