秦巴山區蜜環菌新菌株“陜蜜2009”選育研究

趙赟鑫，謝海彬，葉彥慧，馬 昕，吳永波，解修超，鄧百萬

(1．漢中市科技資源統籌中心，陜西 漢中 723000；2．漢中市漢臺區漢麓生物科技有限公司，陜西 漢中 723000；3．陜西理工大學 生物科學與工程學院，陜西 漢中 723000)

蜜環菌(Armillariamellea)隸屬于擔子菌亞門(Basiaiomycotina)、傘菌目(Agaricales)、白磨科(Tricholomataceae)、蜜環菌屬(Armillaria)[1,2]，是名貴中藥材豬苓和天麻的共生菌，天麻和豬苓的生長必須依靠蜜環菌為其提供營養[3,4]，1990年徐錦堂等研究發現天麻在生長過程中，種子的萌發必須依靠共生菌紫萁小菇的侵染才能萌發[5]，蜜環菌對種子的萌發有抑制作用，天麻種子萌發后蜜環菌取代紫萁小菇為天麻提供營養[6]。秦巴山區地理位置優越，蜜環菌種質資源和林木資源豐富，由于蜜環菌新品種選育過程復雜，周期較長等因素，導致生產中可以使用的蜜環菌品種較少。為選育蜜環菌新品種，保障天麻、豬苓栽培穩步發展，課題組通過研究不同蜜環菌菌株伴栽天麻的品種比較，選育出了“陜蜜2009”新品種，該品種適具有適應性強、伴生栽培天麻高產穩產的特性，已通過了陜西省農作物品種審定委員會辦公室非主要農作物品種鑒定登記。

1 材料與方法

1.1 材料

從不同生態環境條件的天麻種植區采集蜜環菌資源進行分離純化，獲得資源菌株18個，以當地使用多年的京-234為對照(CK)，菌株具體來源見表1。

表1 菌株編號及來源

萌發菌為石斛小菇，由陜西省食藥用菌工程技術研究中心提供；天麻蒴果及種麻選自烏桿天麻和紅桿天麻，由漢中植物研究所提供。

樹棒采用青岡木，長度50 cm、直徑6～10 cm，在樹棒2～3面砍成魚鱗口，每窩10～12根樹棒；樹枝長度3～5 cm，直徑1～2 cm，每窩2.5 kg；樹葉每窩0.5 kg；樹棒和樹葉在有性播種前用清水浸泡24 h，樹枝用0.25% NH4NO3溶液浸泡30 min；無性栽培需提前培養好優質菌材，即采用長有蜜環菌的菌棒和菌枝。

1.2 方法

1.2.1 遺傳特異性分析

1.2.1.1 DNA分子指紋 制備液體種，用CTAB法提DNA[7]；取40 mL TBE緩沖液、0.4 g瓊脂糖，制備1%瓊脂糖凝膠，加3 μL核酸染料，待其凝固；取5 μL 6×Loading Buffer 與5 μL DNA混勻；在1%瓊脂糖凝膠中點樣，常溫下電泳，電壓110 V，時間30 min，進行DNA的檢測；利用ITS序列對真菌鑒定[8]，進行rDNA-ITS序列擴增；制備1%瓊脂糖凝膠，取PCR擴增產物5 μL點樣，電泳時間1 h，在紫外成像儀上檢測，將PCR擴增產物送至上海生工生物工程技術服務有限公司做雙向測序。

1.2.1.2 蛋白質電泳 制備蜜環菌酶液和聚丙烯酰胺凝膠；采用Tris-Glycine系統電極緩沖液，pH 8.3，5.0%濃縮膠和10.0%分離膠，上樣量20 μL，溴酚藍指示劑1滴，上層加10%蔗糖5 μL，4℃下進行電泳；電泳初期電壓80 V，樣品進入分離膠后保持電壓120 V，時間4 h；酶染色液使用堅牢藍染色系統，電泳結束后將凝膠轉移至染色液中，在恒溫振蕩器中37℃低轉速下染色，等看到褐色的酯酶同工酶區帶時，用水漂洗，保存，照相。

