沿面放電等離子體對蘋果汁中耐高滲酵母的殺滅效果

張文樂，岳田利，周嘉佳，朱 璇，王 英,

（1.新疆農業大學食品科學與藥學學院，新疆 烏魯木齊 830052；2.西北大學食品科學與工程學院，陜西 西安 710069）

蘋果汁貯藏過程中存在的主要問題是酵母生長導致的腐敗，造成了嚴重的經濟損失[1]。其中，耐高滲酵母（Zygosaccharomyces rouxii）因具有能在高濃度糖環境中生長的能力以及對高水平防腐劑（山梨酸鉀、苯甲酸鈉）的抵抗力，成為導致含糖果汁腐敗的主要因素[2]。耐高滲酵母的存在會導致蘋果汁出現多種品質問題：一方面，耐高滲酵母可以在低pH值下生長，會在蘋果汁表面形成菌膜或在底部形成白色沉淀[3]；另一方面，酵母引起的腐敗過程會產生二氧化碳，導致果汁脹包，降低產品的價值[4]。因此，探尋并實現能夠對果汁中耐高滲酵母進行高效、安全控制的方法勢在必行。

工業上常用熱處理來確保食品的微生物安全性[5]，但過度的熱處理可能會產生不良異味，尤其是對于蘋果汁[6]。為了減少高溫過程對食品品質的負面影響，非熱滅菌技術應運而生，其是非常有應用前景的殺菌方式[7]。大氣壓低溫等離子體作為一種新興的非熱滅菌技術，在食品行業中顯示出了巨大的應用潛力[8-9]。研究表明，低溫等離子體可產生活性氧、活性氮和臭氧等高活性物質[10]，這些活性物質使等離子體能夠有效地滅活蘋果[11]、草莓[12]、沙拉葉[13]、肉[14-15]等食品表面的污染微生物（產孢和腐敗/致病微生物）。

然而，由于大氣壓低溫等離子體的穿透能力較低，常用的介質阻擋放電（dielectric-barrier discharge，DBD）等離子體和常壓等離子體射流（atmospheric pressure plasma jet，APPJ）僅適用于食品表面小區域的微生物滅活，難以作用于食品內部[8]。因此，探尋一種能夠大批量、高效率、簡單易行的等離子體處理食品的方法很有必要。沿面放電等離子體反應器可通過氣泡直接將活性物質注入液體中，使活性物質與待處理的液體能夠快速接觸，這將使液體食品中微生物迅速失活[16]。相對DBD等離子體和APPJ而言，沿面放電等離子體具有較高的處理速度和較強的處理能力，已被證明能夠成功降解水中的苯酚[17]。因此，采用沿面放電等離子體處理可能是蘋果汁工業中滅活耐高滲酵母的一種可行方法。

本研究的目的是通過沿面放電等離子體處理蘋果汁，評估蘋果汁中耐高滲酵母的殺滅效果，并研究沿面放電等離子體處理對蘋果汁品質的影響。選擇耐高滲酵母LB作為目標菌株，確定不同的放電電壓、氣體流速等工藝參數對滅活效果的影響。通過掃描電子顯微鏡（scanning electron microscopy，SEM）研究滅活過程中耐高滲酵母的結構變化，分析耐高滲酵母的失活機制和沿面放電等離子體處理對蘋果汁主要的理化指標（pH值、可溶性固形物質量分數（soluble solids content，SSC）、可滴定酸（titratable acid，TA）質量濃度和還原糖質量濃度）及果汁色澤和揮發性化合物的影響，為沿面放電等離子體在蘋果汁工業中的應用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料、菌株與試劑

‘紅富士’（Malus domesticaBorkh. cv. Red Fuji）蘋果，購于陜西楊凌，9月中下旬采摘，大小均一、無機械損傷、無病害或腐爛。

耐高滲酵母菌株Zygosaccharomyces rouxiiLB（B-WHX-12-54）（GenBank登錄號KC544459）分離自陜西蘋果汁。

葡萄糖 國藥集團化學試劑有限公司；瓊脂粉上海源葉生物科技有限公司；蛋白胨 上海中秦化學試劑有限公司；3-辛醇（純度＞98%）標準品 日本東京化成工業株式會社；氯化鈉（分析純） 四川西隴化工有限公司；其他化學試劑均為國產分析純。

