三氯乙醇和三氯乙酸在誘發三氯乙烯藥疹樣皮炎中的作用

伊夢楠，臧丹，2，易娟，劉帥，周偉，王俊程，沈美麗，王婷，段化偉，黃先青，戴宇飛

1.中國疾病預防控制中心，職業衛生與中毒控制所/化學污染物與健康重點實驗室，北京 100050

2.北京市豐臺區市場監督管理局，北京 100050

3.深圳市職業病防治院，廣東 深圳 510000

三氯乙烯是一種無色易揮發的有機溶劑，具有良好的去污、脫脂能力，主要用于去除金屬部件的雜質以及織物清潔和染色等各種工藝中。鑒于其溶劑特性，三氯乙烯可以通過吸入和皮膚接觸進入人體［1］。流行病學調查顯示職業暴露于三氯乙烯是導致職業性三氯乙烯藥疹樣皮炎（trichloroethylene-induced hypersensitive dermatitis，TIHD）發生的直接原因［2］，職業性三氯乙烯暴露后2 周至2 個月出現四肢、面部、頸部或軀干皮疹，伴有不同程度的發燒、淋巴結腫大等［3］。機體暴露于三氯乙烯后，三氯乙烯經由肝臟細胞色素P450氧化代謝等通路生成的代謝產物為三氯乙醛和水合氯醛，后經由醇脫氫酶和醛脫氫酶催化生成三氯乙醇和三氯乙酸［4］；而水合氯醛在機體內能夠被乙醇脫氫酶迅速代謝為三氯乙酸和三氯乙醇，導致水合氯醛在血液和尿液中含量均較低。研究證實三氯乙醇是機體內三氯乙烯和水合氯醛的主要代謝產物［5］；三氯乙酸也被認為是引起肝損傷的三氯乙烯主要代謝產物［4］。目前國內外針對三氯乙烯代謝產物三氯乙酸和三氯乙醇是否參與TIHD的發病過程存在爭議［5］，因此本研究擬分為兩部分，第一部分為體外細胞實驗：受試物為三氯乙酸和三氯乙醇，體外實驗選取人髓系白血病單核細胞株（THP-1），檢測三氯乙烯代謝產物對炎癥因子白細胞介素-8（interleukin-8，IL-8）和一氧化氮（nitric oxide，NO）合成過程中重要的限速酶誘導型一氧化氮合酶（inducible nitric oxide synthase，iNOS）的影響。第二部分為人群研究：檢測三氯乙酸和三氯乙醇對TIHD患者外周血單個核細胞增殖能力的影響，從代謝角度解析三氯乙烯誘發致敏反應起始階段的關鍵分子。

1 對象與方法

1.1 主要試劑及儀器

三氯乙酸、三氯乙醇、DMSO（Sigma，美國）；RPMI 1640培養基、胎牛血清、青霉素-鏈霉素（Gibco，美國）；兔抗人 iNOS 多克隆抗體（Abcam，英國）；山羊抗兔抗體（北京中杉金橋試劑，中國）；高效化學發光試劑盒（Santa Cruz，美國）；DC 蛋白測定試劑盒、酶標儀（Bio-Rad，美國）；異丙醇、甲醇、電泳液、電轉液等試劑均為國產試劑。

1.2 體外細胞實驗

1.2.1 細胞培養THP-1細胞株購買于中國醫學科學院基礎醫學院細胞中心。配制含有10%～15%（體積分數，后均相同）胎牛血清和1%青霉素-鏈霉素的完全培養基，于37℃、5% CO2培養箱中培養THP-1 細胞，每隔24 h 觀察細胞形態。待細胞數量達到顯微鏡視野下80%左右時，進行細胞傳代。

1.2.2 THP-1 細胞存活率的檢測用CCK-8 法檢測各處理組中細胞相對存活率。調整THP-1 細胞密度為2×105個·mL-1，將2×104個THP-1 細胞接種于96 孔板內，并設置至少3 個平行孔，設置空白組、對照組及染毒組，于37℃、5% CO2培養箱中培養44 h。每孔加入10 μL CCK-8，繼續培養4 h。設置酶標儀波長為450 nm檢測每孔光密度（D）值，按照公式：細胞相對存活率=（D染毒組-D空白組）/（D對照組-D空白組）×100%，計算不同濃度三氯乙酸和三氯乙醇對細胞存活率的影響。

1.2.3 THP-1 細胞IL-8 表達的檢測用完全培養基調整細胞密度為5×105個·mL-1，取2 mL 細胞懸液接種于6 孔板中；根據文獻［6］報道和細胞對化學物的敏感性設置三氯乙酸和三氯乙醇的染毒劑量均為：0、0.5、1.0、2.0、4.0 mmol·L-1，各濃度組均設置3 個平行孔，培養48 h 后，分離細胞上清和細胞。利用細胞上清液檢測IL-8 表達水平，利用細胞提取全蛋白進行Western blotting檢測。

