酚類菊糖衍生物的制備及抗氧化活性

李 青，譚文強，苗 芹，郭占勇

（中國科學院煙臺海岸帶研究所，海岸帶生物學與生物資源利用重點實驗室，山東 煙臺 264003）

菊糖，又名菊粉，具有調節腸胃功能、提高免疫力及促進礦物質吸收等多種保健作用，可以用作食品添加劑和膳食補充劑，已有40多個國家將其批準為功能食品，并廣泛應用到醫藥、保健品、食品工業等領域[1-3]。在我國菊糖也正在被大眾所認知，菊糖生產及其相關行業迅速增長。菊糖具有一定的生物活性，作為一類可再生、無毒、生物相容性好的天然多糖，來源豐富，結構相對簡單，且有可修飾的羥基，具有較大的結構修飾空間。因此，通過化學修飾對菊糖進行結構改性提高其生物性能的相關研究備受關注。目前在天然多糖化學修飾的相關研究中，殼聚糖和甲殼素等報道較多[4-8]，而針對菊糖的結構改性及相應的產品開發相對較少。有文獻報道在菊糖上連接咪唑環并季銨化后，菊糖衍生物質量濃度為1.6 mg/mL時對超氧陰離子自由基（O－2·）和羥自由基（·OH）的清除率分別為67.8%和86.7%[9]，與菊糖相比有大幅度提高。本課題組前期研究[10-11]發現，在多糖上連接活性基團可以提高其抑菌性和抗氧化活性。連接三氮唑鎓鹽的殼聚糖衍生物和菊糖衍生物都表現出很高的清除能力（半抑制質量濃度（half maximal inhibitory concentration，IC50）＜0.01 mg/mL），與抗壞血酸相近。由此可見，通過化學修飾提高菊糖的抗氧化活性有非常大的潛力。

近些年，氧化應激引起的健康問題受到很大的重視，其誘導機體衰老并加劇阿爾茨海默病、心血管疾病、惡性腫瘤等疾病[12]?？寡趸瘎┛梢郧宄^量的自由基減輕機體的氧化脅迫損傷，從而有助于延緩衰老，保護人體免受多種慢性疾病的侵襲[13]；另一方面能夠有效保證藥品品質并延長有效期，因此受到廣泛的關注，被食品、保健品、化妝品企業列為重要研發內容[14-15]。自由基清除能力是抗氧化能力的重要指標，菊糖本身就有一定的自由基清除能力，而且具有無毒、無刺激、生物相容性好、來源豐富、價格低廉和易修飾等優點，是開發天然抗氧化劑的優良選擇[11,16]。

為開發菊糖衍生物的實際應用性，本實驗選擇兼具高生物活性和安全性的多酚類化合物，對菊糖進行化學修飾。酚類化合物具有抗氧化、抗癌、抗炎和抗過敏等活性[17]。有些酚類化合物在抗氧化、降血脂等方面有很強的藥理作用，被廣泛用于抗動脈粥樣硬化、抗腫瘤、預防阿爾茨海默癥、抑制血小板聚集等方面[18-21]?；诖?，在前期研究基礎上制備一系列共6 種酚基菊糖衍生物，并測定其抗氧化活性，以期為開發菊糖衍生物在抗氧化劑或自由基清除劑等方面的應用提供依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

菊糖（分子質量8 000～12 000 Da） 西安百川生物科技有限公司；芳香醛（4-羥基苯甲醛、3-羥基苯甲醛、3,4-二羥基苯甲醛、2,3-二羥基苯甲醛、3-甲氧基-4-羥基苯甲醛和3,5-二甲氧基-4-羥基苯甲醛，純度≤98%）默克生命科學（上海）有限公司；碘甲烷、碘化鈉、氫氧化鈉、N-溴丁亞胺、三苯基膦、溴化鉀、乙二胺均為分析級 國藥集團化學試劑（上海）有限公司。