1.2 儀器與設備

QP 2010系列GC-MS氣相色譜-質譜聯用儀 日本島津公司；PANTONE X-rite Ci7600色差分析儀 美國愛色麗公司；Nova Nano SEM 450掃描電子顯微鏡 美國FEI公司；雷磁PHS-3C型pH計 上海儀電科學儀器股份有限公司；PAL-1型數顯折光儀 日本ATAGO公司；GTR16-2型高速冷凍離心機 北京時代北利離心機有限公司。

1.3 方法

1.3.1 蘋果汁的制備

將耐高滲酵母菌株轉移到150 mL酵母浸出粉胨葡萄糖瓊脂培養液（yeast extract peptone dextrose medium，YPD）中，在（28.0±0.1）℃下搖床振蕩培養（120～130 r/min）48 h，之后將培養液3 000 r/min離心5 min，除去上清液，用無菌蒸餾水洗滌兩次。然后將所得酵母細胞重懸于無菌蒸餾水中，使最終細胞濃度為107～108CFU/mL。蘋果去皮榨汁并過濾，在冷藏條件下備用。處理時將耐高滲酵母接種到每個蘋果汁樣品中，使每個蘋果汁樣品中耐高滲酵母的細胞濃度約為2×106CFU/mL。

1.3.2 沿面放電等離子體處理

沿面放電等離子體反應器系統示意圖如圖1所示。該系統由交流電源（0～21 kV、50 Hz）、等離子體發生器和處理室組成，與本課題組之前研究所用設備[18]類似，但有所修改。高壓電極（即直徑為1 mm的不銹鋼彈簧）附著在圓柱形石英管的內壁上（內徑12 mm、管壁厚1 mm），處理器內蘋果汁被用作接地電極，沿該石英管的長軸方向進行沿面放電。使用硅膠干燥后的空氣作為載氣，以最大程度地降低加工成本并防止短路。處理過程中氣體由體積流量計控制流量，并通過曝氣器注入蘋果汁中進行處理，處理量為500 mL。

圖1 沿面放電等離子體反應器系統示意圖Fig. 1 Schematic diagram of surface discharge plasma reactor system

固定氣體流速為150 L/h，利用不同峰值放電電壓（11、15、18、21 kV）的沿面放電等離子體處理蘋果汁30 min，研究放電電壓對耐高滲酵母殺滅的效果。固定峰值放電電壓為21 kV，利用不同氣體流速（60、100、150、200、300 L/h）的沿面放電等離子體處理蘋果汁30 min，研究氣體流速對耐高滲酵母殺滅的效果。

1.3.3 微生物計數

在沿面放電等離子體處理前后分別采集果汁樣品，并使用YPD平板在（28.0±0.1）℃下孵育72 h，采用細胞計數法測定微生物數量，所有測定重復3 次。并通過lg（N/N0）（N0是微生物的初始數量/（CFU/mL），N是經沿面放電等離子體處理后的存活微生物數量/（CFU/mL））與處理時間的關系繪制微生物存活曲線。

1.3.4 掃描電子顯微鏡觀察

將樣品在體積分數2.5%戊二醛溶液中固定2 h，在pH 6.8的0.1 mol/L磷酸鹽緩沖液中分別洗滌5、10、15、20、25 min和30 min，然后使用體積分數1%鋨酸溶液固定2 h。再次用磷酸鹽緩沖溶液沖洗，將蓋玻片以體積分數30%、50%、70%、80%和90%的乙醇溶液脫水10 min，最后在100%乙醇中脫水2 次，每次時間10 min。

1.3.5 理化指標的測定

使用pH計測定果汁的pH值，并用折光儀測定果汁中SSC。TA質量濃度參照SB/T 10203—1994《果汁通用試驗方法》進行測定，按式（1）計算。還原糖質量濃度使用3,5-二硝基水楊酸法測定[19]，所有測定重復3 次。