1.2.2 品種比較試驗

1.2.2.1 有性栽培 采用室內箱栽法進行，料土按河沙與雜木屑的體積比1:1拌料均勻，選用65×40×45 cm塑料培養箱，底部鋪有排水孔的塑料薄膜，填進料土10 cm，擺放一層濕樹葉0.5 cm作為底葉，將拌過天麻種子的萌發菌葉均勻地撒在底葉上，取樹棒緊壓在播種層上，棒間距3～5 cm，將蜜環菌條夾放在兩棒之間，菌枝空隙處放樹枝數節，用料土覆蓋3 cm，再按以上操作播第二層，播后蓋料土10 cm，用濕樹葉覆蓋，將四周塑料薄膜拉起蓋在箱面上。每箱用天麻蒴果10個，萌發菌1袋，蜜環菌2.5瓶，樹棒10～12根，每個處理重復3次。室內管理過程中，溫度控制在25℃以下，夏季最高不超過28℃；濕度控制在60%，冬季濕度在30%即可，管理期間不需要施肥和松土。生長期為8個月，產量統計以白麻和米麻的總重量來表示。

1.2.2.2 無性栽培 采用室內箱栽法，與有性栽培的區別在于沒有播種層，取提前培養好的菌棒緊壓在底葉上，棒間距6～8 cm，填半溝料土壓實，將種麻緊靠在菌棒兩頭及兩側，每根菌棒放種麻8～10個，如有小米麻可撒在中間，在棒間空隙處斜放樹枝數節，如菌棒發菌不旺，還可夾放蜜環菌菌枝，料土覆蓋，棒面保持5～10 cm厚度，按上法再栽一層，栽完蓋料土厚15～20 cm，用濕樹葉覆蓋，將四周塑料薄膜拉起蓋在箱面上。按常規方法管理，8個月后統計產量，以白麻和米麻的總重量表示。

1.2.3 區域試驗 2011-2012年度和2012-2013年度連續兩個栽培季節在寧強縣燕子砭鎮、略陽縣五龍洞鎮、勉縣張家河鎮安排不同蜜環菌品種伴栽天麻試驗，供試蜜環菌菌株為：ZY-17、ZY-5、ZY-9和ZY-7(CK)。栽培天麻品種為秦巴山區主產的紅桿天麻，種麻為漢中植物研究所統一提供的零代種麻。每個試驗點設置隨機3個小區，每小區栽植天麻20窩，各試驗點栽培管理措施一致，翌年冬季收獲時調查統計各小區天麻產量，分析不同蜜環菌菌株對天麻栽培產量的影響。

1.2.4 生產試驗 2013年～2015年在秦巴山區天麻主產區寧強、勉縣、略陽、留壩、城固、南鄭等地開展ZY-17伴栽天麻生產試驗，以當地主栽品種“京234”為對照，對ZY-17伴栽紅桿天麻、烏桿天麻的有性繁殖和無性繁殖進行生產試驗和示范，檢驗新選育品種的豐產性、適應性和穩定性。

2 結果與分析

2.1 遺傳特異性分析

2.1.1 DNA及PCR電泳結果 圖1結果顯示，18株蜜環菌的PCR序列擴增片段大小都在500-750 bp范圍。

注：M：DNA marker；1-18：ZY-1、 ZY-2、 ZY-3、 ZY-4、ZY-5、ZY-6 、ZY-7、

2.1.2 rDNA-ITS測序結果及兩兩比較 用Editseq軟件對堿基長度、GC含量進行測量，結果如表2。rDNA-ITS堿基片段長度和DNA序列中GC含量能夠反映出種屬間親緣關系的遺傳特性[9,10]。

表2 rDNA-ITS的測序結果

結果顯示，18株蜜環菌的rDNA-ITS堿基片段長度都在820-860 bp之間(其中含ITS引物，長度為223-224 bp)，C平均含量為20.8%，G平均含量為23.3%，A平均含量為23.2%，T平均含量為32.8%，GC平均含量為44.1%。除ZY-17與ZY-7外，其他菌株之間rDNA-ITS堿基片段長度或GC含量不同，這說明除ZY-17與ZY-7外的其他菌株之間遺傳物質具有差異性。

利用Megalign軟件對18株蜜環菌的rDNA-ITS序列進行兩兩比較，結果如圖2。ZY-17與ZY-7差異度為1.9%，與其他菌株之間差異度在1.4%～8.0%之間，這說明ZY-17與其他菌株在種屬關系上具有差異性。