1.2.4 THP-1 細胞內iNOS 表達的檢測每個染毒處理組細胞用2 mL PBS 清洗3 遍后，加入250 μL 的RIPA裂解液，渦旋混勻，冰上充分裂解2 h，14 000×g離心15 min 后取上清為全蛋白。每組蛋白定量吸取35 μg，并與5×上樣緩沖液按照4∶1 的比例混勻，配制上樣體系體積為20 μL，100℃水浴加熱10 min。配制10%的凝膠，加入5 μL 的蛋白marker 和10 μL 的各處理組蛋白，60 V 電泳1 h 后轉為90～110 V 繼續電泳1～2 h；250 mA轉膜2.5 h。轉膜完成后，PVDF膜浸泡于10～15 mL 1×TBST 中搖床漂洗10 min×3 次；用5%脫脂奶粉溶液浸泡PVDF 膜，室溫封閉1 h；稀釋比為1∶500的iNOS抗體4℃冰箱孵育過夜或超過12 h。漂洗PVDF 膜10 min×3 次。以1∶5 000 比例稀釋二抗，室溫孵育1 h后，水平搖床漂洗PVDF 膜10 min×3 次。加入化學發光試劑曝光后，以β-actin為內參，采用Image pro plus 6.0軟件進行灰度分析。

1.3 TIHD患者研究

1.3.1 研究對象選擇標準研究對象共57人，分為4組。非接觸對照組：20人，選擇深圳職業病防治院體檢科上崗前健康體檢結果處于正常范圍的職業工人，均未接觸過三氯乙烯，排除職業性有機溶劑接觸史及藥物食物過敏史；接觸對照組：20人，選擇與病例同車間同工種接觸三氯乙烯但未發病的健康工人，排除藥物食物過敏史；病例組：共17 人，選擇2008—2010年在深圳市職業病防治院進行治療的TIHD 患者，均為按照GBZ 185—2006《職業性三氯乙烯藥疹樣皮炎診斷標準》臨床確診的病例，有明確三氯乙烯接觸史，接觸時間不超過3 個月，平均約30 d，排除其他藥物食物過敏史，發病前2 周均無藥物服用史；其中10 人正在接受治療，為入院病例組，另7人激素用量減至每天2 mg或停用，血常規和肝功能檢查未發現異常，身體各項機能均基本恢復，為出院病例組。所有研究對象經過詳細的人口學調查以及職業病接觸史、既往疾病史、家族遺傳病史等資料收集，均排除糖尿病、哮喘、過敏性皮炎、系統性紅斑狼瘡、類風濕關節炎、特應性皮炎、遺傳性過敏性疾病等免疫系統相關疾病以及其他類似的職業有害因素接觸史和藥物食物過敏史。本研究已經中國疾病預防控制中心職業衛生與中毒控制所醫學倫理委員會審查批準（批準號：無）。

1.3.2 研究對象外周血單個核細胞存活率的測定采集所有被納入人員晨起空腹肘靜脈血5 mL，1∶1 加入淋巴細胞分離液，800×g離心20 min 后，小心吸取淋巴細胞層，加入2 倍體積的PBS 混勻，300×g離心10 min 后，收集沉淀即為外周血單個核細胞，用含有10%胎牛血清和1%雙抗的完全培養液稀釋細胞，調節各組細胞濃度為1×106個·mL-1接種于96 孔板，加入0.5 mmol·L-1和2 mmol·L-1的三氯乙酸和三氯乙醇后，置于37℃、5% CO2培養箱中培養44 h，檢測細胞存活率，方法同“1.2.2”。

1.4 統計學分析

IL-8 數據不符合正態分布和方差齊性，采用完全隨機化設計的多組獨立樣本的秩和檢驗（Kruskal-Wallis 法）進行比較，數據采用M（Min，Max）表示。其他符合正態分布和方差齊性的指標，采用方差分析比較，組間比較采用LSD 法，數據采用±s表示。所有統計檢驗均為雙側檢驗，檢驗水準α=0.05。

2 結果

2.1 THP-1細胞實驗結果

2.1.1 THP-1 細胞相對存活率和IL-8 的表達水平與對照組相比，0.5 mmol·L-1三氯乙酸和三氯乙醇組細胞存活率略有增加，但差異無統計學意義（P＞0.05）；1.0 mmol·L-1及以上劑量組，隨著三氯乙酸和三氯乙醇濃度的增加，細胞存活率逐漸降低；IL-8 表達水平逐漸增多，表現為劑量依賴性（均P＜0.05）。見表1。