1.2 儀器與設備

IS50傅里葉變換紅外光譜（Fourier transform infrared spectroscopy，FTIR）儀 上海賽默飛科技有限公司；AVIII-500核磁共振（nuclear magnetic resonance，NMR）光譜儀 瑞士Bruker公司；DNM-9602G酶標儀 北京普朗新技術有限公司。

1.3 方法

1.3.1 菊糖衍生物的合成

菊糖衍生物的合成路線如圖1所示。

圖1 菊糖衍生物制備路線Fig. 1 Synthetic routes for the preparation of inulin derivatives

溴代菊糖（化合物1）的合成：按照文獻[22]中所述方法進行。以N-溴代丁二酰亞胺（N-bromosuccinimide，NBS）為溴代試劑與菊糖C6位伯羥基反應合成溴代菊糖（化合物1）。

化合物2的合成：在室溫下取2 mmol化合物1加入5 mL乙二胺中，在60 ℃攪拌反應16 h后將混合物倒入過量無水乙醇中，過濾沉淀，用無水乙醇反復洗滌，收集沉淀，冷凍干燥得6-N-(氨基乙基)-6-脫氧菊糖（化合物2）。

化合物3的合成：將1.0 mmol化合物2與1.5 mmol羥基苯甲醛（4-羥基苯甲醛、3-羥基苯甲醛、3,4-二羥基苯甲醛、2,3-二羥基苯甲醛、2-甲氧基-3-羥基苯甲醛和2,4-二甲氧基-3-羥基苯甲醛）加入10 mL二甲基亞砜中，75 ℃氬氣保護下攪拌20 h，然后將混合物倒入過量無水乙醇中，過濾沉淀，用乙醇反復洗滌。產物在索氏提取器中用無水乙醇提取48 h，產物在60 ℃下干燥24 h。

1.3.2 菊糖及其衍生物的FTIR和1H NMR分析

取一定量菊糖及1.3.1節制備的菊糖衍生物進行FTIR分析，KBr壓片，掃描范圍為4 000～500 cm－1。對1.3.1節制備的菊糖衍生物進行1H NMR分析，頻率500 MHz，溶劑為氘代二甲基亞砜（dimethyl sulfoxide-d6，DMSO-d6）。

1.3.3 抗氧化活性測定1

按照文獻[23]的方法進行，并稍加修改。用蒸餾水配制質量濃度分別為0.02、0.04、0.2、0.4、0.8 mg/mL的樣品溶液?！ぴ诜脏毫蛩峒柞ィ╬henazine methosulfate，PMS）-煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（nicotinamide ad enine dinucleotide，NADH）體系中產生。用Tris-HCl緩沖液（16 mmol/L、pH 8.0）分別配制NADH（365.7 μg/mL）、硝基藍四氮（245.3 μg/mL）和PMS（18.38 μg/mL）溶液。分別取0.5 mL NADH、PMS、硝基藍四氮溶液與不同質量濃度樣品溶液混合，使混合溶液中樣品終質量濃度分別為0.005、0.01、0.05、0.1、0.2 mg/mL。按以上方法配制混合溶液，以不加樣品溶液為空白組，不加NADH的溶液為對照組。室溫反應5 min，于560 nm波長處測定溶液吸光度（A560nm）。清除率按式（1）計算。

式中：A樣品表示樣品組溶液A560nm；A對照表示對照組溶液A560nm；A空白表示空白組溶液A560nm。

1.3.3.2 ·OH清除能力

·OH清除能力按照文獻[24]的方法進行，并稍加修改。用蒸餾水配制質量濃度分別為0.4、0.8、1.2、1.6、2.4 mg/mL的樣品溶液，用磷酸鹽緩沖溶液（pH 7.4）配制體積分數3% H2O2溶液、360 μg/mL番紅花T溶液和2 mmol/L乙二胺四乙酸-Fe2＋溶液。分別取0.25 mL乙二胺四乙酸-Fe2＋溶液、0.5 mL磷酸鹽緩沖溶液、0.5 mL番紅花T溶液、0.5 mL H2O2溶液與0.25 mL不同質量濃度樣品溶液混合，使混合溶液中樣品終質量濃度分別為0.05、0.1、0.15、0.2、0.3 mg/mL。按以上方法配制混合溶液，以不加樣品溶液作為空白組，不加樣品溶液和H2O2溶液作為對照組。37 ℃反應30 min，于520 nm波長處測定溶液吸光度（A560nm）?！H清除率按式（2）計算。