式中：V1為樣品滴定所消耗氫氧化鈉標準溶液體積/mL；V0為蒸餾水代替樣品溶液所消耗氫氧化鈉標準溶液體積/mL；c為氫氧化鈉標準溶液濃度/（mol/L）；m為樣品質量/g；V為吸取樣品的體積/mL；K為果汁中相應酸的換算系數（蘋果酸為0.067）。

1.3.6 色澤參數的測定

顏色是反映新鮮度和品質的指標，會影響消費者的購買決定。使用色差分析儀對蘋果汁色澤進行測定。使用白色校準板進行校準。在白色背景下測定L*值（亮度）、a*值（紅綠度）和b*值（黃藍度），所有測定重復3 次。根據式（2）～（4）分別計算總色差（ΔE*ab）、色相角（h）和色度（C*）[20]。利用ΔL*、Δa*和Δb*值對等離子體處理前后蘋果汁顏色的差異進行定量，其中總色差ΔE*ab表示顏色變化的幅度，色度C*為飽和度指數，色相角h為顏色外觀的參數。

1.3.7 揮發性化合物分析

揮發性化合物的富集：采用頂空固相微萃取的方式富集揮發性化合物。吸取5 mL蘋果汁樣品注入20 mL進樣瓶中，然后將3-辛醇（終質量濃度0.2 μg/L）作為定量內標加入進樣瓶中。添加NaCl（2 g）于進樣瓶，以抑制酶降解并促進揮發物向頂空釋放。首先將進樣瓶在45 ℃下平衡30 min，然后將50/30 μm DVB/CAR/PDMS萃取頭暴露于頂空中30 min以收集分析物[21]。

質譜條件：電子電離源的電子能量為70 eV，進樣器、接口和離子源溫度分別為250、230 ℃和230 ℃，質量掃描范圍m/z為35～500。以氦氣為載氣，不分流進樣流速為1.0 mL/min。溫度程序設置為：40 ℃下保持3 min，以4 ℃/min的速率升至120 ℃，再以6 ℃/min的速率升至260 ℃，并保持9 min。

揮發性物質的定性及定量：參考質譜數據庫（NIST 14和NIST 14s），采用匹配度和保留時間對揮發物進行定性。由于每個測試具有相同質量濃度的3-辛醇（定量內標），可通過式（5）計算每個蘋果汁樣品中香氣物質的質量濃度。

式中：S*為內標的峰面積；S為各成分的峰面積；ρ*為內標質量濃度/（μg/L）。

1.4 數據處理與分析

所有實驗重復進行3 次。采用SPSS軟件進行方差分析和Duncan多重范圍檢測分析數據顯著性差異，以P＜0.05表示數據差異顯著。

2 結果與分析

2.1 放電電壓對耐高滲酵母殺滅的效果

圖2為耐高滲酵母在不同峰值放電電壓（11、15、18、21 kV）沿面放電等離子體處理下的存活曲線。在處理過程中，所有蘋果汁中的酵母細胞的數量都有所降低。放電電壓為11 kV時，經30 min等離子體處理后，耐高滲酵母細胞數量降低了2.27 個對數；在15、18 kV和21 kV的放電電壓下處理30 min，耐高滲酵母細胞數量降低了2.90、3.39 個和5.60 個對數。當放電電壓從11 kV升高到21 kV時，對果汁中耐高滲酵母的殺滅效果增強。這可能是由于所產生的電子在相對高的放電電壓下被較高強度的電場加速，因此具有更高的能量并且可以產生更多的自由基和帶電粒子，從而對微生物殺滅效果更好[21-22]。目前常用的APPJ一般通過噴嘴以點對點的形式處理樣品，適用于處理不均勻的小區域；而對于DBD等離子體處理，電極間距越小，等離子體通道越易形成，因此放電間隙大多為毫米級，適宜處理薄層樣品[9]。對比DBD等離子體，沿面放電等離子體可將蘋果汁的處理量從3 mL[23]提高到500 mL，極大地提升了處理能力。

圖2 在不同放電電壓下耐高滲酵母的存活曲線Fig. 2 Survival curves of Z. rouxii LB under different discharge voltages