表1 不同濃度三氯乙酸和三氯乙醇對細胞存活率和IL-8的影響（n=3）Table 1 Effects of different concentrations of trichloroacetic acid and trichloroethanol on cell survival rates and IL-8 (n=3)

2.1.2 THP-1 細胞iNOS 的表達水平與對照組相比，0.5 mmol·L-1三氯乙酸和三氯乙醇組iNOS 表達量差異無統計學意義（P＞0.05）；隨著染毒濃度增高，1.0、2.0、4.0 mmol·L-1三氯乙酸組iNOS 的表達水平分別增高93.73%、87.08%、238.06%（P＜0.05），1.0、2.0、4.0 mmol·L-1三氯乙醇組iNOS 的表達水平分別增高95.99%、486.29%、735.72%（P＜0.05）；但1.0 mmol·L-1和2.0 mmol·L-1三氯乙酸兩個處理組之間iNOS 表達水平差異無統計學意義 （P＞0.05）。見圖1。

圖1 不同濃度受試物對THP-1 細胞iNOS表達水平的影響Figure 1 Effects of different concentrations of trichloroacetic acid and trichloroethanol on iNOS expression in THP-1 cells

2.2 職業接觸人群的研究結果

2.2.1 研究對象一般情況各組研究對象基本情況見表2。其中，非接觸對照組均無三氯乙烯接觸史，接觸對照組平均接觸工齡為（466.09±280.65）d，入院病例組和出院病例組的平均接觸工齡分別為（32.00±19.81）、（29.17±10.82）d。

表2 2008—2010年深圳市職業病防治院研究對象基本資料Table 2 General information of participants from Shenzhen Preventive and Treatment Center for Occupational Diseases in 2008—2010

2.2.2 研究對象外周血單個核細胞增殖能力的變化各組人群外周血單個核細胞在加入不同濃度三氯乙酸和三氯乙醇處理后，與未染毒細胞相比，各組細胞存活率均降低（P＜0.05）。與非接觸對照組相比，0.5、2.0 mmol·L-1三氯乙酸處理細胞后，出院病例組細胞存活率分別增加5.81%和5.64%（P＜0.05）；而接觸對照組、入院病例組的細胞存活率差異無統計學意義（P＞0.05）。4 組人群外周血單個核細胞經0.5、2.0 mmol·L-1三氯乙醇處理后的細胞存活率差異無統計學意義（P＞0.05）。見表3。

表3 不同濃度三氯乙酸和三氯乙醇對外周血單個核細胞存活率的影響（±s）Table 3 Effects of different concentrations of trichloroacetic acid and trichloroethanol on survival rate of peripheral blood mononuclear cells (±s)單位（Unit）：%

表3 不同濃度三氯乙酸和三氯乙醇對外周血單個核細胞存活率的影響（±s）Table 3 Effects of different concentrations of trichloroacetic acid and trichloroethanol on survival rate of peripheral blood mononuclear cells (±s)單位（Unit）：%

［注］*：與未染毒對照相比，P＜0.05；a：與非接觸對照組相比，P=0.012；b：與非接觸對照組相比，P=0.007。［Note］*:Compared with the control group,P＜0.05;a:Compared with the non-exposure control group,P=0.012;b:Compared with the non-exposure control group,P=0.007.

三氯乙酸（Trichloroacetic acid） 三氯乙醇（Trichloroethanol）0.5 mmol·L-1 2.0 mmol·L-1 0.5 mmol·L-1 2.0 mmol·L-1非接觸對照組（Non-exposure control group） 20 100.00±0.00 83.13±6.19* 71.67±4.97* 85.47±5.32* 73.53±5.94*接觸對照組（Exposure group） 20 100.00±0.00 83.22±3.74* 73.18±3.61* 85.26±4.43* 75.80±5.94*入院病例組（Admitted group） 10 100.00±0.00 82.17±4.60* 69.56±4.42* 84.35±6.23* 74.98±5.81*出院病例組（Discharged group） 7 100.00±0.00 88.94±5.50*a 77.31±6.05*b 86.97±3.03* 77.39±5.86*F——2.937 4.315 0.386 0.914 P——0.042 0.009 0.764 0.440組別（Group） 例數（Number） 未染毒對照（Control）

