駱駝乳清蛋白對熱應激大鼠肝臟炎癥及高遷移率族蛋白B1/Toll樣受體4/核轉錄因子-κB信號通路的調節

烏恩吉雅 杜冬華,2 馬雪妮 哈斯蘇榮,3*

(1.內蒙古農業大學獸醫學院，農業農村部動物疾病臨床診療技術重點實驗室，呼和浩特 010018；2.河北北方學院動物科技學院，張家口 075131；3.內蒙古駱駝研究院，阿拉善 750300)

熱應激(heat stress, HS)是熱帶地區及高溫季節最嚴重的應激源之一，現已成為危害全世界動物生產的重要因素，亦對動物福利造成了重大影響[1]。持續暴露于高溫環境會導致動物各種應激反應，如體核溫度升高、采食量減少、營養物質消化率和代謝改變等，進而增加對各種疾病的易感性[2]。當HS引起的體溫升高和代謝過度時，活性氧(reactive oxygen species, ROS)的產生就會增加，進而激活炎癥信號通路并誘導炎癥細胞因子的分泌和激活凋亡[3]。此外，肝臟損傷是HS病例中最致命的并發癥，也是導致患病動物死亡的直接原因[4]。因此，抑制炎癥反應對于預防HS所致肝臟損傷并保護機體健康至關重要。

Toll樣受體(Toll-like receptor，TLRs)家族成員是天然免疫和獲得性免疫反應之間的主要聯系，其中Toll樣受體4(TLR4)可通過識別外源性或內源性配體介導免疫細胞活化、炎癥細胞因子釋放和組織損傷所需的主要受體[5]。高遷移率族蛋白1(high-mobility group box 1, HMGB1)屬于HMG家族成員，是一種非組蛋白結合蛋白，在介導晚期炎癥反應中發揮著關鍵作用[6]。在生理條件下，HMGB1位于細胞核與DNA結合，以穩定染色體結構，并調節轉錄和翻譯。然而，在病理條件下，如發生肝臟損傷、細胞損傷及壞死時，可誘導HMGB1從細胞核移位到細胞外間隙激活核轉錄因子-κB(nuclear factor kappa-B，NF-κB)信號通路，通過誘導細胞因子釋放和白細胞募集維持炎癥微環境，最終引起組織損傷[6-9]。最近，Geng等[4]進一步證實HMGB1是TLR4的上游信號分子，腹腔注射HMGB1抗體可通過TLR4信號通路抑制HS誘導的大鼠肝臟炎癥反應，從而緩解肝臟損傷。因此，靶向HMGB1/TLR4/NF-κB信號通路可能是預防HS所致肝臟炎癥的有效途徑。

駱駝乳清蛋白(camel whey protein, CWP)由α-乳白蛋白(α-LA)、乳鐵蛋白(LF)、血清白蛋白(SA)、乳過氧化物酶(LPO)等組成，但缺乏易引起幼齡動物過敏反應的β-乳球蛋白(β-LG)[10]。據報道，駱駝乳清蛋白3(CWP3)可通過抑制促炎細胞因子分泌來促進糖尿病小鼠皮膚傷口的愈合，且其治療效果優于牛乳[11-12]。膳食補充CWP亦可抑制NF-κB信號通路的激活，從而抑制HS小鼠淋巴細胞分泌促炎細胞因子[2]。本課題組前期在體外試驗中也證實，經過模擬胃腸消化的CWP可通緩解氧化應激而抑制NF-κB信號通路，降低HS誘導的大鼠肝細胞炎癥反應、凋亡和損傷[13]。上述研究提示，CWP在調節HS誘導的肝臟炎癥反應方面具有潛在的獨特作用。然而，迄今為止，CWP在動物模型中對HS所致肝臟炎癥作用及機制的研究尚未見報道，對HMGB1/TLR4/NF-κB信號通路的調節作用亦有待探索。因此，本研究在前期研究的基礎上，探討了CWP對HS所致大鼠肝臟炎癥的保護作用，并進一步探討了CWP對炎癥相關信號轉導途徑的影響。