2.2 氣體流速對耐高滲酵母殺滅的效果

圖3為不同氣體流速（60、100、150、200、300 L/h）下等離子體處理對蘋果汁中耐高滲酵母的殺滅效果。結果表明，氣體流速60 L/h和150 L/h下處理30 min時，耐高滲酵母細胞數量分別降低了3.28 個和5.59 個對數。當氣體流速從150 L/h提高到300 L/h時，在相同的處理條件下，耐高滲酵母耐高滲酵母細胞數量分別降低了5.59 個和3.80 個對數，殺滅效果降低了32%。使用空氣作為工作氣體時，隨著氣體流速從60 L/h增加到300 L/h，沿面放電等離子體對蘋果汁中的耐高滲酵母的殺滅效果先提升后而降低。這可能是氣體流速的變化導致等離子體中活性物質濃度和種類出現差異，從而影響了耐高滲酵母的滅活效果。Li Qing等在對毛細管射流等離子體的研究中也發現了類似的趨勢，在氣體流速接近7 L/min時獲得射流等離子體的最大強度，進一步增加氣體流速會導致活性物質的強度降低，這可能是氣體“吹脫”效應導致的[24]。

圖3 在不同氣體流速下耐高滲酵母的存活曲線Fig. 3 Survival curves of Z. rouxii LB under different air flow rates

2.3 沿面放電等離子體處理對耐高滲酵母形態和結構的影響

根據上述實驗所得結果，選擇殺滅效果最優的處理條件（電壓21 kV及氣體流速150 L/h）對樣品進行處理，并通過SEM對耐高滲酵母進行觀察，研究等離子體處理對耐高滲酵母形態和結構的影響。處理前的耐高滲酵母細胞（圖4A）顯示出典型的橢圓形狀，具有光滑的表面和連續的細胞壁。沿面放電等離子體處理后，細胞形成孔狀和收縮的形態（圖4B），并且在SEM圖像中可以看到酵母完整的細胞壁被破壞（圖4C），細胞內組分從細胞質中泄漏，導致細胞死亡。上述結果表明蘋果汁中耐高滲酵母的殺滅是通過破壞細胞壁并使細胞內組分泄漏完成的。Xiang Qisen等在使用DBD等離子體處理酵母時也發現，經等離子體處理后細胞表面產生皺縮和穿孔，并伴有細胞內物質的釋放[23]。這可能是由于沿面放電等離子體產生電穿孔、沖擊波和各種活性物質（包括H2O2、O3和·OH等），能夠在耐高滲酵母細胞中引起細胞膜的破裂損傷，從而滅活微生物[22]。

圖4 最優處理條件下蘋果汁中耐高滲酵母的SEM圖像（×50 000）Fig. 4 Scanning electron microscopic images of Z. rouxii LB in apple juice processed under the optimal conditions (× 50 000)

2.4 沿面放電等離子體處理對蘋果汁理化指標的影響

表1顯示了沿面放電等離子體的處理對蘋果汁pH值、TA質量濃度、SSC和還原糖質量濃度的影響。在處理前后，蘋果汁中的SSC、可滴定酸質量濃度和還原糖質量濃度沒有顯著的變化（P＞0.05）。這與用DBD等離子體處理蘋果汁的研究結果[23,25]相似。

表1 沿面放電等離子體處理對蘋果汁理化指標的影響Table1 Physicochemical indexes of apple juice subjected to surface discharge plasma treatment

雖然處理前后蘋果汁的pH值略有增加，但總體pH值保持在3.87～4.00。在用空氣DBD等離子體處理蘋果汁的研究中發現，處理40 s后蘋果汁的pH值略微降低[25]。然而用氬氣和0.1%氧氣等離子體射流處理480 s后，蘋果汁的pH值略有增加[26]。Dasan等使用等離子體射流處理蘋果汁120 s，在處理前后蘋果汁的pH值沒有顯著差異[27]。各研究中pH值的變化不同可能是使用不同的處理設備產生活性物質的數量和種類均有差異所致[25]。