3 討論

大量研究表明，職業接觸三氯乙烯是引起TIHD發生的直接原因［3］。根據三氯乙烯引起的超敏反應的特征及發病機制，將其劃分為IV 型超敏反應即遲發型超敏反應，該反應是由效應T 淋巴細胞與抗原作用后引起單個核細胞浸潤和組織損傷，并且伴有嚴重的炎癥反應［6］。由于三氯乙烯進入機體后產生多種代謝產物例如水合氯醛、三氯乙酸、三氯乙醇等，因此三氯乙烯是否需經過代謝以后才具體致敏作用一直存在爭議，有研究指出三氯乙烯及其代謝產物三氯乙酸和三氯乙醇可能均是引起TIHD 的致敏原［7-8］。本次研究結果表明：三氯乙酸在TIHD 發病過程中，發揮其致敏能力；但三氯乙醇是否在TIHD 發病過程中發揮其致敏能力尚無證據。

多數具有致敏性的化學物能夠促進THP-1 細胞分泌細胞因子，例如IL-8、IL-1β、腫瘤壞死因子-α 等，因而THP-1 細胞株被廣泛應用于驗證、檢測小分子化學物的致敏性［9］，并且在致敏性化學物的作用下THP-1細胞IL-8 的表達水平增加，因此IL-8 被認為是THP-1細胞體外驗證化學物致敏能力的重要篩查指標［9-10］。此外，機體在致敏原的誘導下可以促進iNOS 的表達，在iNOS 的催化作用下促進機體內釋放大量的NO，參與炎癥過程，對機體造成損傷［10-11］。iNOS 作為NO 合成過程中重要的限速酶，影響NO 的產生，在一定程度上同樣可以作為化學物致敏能力的篩查指標。本研究結果表明：隨著三氯乙酸、三氯乙醇濃度增加，IL-8 表達水平增加，并且THP-1 細胞iNOS 表達水平增加，該趨勢與IL-8 變化趨勢一致（P＜0.05）。上述體外實驗結果初步證明了三氯乙酸和三氯乙醇均具有致敏能力。

三氯乙烯致敏主要包括兩個過程：誘導過程和激發過程［12］。誘導過程中，化學物或其活性代謝物與內源性肽相互作用形成復合物，即形成具有免疫原性的完全抗原。完全抗原在機體內能夠被抗原呈遞細胞識別加工，進而促進T 淋巴細胞的增殖分化，使得機體內記憶T 淋巴細胞大量增加；激發過程中，當機體再次接觸相同的抗原時，記憶T 淋巴細胞活化為效應T 淋巴細胞，引起機體免疫應答［13-14］。目前，利用抗原特異性T 淋巴細胞特點檢測外源性化學物具有免疫原性的方法包括淋巴細胞轉化實驗和皮膚斑貼實驗［15］。為驗證三氯乙酸和三氯乙醇是否在TIHD 過程中發揮其致敏作用，本研究采取淋巴細胞轉化實驗檢測三氯乙酸和三氯乙醇對三氯乙烯職業暴露人群和非暴露人群外周血T 淋巴細胞的增殖能力的影響。結果發現：相對于非接觸對照組，出院病例組，分離其外周血單個核細胞與三氯乙酸共培養，細胞存活率上升，提示患者體內可能存在三氯乙酸抗原特異性的T淋巴細胞，當這類細胞再次接觸特異性半抗原三氯乙酸時，T 細胞發生增殖；而入院治療組細胞存活率無明顯變化，可能是因為患者入院后，治療TIHD 的藥物（如糖皮質激素）對機體的免疫應答具有一定的抑制作用；當患者出院后激素停用，藥物對機體的免疫抑制作用減弱，因此特異性抗原的促增殖效應能夠被檢測出來。

此外，Huang等［16］采用皮膚斑貼試驗對致敏原進行了檢測，發現19例TIHD康復病例中，對0.05%、0.5%和5.0%三氯乙醇斑貼呈陽性的比率分別為52.6%、73.7%、89.5%；5.0%三氯乙酸陽性率為47.4%，0.5%三氯乙酸斑貼試驗均為陰性；Watanabe 等［5］發現三氯乙醇、三氯乙酸均能引起TIHD 患者皮膚斑貼試驗陽性。結合本研究的淋巴細胞轉化實驗和文獻報道的斑貼試驗結果，可以認為三氯乙酸是參與TIHD 的發病過程的致敏原之一；而本研究結果尚無法確定三氯乙醇是否參與TIHD 的發病。導致研究結果差異性的原因可能是由于淋巴細胞轉化實驗所使用的淋巴細胞與斑貼試驗中皮膚角質細胞的敏感性差異、受試物濃度差異等多種因素引起。為進一步驗證試驗結果的準確性，后續需擴大樣本量，增設化學物的干預劑量和干預時間，進一步驗證三氯乙醇、三氯乙酸以及其他代謝產物在TIHD 發病過程中的作用。