1 材料與方法

1.1 藥品和試劑

CWP由本實驗室按先前報道的方法制備并保存[13]；大鼠腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、白細胞介素-1β(IL-1β)、白細胞介素-6(IL-6)、白細胞介素-8(IL-8)和白細胞介素-10(IL-10)含量酶聯免疫吸附試驗(ELISA)檢測試劑盒購于廈門侖昌碩生物科技有限公司；Western及IP細胞裂解液購于上海碧云天生物技術公司；兔抗HMGB1抗體(貨號：ab18256)、兔抗TLR4抗體(貨號：ab217274)、兔抗β-actin抗體(貨號：ab8227)購于艾博抗(上海)貿易有限公司；兔抗磷酸化核轉錄因子κB p65 (p-NF-κB p65)抗體(貨號：3033)購于Cell Signaling Technology (CST)公司；辣根過氧化物酶(HRP)標記羊抗兔免疫球蛋白G(IgG)二抗購于天津三箭生物技術有限公司；乙二胺四乙酸(EDTA)抗原修復液(pH 8.0)、3，3-二氨基聯苯胺四鹽酸鹽(DAB)顯色試劑盒購于北京索萊寶生物科技有限公司；底物化學發光(ECL)化學發光檢測試劑盒購于蘇州宇恒生物科技有限公司；蛋白酶抑制劑、蛋白定量用Pierce BCA Protein Assay Kit購于賽默飛世爾科技(中國)有限公司；大鼠維持飼料購于某生物技術有限公司。

1.2 試驗設計

6周齡SPF級雄性SD大鼠適應性飼養2周后隨機分為6組：HS致肝臟損傷組(HS組)、CWP低劑量干預組(L組)、CWP中劑量干預組(M組)、CWP高劑量干預組(H組)、正常對照組(Control組)和CWP對照組(CWP組)。每組設置5個重復，每個重復6只，試驗期22 d。L、M和H組大鼠每天灌服CWP(CWP溶于1 mL生理鹽水，劑量分別為100、200和400 mg/kg BW)，Control和HS組每天灌服1 mL生理鹽水，CWP組每天灌服400 mg/kg BW的CWP，連續2周；之后，按本實驗室先前建立的方法進行HS處理：除Control和CWP組外，其他各組大鼠于人工氣候箱[溫度為(40.0±0.2) ℃，相對濕度為60%～65%]內進行HS處理2 h(10:00—12:00)，連續處理8 d。每次HS處理結束后，立即將大鼠移出人工氣候箱并于初始環境飼養24 h。HS處理期間，于每次HS前1 h灌服上述劑量CWP或生理鹽水。

1.3 免疫印跡(Western blotting)檢測HS大鼠肝臟HMGB1、TLR4及p-NF-κB p65蛋白表達

取大鼠肝臟組織，用Western及IP細胞裂解液提取細胞總蛋白，按常規方法進行變性聚丙烯酰胺凝膠(SDS-PAGE)電泳后將蛋白轉移至聚偏二氟乙烯(PVDF)膜。將PVDF膜用QuickBlockTMWestern封閉液室溫封閉1 h后于稀釋的HMGB1(1∶2 000)、TLR4(1∶1 000)、NF-κB p65(1∶1 000)、p-NF-κB p65(1∶1 000)及β-肌動蛋白(β-actin)(1∶10 000)抗體4 ℃孵育過夜。蛋白表達水平通過Quantity One ChemiDocXRS圖像采集系統及Image-Pro Plus軟件進行分析，結果用HMGB1、TLR4、p-NF-κB p65光密度值/β-actin光密度值表示。剩余大鼠肝臟組織分為2部分，一部分固定于4%多聚甲醛，另一部分于液氮冷凍后置-80 ℃保存，備用。

1.4 免疫組織化學法檢測HS大鼠肝臟HMGB1、TLR4及p-NF-κB p65蛋白表達

4%多聚甲醛固定后的組織塊經石蠟包埋并制成4 μm切片，每只大鼠制備3張連續切片，按免疫組化試劑盒說明書操作檢測HMGB1、TLR4及p-NF-κB p65蛋白表達水平及細胞內定位。每張切片于400×顯微鏡下隨機選擇10個視野，結果分析采用積分綜合計量法。利用Image J軟件的IHC Profiler插件對染色強度進行自動評分：0(陰性)、1(弱陽性)、2(中度陽性)和3(強陽性)。此外，根據陽性細胞百分比進行計分：0(<5%)、1(5%～25%)、2(25%～50%)、3(50%～75%)和4(>75%)。然后，按文獻[14]描述方法計算，免疫組化評分=陽性細胞數百分比分值×染色強度分數。

1.5 ELISA檢測HS大鼠肝臟炎癥細胞因子含量

取1.3中凍存的大鼠肝臟組織，按試劑盒說明說操作檢測大鼠肝臟組織勻漿中TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-8和IL-10含量。

1.6 數據統計分析

所有試驗數據均以平均值±標準誤表示，用SPSS 25.0軟件的單因素方差分析(one-way ANOVA)和LSD法進行組間比較，結果以P<0.05表示差異顯著，P<0.01表示差異極顯著，P<0.001表示差異極其顯著。