2.5 沿面放電等離子體處理對蘋果汁色澤的影響

表2為沿面放電等離子體處理對蘋果汁的色澤的影響。沿面放電等離子體處理30 min后，蘋果汁的L*值從52.81增加到65.21，表明樣品變澄清。色度C*值從51.54降至37.00，表明蘋果汁顏色變得不飽和。色相角h代表蘋果汁的特征顏色，該參數從61.83°增加到87.10°；根據顏色進行分析，黃色對應90°，紅色對應0°，而等離子體處理后蘋果汁的色相角從紅色值向黃色值移動。盡管色相角h改變，但處理過的果汁顏色仍在蘋果汁的預期顏色范圍內[28]。處理前后蘋果汁a*值和b*值下降，這可能是沿面放電等離子體處理期間由活性物質誘導的有色顏料異構化或氧化反應所致[29]。

表2 沿面放電等離子體處理對蘋果汁顏色的影響Table2 Color indexes of apple juice treated by surface discharge plasma

隨著等離子體處理時間的延長，ΔE*ab顯著增加（P＜0.05）。沿面放電等離子體在21 kV下處理10、20 min和30 min時蘋果汁ΔE*ab分別為16.47、20.95和27.03，與未處理的樣品相比具有明顯的顏色差異。

2.6 沿面放電等離子體處理對蘋果汁揮發性化合物的影響

蘋果汁中的揮發性化合物成分很多，并且由于蘋果的香氣特性，揮發性化合物的鑒定非常復雜。已確定某些揮發性化合物是蘋果汁香氣最重要的組成成分，例如己酸丁酯、乙酸乙酯、丁酸乙酯、丁酸甲酯、乙酸己酯、1-己醛[30]。除了氣味活性值較高的化合物外，其他氣味活性值較低的化合物，例如乙醛、2-甲基-1-丁醇和1-己醇也起著重要作用[30]。

表3比較了處理前后樣品中主要揮發性化合物的質量濃度，以確定沿面放電等離子體處理對蘋果汁香氣的影響。與未經處理的樣品相比，處理后蘋果汁中的大部分醇、酯、醛和酮的質量濃度無統計學差異（P＞0.05）。在醇類化合物中，除辛醇外，乙醇、2-甲基-1-丙醇、2-甲基-1-丁醇等作為蘋果汁風味的重要組成部分，經過沿面放電等離子處理后質量濃度沒有顯著變化。在酯類物質中，除了乙酸乙酯和1-丁醇-3-甲基-乙酸酯質量濃度變化較明顯外，幾乎所有的揮發性化合物都保留了下來。

表3 沿面放電等離子體處理對蘋果汁揮發性化合物的影響Table3 Volatile compounds of apple juice treated by surface discharge plasma

3 結 論

本研究采用沿面放電等離子體對蘋果汁中耐高滲酵母進行殺滅。結果表明，沿面放電等離子體以21 kV的放電電壓和150 L/h的氣體流速處理500 mL蘋果汁30 min會導致蘋果汁中耐高滲酵母細胞數量減少5.60 個對數。SEM顯示沿面放電等離子體處理過程中耐高滲酵母細胞結構受損，這可能是蘋果汁中微生物被滅活的直接原因。沿面放電等離子體處理后，蘋果汁的pH值僅略微增加，而SSC、可滴定酸質量濃度和還原糖質量濃度并沒有顯著變化（P＞0.05）。沿面放電等離子體處理會導致蘋果汁的顏色發生顯著變化，使L*值和ΔE*ab增加，令蘋果汁變得更黃更澄清。此外，蘋果汁中揮發性化合物的主要成分質量濃度沒有發生顯著變化（P＞0.05）。綜上，沿面放電等離子體可以有效的殺滅蘋果汁中的耐高滲酵母，并能保持蘋果汁的理化指標和香氣。本研究對沿面放電等離子體滅活蘋果汁中耐高滲酵母的應用進行了初探，發現不同的基質會導致不同的滅活效果，故在濃縮蘋果汁及其他液體食品的處理中需要進一步研究以優化處理條件，并評估沿面放電等離子體處理對食品基質中VC和其他營養成分的影響，以獲得最佳的工業應用效果。