式中：A樣品表示樣品組溶液A560nm；A對照表示對照組溶液A560nm；A空白代表空白組溶液A560nm。

1.3.3.3 DPPH自由基清除能力

DPPH自由基清除能力按照文獻[25]的方法進行。用蒸餾水配制質量濃度分別為0.005、0.01、0.02、0.1、0.2 mg/mL的樣品溶液，用無水乙醇配制180 μmol/L DPPH溶液。分別取1 mL DPPH溶液和1 mL不同質量濃度樣品溶液混合，使混合溶液中樣品終質量濃度分別為0.002 5、0.005、0.01、0.05、0.1 mg/mL。按以上方法配制混合溶液，以不加樣品溶液作為空白組，用乙醇代替DPPH溶液作為對照組。室溫反應30 min，測定517 nm波長處溶液吸光度（A517nm）。DPPH自由基清除率按式（3）計算。

式中：A樣品表示樣品組溶液A517nm；A對照表示對照組溶液A517nm；A空白代表空白組溶液A517nm。

1.3.3.4 還原能力

按照文獻[26]的方法進行，并稍加修改[26]。用蒸餾水配制質量濃度分別為0.03、0.17、0.33、0.67、1 mg/mL的樣品溶液。分別取0.3 mL不同質量濃度樣品溶液與0.3 mL 1 g/100 mL鐵氰化鉀溶液混合，50 ℃反應20 min，然后加入0.3 mL體積分數10%三氯乙酸溶液終止反應，離心后取上清液加入0.1 mL 0.1 g/100 mL氯化鐵溶液，室溫反應10 min后，于700 nm波長處測定溶液的吸光度（A700nm）。用吸光度表示還原能力。

1.3.3.5 Fe2＋螯合能力

Fe2＋螯合能力按照文獻[26]方法進行測定。分別取1.8 mL無水甲醇、0.05 mL 2 mmol/L氯化亞鐵溶液、0.1 mL 5.0 mmol/L菲洛嗪溶液與0.05 mL不同質量濃度（0.04、0.4、2、4、6 mg/mL）的樣品溶液混合，使混合溶液中樣品終質量濃度分別為0.001、0.01、0.05、0.1、0.15 mg/mL。按以上方法配制混合溶液，以不加樣品溶液作為空白組。室溫反應10 min，于562 nm波長處測定溶液吸光度（A562nm）。Fe2＋螯和率按式（4）計算。

式中：A樣品表示樣品組溶液A562nm；A空白表示空白組溶液A562nm。

抗氧化活性指標（還原能力除外）均以IC50表示。

1.3.4 細胞毒性測定

以L929細胞為模型，對菊糖及其衍生物進行細胞毒性測定。采用CCK-8法進行體外細胞毒性測定[23]。L929細胞培養至指數生長期，配制為濃度1.0×105個/mL細胞懸液，接種于96 孔板，每孔100 μL。37 ℃、5% CO2、飽和濕度培養箱中培養24 h后，每孔加入不同質量濃度（31.25、62.5、125、250 μg/mL）的菊糖及其衍生物溶液100 μL，每個質量濃度3～5 個復孔，繼續培養24 h后，離心，吸取上層清液，每孔加入100 μL CCK-8試劑，37 ℃下繼續培養4 h，用酶標儀于450 nm波長處測定溶液吸光度（A450nm）。用等體積蒸餾水代替樣品溶液作為對照組。細胞存活率按式（5）計算。