2 結果與分析

2.1 Western blotting法分析CWP干預對HS大鼠肝臟HMGB1/TLR4/NF-κB信號通路的影響

如圖1所示，HMGB1/TLR4/NF-κB信號通路參與了HS所致大鼠肝臟損傷過程中的炎癥級聯反應調控。結果表明，HS大鼠肝臟中TLR4和p-NF-κB p65蛋白表達水平極其顯著上調(P<0.001)，相比于Control組分別上調了8.50和10.17倍，但HMGB1蛋白表達水平未發生顯著變化(P>0.05)。CWP(200、400 mg/kg)可極顯著和極其顯著抑制p-NF-κB p65(P<0.01)和TLR4(P<0.001)蛋白表達水平。然而，100、200、400 mg/kg CWP同樣沒有顯著影響HMGB1蛋白表達水平(P>0.05)。

2.2 免疫組織化學法分析CWP干預對HS大鼠肝臟HMGB1、TLR4及p-NF-κB p65蛋白表達的影響

如圖2所示，免疫組化結果與2.1描述一致，不同的是，雖然HS對HMGB1蛋白表達水平無顯著影響(P>0.05)，但可使肝細胞核中HMGB1蛋白表達水平降低(圖2-A，如紅色箭頭所示)，胞漿中表達水平升高(圖2-A，如黑色箭頭所示)。有趣的是，雖然CWP對HMGB1蛋白免疫組化評分亦無顯著影響(P>0.05，圖2-B)，但CWP可逆轉HMGB1蛋白的核轉位現象，且400 mg/kg CWP幾乎完全恢復了HMGB1蛋白的細胞核定位(圖2-A)。CWP(400 mg/kg)可極顯著抑制TLR4蛋白表達(P<0.01，圖2-C和圖2-D)。此外，免疫組化評分結果顯示，400 mg/kg CWP亦極其顯著地恢復了p-NF-κB p65蛋白的胞漿表達(P<0.001)，表明CWP可抑制其核轉位(圖2-D和圖2-E，如綠色箭頭所示)。這些結果進一步證實，CWP對HS大鼠肝臟HMGB1/TLR4/NF-κB信號通路具有調控作用，綜合分析，400 mg/kg劑量效果較好。

2.3 CWP干預對HS大鼠肝臟炎癥細胞因子含量的影響

炎癥反應是介導HS所致肝臟損傷的主要因素之一。因此，本研究采用ELISA方法檢測了各組大鼠肝臟TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-8和IL-10含量，以確定HS前灌服CWP是否可抑制肝臟損傷過程中的炎癥反應。由表1可見，HS組大鼠肝臟TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-8含量均顯著升高(P<0.05)，而IL-10含量顯著降低(P<0.05)。HS前灌服400 mg/kg CWP可顯著降低TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-8含量(P<0.05)，顯著提高IL-10含量(P<0.05)。此外，CWP表現出使正常大鼠肝臟中上述細胞因子含量升高趨勢，但與Control組相比差異不顯著(P>0.05)。

HMGB1：高遷移率族蛋白B1 hepatic high mobility group protein B1； TLR4 ：Toll樣受體4 Toll like receptor; 4p-NF-κB p65: 磷酸化核轉錄因子κB p65 phosphorylated nuclear factor-κB;β-actin:β-肌動蛋白。Control: 正常對照組 control group; CWP: 駱駝乳清蛋白組 CWP group; HS: 熱應激致肝臟損傷組 HS group; L: 駱駝乳清蛋白低劑量干預組 L group; M: 駱駝乳清蛋白中劑量干預組 M group; H: 駱駝乳清蛋白高劑量干預組 H group。*表示差異顯著(P<0.05)，**表示差異極顯著(P<0.01)，***表示差異極其顯著(P<0.001) * indicates significant difference (P<0.05), ** indicates highly significant difference (P<0.01), *** indicates extremely significant difference (P<0.001)。下圖同 the same as below.

3 討 論

HS已在全球范圍內嚴重影響了動物健康和生產，其實質是動物機體產生的熱量超過了其將熱量散發到周圍環境的能力。發生HS的動物會傾向于通過減少采食量來減少產熱，由此對生長性能產生負面影響[1,4,15]。越來越多的證據表明，肝臟損傷是幾乎所有HS病例中最常見且致命的并發癥[16-18]。此外，盡管HS是由高溫引起的，但即使恢復HS動物模型體溫也不能阻止炎癥反應，進而使肝臟損傷在HS恢復過程中才逐漸顯現[19]。因此，HS所致肝臟損傷可能不是高溫作用的直接結果，而是由后期持續的炎癥反應所介導的[19]。已有研究證實，CWP具有顯著的抗炎作用[11-12,20]，且其水解產物具有抗肝癌細胞(HepG2)炎癥反應活性[21]，表明其具有抗HS致肝臟損傷潛能。另據報道，糖尿病小鼠補充CWP可通過抑制促炎細胞因子分泌來促進組織修復，從而加速皮膚傷口的愈合[11-12]。本課題組前期試驗亦表明，CWP可通過抑制炎癥信號通路緩解HS所致大鼠肝臟細胞損傷及凋亡，進一步證實了CWP抗HS致肝臟損傷的潛在醫用價值，但其抗炎機制有待深入研究[13]。因此，本研究探討了CWP對HS大鼠肝臟炎癥的作用及可能機制。

圖A和圖B：用免疫組化法分析HMGB1蛋白表達；圖C和圖D：用免疫組化法分析TLR4蛋白表達；圖E和圖F：用免疫組化法分析p-NF-κB p65蛋白表達。黑色箭頭：目的蛋白在胞漿中表達增多；紅色箭頭：目的蛋白在胞核中表達降低；綠色箭頭：目的蛋白在胞核中表達升高。

最近的研究表明，在無菌性感染相關的炎癥反應中，HMGB1是一種重要的炎癥介質。在生理條件下，HMGB1位于細胞核并與DNA結合，以穩定染色體結構、調節轉錄和翻譯。然而，在病理條件下，如肝細胞損傷及壞死時，可誘導HMGB1從細胞核移位到細胞外間隙激活NF-κB信號通路，從而促進炎癥細胞因子分泌[6-7]。另一項研究亦證實，當肝臟損傷發生時，HMGB1蛋白可被誘導表達并通過受損細胞被動釋放至細胞外，或者從激活的免疫細胞中主動分泌[9]。被釋放至胞外的HMGB1可通過TLR4激活NF-κB信號通路，誘導促炎細胞因子分泌，從而促進炎癥發展[22]。因此，HMGB1/TLR4/NF-κB軸在介導各種應激因素誘發的炎癥反應中發揮著重要作用。Yin等[23]研究顯示，通過調節HMGB1/TLR4/NF-κB信號通路可改善炎癥所致小鼠肝臟損傷。本研究發現，HS大鼠肝臟中TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-8含量均顯著升高，IL-10含量顯著降低。相應地，HS大鼠肝臟中TLR4和p-NF-κB p65蛋白表達水平均高于正常對照組，HMGB1胞外表達量亦明顯增多。這些數據提示，HS大鼠肝臟發生了炎癥反應。有趣的是，HS前灌服CWP可以劑量依賴性方式逆轉TLR4和p-NF-κB p65蛋白表達的改變，伴隨著肝臟IL-1β、IL-6、IL-8含量的降低和IL-10含量的升高。這與Ramadan等[2]研究結果一致，膳食補充CWP可抑制NF-κB信號通路的激活，從而降低HS誘導的小鼠淋巴細胞促炎細胞因子(TNF-α、IL-1β、IL-6)和IL-4含量。另外，Western blotting結果顯示CWP不影響HMGB1蛋白表達量，然而免疫組化結果顯示其抑制了HMGB1的核轉位，恢

復了其胞核內蛋白表達量，這與Geng等[4]研究結果一致。因此，我們推測CWP可能并不是直接與HMGB1相互作用，而是通過修復損傷細胞降低了HMGB1的釋放，導致其不能通過TLR4激活NF-κB信號通路，最后抑制了細胞因子的分泌。因為已有研究表明，CWP可通過抑制促炎細胞因子分泌來促進組織修復，從而加速糖尿病小鼠皮膚傷口愈合[11-12]。雖然該假說尚需進一步證實，但本研究仍可證實CWP對HMGB1/TLR4/NF-κB信號通路具有調節作用，CWP可能是通過調節該途徑抑制了HS誘導的大鼠肝臟炎癥反應。

表1 CWP干預對HS大鼠肝臟細胞因子含量的影響

4 結 論

綜上所述，本研究進一步證實了HMGB1在HS所致肝臟損傷中的作用，并闡明了HMGB1/TLR4/NF-κB信號通路在HS誘導肝臟炎癥反應中的可能機制，提示HMGB1可能是干預HS所致肝臟損傷的潛在靶點。此外，本研究初步闡明了CWP對HS大鼠肝臟炎癥及HMGB1/TLR4/NF-κB途徑的調控作用。