式中：A樣品代表樣品組A450nm；A對照代表對照組A450nm。

細胞培養方法同上。使用不同質量濃度的菊糖衍生物化合物3C處理L929細胞24 h后，用普通光學顯微鏡在放大20 倍的亮場下觀察L929細胞形態并進行拍照。

1.4 數據處理與分析

每個實驗均重復3 次，結果以平均值±標準差表示。用Excel軟件進行數據處理，用Origin軟件繪圖。

2 結果與分析

2.1 酚基菊糖衍生物的合成

以菊糖為原料通過簡單的三步反應合成酚類菊糖衍生物。首先，以NBS為溴代試劑與菊糖C6位伯羥基反應合成溴代菊糖（化合物1），因為在三苯基膦存在下NBS可以選擇性地與伯羥基反應[11]；然后，通過乙二胺與溴代菊糖的親核反應將乙基氨基引入菊糖，制備6-N-(氨基乙基)-6-脫氧菊糖（化合物2）；最后，羥基苯甲醛與化合物2末端基團氨基反應，在菊糖上引入具有C＝N結構的酚基（化合物3）。

圖3 菊糖衍生物的1H NMR圖Fig. 3 1H NMR spectra of inulin derivatives

化合物3根據合成后R取代基的不同分為6 種，即化合物3A～F。對化合物2和化合物3A～F進行FTIR分析和1H NMR分析（圖2、3）。

圖2 菊糖及其衍生物的FTIR圖Fig. 2 Fourier transform infrared spectra of intermediate products and inulin derivatives

化合物2：FTIR：3 353（－NH2和－OH）、1 648 cm－1（－NH2）。1H NMR（500 MHz，DMSO-d6）：δ2.51（CH2－NH2）、2.62（CH2－NHCH2）和δ3.51、3.58（NH－CH2－CH2）。

化合物3A：FTIR：3 356（－NH2和－OH）、1 647 cm－1（N－H）和1 605、1 586 cm－1（苯環C＝C）以及838 cm－1（苯環C－H）。1H NMR（500 MHz，DMSO-d6）：δ2.77、2.86（CH2－NH－CH2），δ6.80、7.56（苯環－H）以及δ8.16（CH＝N）。

化合物3B：FTIR：3 363（－NH2和－OH）、1 647（－NH－）、1 596 cm－1（苯環C＝C）和873、790、693 cm－1（苯環C－H）。1H NMR（500 MHz，DMSO-d6）：δ2.79、2.90（CH2－NH－CH2），δ7.01、7.2（苯環－H）和δ8.15（CH＝N）。

化合物3C：FTIR：3 373（－NH2和－OH）、1 648（－NH－）、1 601（苯環C＝C）、823 cm－1（苯環C－H）。1H NMR（500 MHz，DMSO-d6）：δ2.78、2.85（CH2－NH－CH2），δ6.76～7.18（苯環－H），δ8.09（CH＝N）。

化合物3D：FTIR：3 362（－NH2和－OH）、1 636 cm－1（－NH－）和784、737 cm－1（苯環C－H）。1H NMR（500 MHz，DMSO-d6）：δ2.79、2.89（CH2－NH－CH2），δ6.57～6.82（苯環－H）和δ8.47（CH＝N）。

化合物3E：FTIR：3 373（－NH2和－OH）、1 647（－NH－）、1 594 cm－1（苯環C＝C）和877、827 cm－1（苯環C－H）。1H NMR（500 MHz，DMSO-d6）：δ2.81、2.89、3.10（CH2－NH－CH2），δ3.67（OCH3），δ6.82～7.31（苯環－H）和δ8.19（CH＝N）。

化合物3F：FTIR：3 385（－NH2和－OH）、1 644（－NH－）、1 605（苯環C＝C）、835 cm－1（苯環C＝H）。1H NMR（500 MHz，DMSO-d6）：δ2.82、2.91（CH2－NH－CH2），δ3.44（OCH3），δ7.01（苯環－H）和δ8.15（CH＝N）。

在FTIR圖譜中，與菊糖相比，終產物菊糖衍生物3A～F在1 600 cm－1附近出現新的振動吸收峰，為苯環C＝C鍵的伸縮振動峰，700～900 cm－1之間出現的新的吸收峰為苯環上C－H變形振動峰。這些峰都是苯環的特征吸收峰，由此表明酚基菊糖衍生物制備成功。在1H NMR譜圖中，在δ3.0～5.0處的信號峰主要為糖骨架的氫峰，δ2.7～2.9之間的信號峰為亞胺及相連的亞甲基的氫峰，δ6.5～7.3之間為苯環上氫質子的信號峰；δ8.1附近的信號峰為C＝N上的氫峰。δ2.7～2.9、6.5～7.3和δ8.1附近的3 組峰均為苯環及C＝N的特征峰，進一步證明酚基成功連接到菊糖上。

2.2 酚基菊糖衍生物抗氧化活性

抗氧化劑的抗氧化活性可以通過多種途徑實現，包括清除分子氧或降低分子氧局部濃度、去除金屬離子、捕獲O·或過氧化氫等活性氧（reactive oxygen species，ROS），清除·OH、RO·或ROO·等可以引發鏈反應的自由基，猝滅氧單質[27]。為研究這些酚基菊糖衍生物的抗氧化活性，測定其自由基清除能力、還原能力和Fe2＋螯合能力。

2.2.1 自由基清除能力

自由基是一類含有一個或多個未配對電子的活性物質[12,28]。體內的自由基大多是ROS或活性氮。本實驗選擇2 種典型的ROS（O·和·OH）和一種活性氮（DPPH自由基），考察酚類菊糖衍生物的自由基清除能力。

由圖4可知，菊糖與菊糖衍生物對DPPH自由基的清除能力均隨質量濃度的增大而增大。菊糖本身的DPPH自由基清除能力有限，在實驗質量濃度范圍內對DPPH自由基清除率最高僅達到13.9%（0.1 mg/mL），對·OH清除率最高只有20.68%（0.3 mg/mL），對O2－·清除率最高只有22.4%（0.2 mg/mL）。與菊糖相比，菊糖衍生物具有更強的自由基清除能力，說明酚基的存在增強了菊糖衍生物的自由基清除能力。此外，連接雙酚的菊糖衍生物（化合物3C、3D）較連接單酚的菊糖衍生物（化合物3A、3B和化合物3E、3F）的自由基清除能力高。連接雙酚的化合物3C、3D對DPPH清除能力的IC50均為0.007 mg/mL，較VE（IC50為0.01 mg/mL[29]）的DPPH自由基清除能力高；化合物3C清除O2－·的IC50為0.042 mg/mL。

圖4 不同質量濃度菊糖和菊糖衍生物的DPPH自由基（A）、·OH（B）和O2－·（C）清除能力Fig. 4 DPPH radical (A), ·OH (B) and O2-· (C) scavenging capacity of inulin and inulin derivatives at different concentrations

酚類化合物在清除自由基的過程中，一般是通過失去H原子形成芳氧自由基（中間體1、2），H原子在苯環上相鄰的兩個氧之間快速交換，共振體的存在降低了體系內能，使芳氧自由基更穩定。形成的自由基越穩定，該化合物的自由基清除能力越強。本實驗制備的酚類菊糖衍生物中，C＝N與苯環形成共軛結構，有助于形成穩定的芳氧自由基（圖5），相應的酚類菊糖衍生物的清除自由基能力就更強。有文獻報道，鄰苯二酚是多酚類化合物提供電子或H原子的關鍵決定因素[30]。

圖5 菊糖衍生物清除自由基的可能機理Fig. 5 Possible free radical scavenging mechanism for inulin derivatives

2.2.2 Fe2＋螯合能力

過渡金屬離子可以引發自由基反應并引起脂質過氧化和心血管疾病，造成DNA損傷[31]。螯合劑可以降低氧化還原電位，能作為輔助抗氧化劑控制金屬離子的氧化，并穩定金屬離子的氧化形式。因此，對過渡金屬離子的螯合能力是與自由基清除能力密切相關的一種抗氧化能力。從圖6可以看出，在實驗質量濃度（0.001～0.15 mg/mL）范圍內，菊糖的Fe2＋螯合能力不強，當質量濃度為0.15 mg/mL時，菊糖的Fe2＋螯合率為14.1%。連接酚基后，菊糖衍生物的Fe2＋螯合能力明顯提高，化合物3B的 Fe2＋螯合能力的IC50能夠達到0.006 mg/mL。

圖6 不同質量濃度菊糖和菊糖衍生物的Fe2＋螯合能力Fig. 6 Fe2+ chelating ability of inulin and inulin derivatives at different concentrations

2.2.3 還原能力

化合物的還原能力可以作為評價其潛在抗氧化活性的重要指標[32]。由圖7可知，菊糖本身的還原能力很弱，連接酚基之后還原能力有所提高。整體來看，制備的酚基菊糖衍生物中，化合物3A、3B、3E、3F的還原能力較為接近，化合物3C、3D的還原能力明顯較強。這與自由基清除能力的結果相似，鄰二雙酚結構的存在使得酚基菊糖衍生物具有更高的還原能力。一方面，鄰位的羥基通過共軛效應供電子使得酚羥基上的氧電負性增大，還原能力增強；另一方面，分子中活性羥基的數量也是影響其還原能力的因素。因此，化合物3C和3D的還原能力更強。

圖7 不同質量濃度菊糖和菊糖衍生物的還原能力Fig. 7 Reducing power of inulin and inulin derivatives at different concentrations

2.3 菊糖及其衍生物的生物相容性

以小鼠成纖維細胞L929為模型，通過CCK-8法測定菊糖及其衍生物的細胞毒性，以評價其生物相容性。從圖8可以看出，在0～125 μg/mL的質量濃度范圍內，沒有觀察到明顯的細胞毒性，但更高的質量濃度（250 μg/mL）會導致細胞存活率輕微下降（下降約10%）。L929細胞形態一般呈特征性紡錘形（圖9A～D），在質量濃度為250 μg/mL時，細胞形態部分改變，可以發現少量溶出物（圖9E），進一步證明了細胞毒性實驗結果。這些結果表明，在質量濃度低于125 μg/mL時，帶有酚基的菊糖衍生物對L929細胞具有良好的生物相容性。這意味著這些菊糖衍生物在不損傷正常細胞的情況下具有較好的抗氧化活性。有研究[33-35]表明，經化學改性制備的酚類殼聚糖衍生物可以作為具有抗氧化功能的食品添加劑及食品包裝材料。本實驗制備的這些菊糖衍生物在具有優良抗氧化活性的同時也有較好的生物相容性，這些實驗數據為酚類菊糖衍生物在食品中的應用奠定了一定的基礎。后期會繼續展開體內抗氧化實驗及體內毒性實驗進一步確定酚類菊糖衍生物的食品安全性。

圖8 菊糖和菊糖衍生物的L929細胞毒性Fig. 8 Cytotoxicity of inulin and inulin derivatives to L929 cells

圖9 經菊糖衍生物化合物3C處理24 h后L929細胞的生長情況Fig. 9 Microscopic images of inulin derivative 3C-treated L929 cells for 24 h

3 結 論

本實驗通過化學修飾在菊糖分子上引入具有高抗氧化活性的酚類基團，合成了6 種酚類菊糖衍生物。通過測定自由基清除能力、還原能力和Fe2＋螯合能力等，研究酚類基團對菊糖抗氧化活性的影響。結果表明，酚基的引入極大地提高了菊糖衍生物的抗氧化活性，且體外細胞實驗結果表明菊糖衍生物具有良好的生物相容性，有望應用于食品和保健品領域。