圖2 18株蜜環菌的rDNA-ITS序列相似性(上三角)和差異度(下三角)

2.1.3 酯酶同工酶酶譜分析 對供試的18株蜜環菌酯酶同工酶進行電泳，獲到酯酶同工酶酶譜圖，如圖3。

圖3 18株蜜環菌的酯酶同工酶掃描

如圖3所示，供試18株蜜環菌酯酶都表現出較強的酯酶活性，18株蜜環菌共檢測到112條酯酶同工酶譜帶，每個菌株均有2-10條不等的酶帶。供試的18個蜜環菌菌株得到了16個酶譜類型，其中ZY-17和ZY-7、ZY-16帶型相似。

依據酶譜圖中酶帶的差異繪制酯酶同工酶模式圖，如圖4。結果顯示，ZY-8和ZY-12無一級帶，ZY-5、ZY-14、ZY-16、ZY-17、ZY-18各有1條一級帶，ZY-1、ZY-2、ZY-3、ZY-4、ZY-10各有2條一級帶，ZY-13和ZY-15各有3條一級酶帶，ZY-9有4條一級酶帶，ZY-11的一級酶帶有5條，ZY-6的一級酶帶有6條，ZY-8、ZY-12、ZY-17、ZY-18無二級酶帶，ZY-4有6條二級酶帶，其余菌株均有1-2條二級酶帶。18個蜜環菌菌株的酯酶同工酶譜帶均有不同，說明18個蜜環菌菌株之間的遺傳物質表現型不同。

圖4 18種蜜環菌的酯酶同工酶模式

2.2 品種比較試驗

2.2.1 有性栽培 經過8個月的有性繁殖，以每箱白麻和米麻的總重量來統計天麻產量，如表3，在天麻有性繁殖階段，與烏桿天麻種子伴栽的蜜環菌中天麻產量最高的是ZY-17，為每箱1.004 kg，ZY-9、ZY-5、ZY-16次之，分別為每箱0.893 kg、0.776 kg和0.623 kg，其他菌株的產量均不高；與紅桿天麻種子伴栽的蜜環菌中，產量最高的菌株是ZY-9，天麻總產量為每箱1.277 kg，其次為ZY-17和ZY-5，分別為每箱1.238 kg和1.109 kg，其余菌株均未超過1 kg。

表3 不同蜜環菌對天麻有性栽培產量的影響 (kg)

2.2.2 無性栽培 經過8個月的無性繁殖，以每箱白麻和米麻的總重量來統計天麻產量，如表4，18株蜜環菌分別與烏桿天麻的種麻伴栽過程中，ZY-17對烏天麻產量的影響明顯優于其他菌株，為每箱1.523 kg，其次為ZY-9、ZY-5、ZY-3、YZ-18、ZY-15、ZY-8、ZY-16，其余菌株均未超過每箱1 kg；ZY-17對紅桿天麻產量的影響也明顯優于其他菌株，每箱為2.931 kg，ZY-9的產量次之，每箱為2.232 kg，其他菌株的產量均未超過過每箱2 kg。

表4 不同蜜環菌對天麻無性栽培產量的影響 (kg)

2.3 區域試驗

通過品種比較試驗，優選出ZY-17、ZY-5、ZY-9三個蜜環菌菌株，以當地主栽品種京234為對照，連續兩年6點次的區域試驗產量統計結果見表5。從兩年6點次的區域試驗中可見，ZY-17伴栽天麻產量在各點次均居4個蜜環菌品種首位，均較對照品種京-234增產，增產幅度在29.70%～37.38%之間，比對照品種京-234平均增產33.17%。

表5 區域試驗產量

2.4 生產試驗

2.4.1 有性繁殖 天麻有性繁殖生產試驗產量見表6，可見ZY-17伴栽天麻6點次的有性繁殖生產試驗中，比對照品種“京-234”平均增產28.71%，其中4點次伴栽天麻品種為紅桿天麻，ZY-17比“京-234” 平均增產28.81%，2點次伴栽天麻品種為烏桿天麻，ZY-17比“京-234” 平均增產28.53%。

表6 天麻有性繁殖生產試驗產量統計

2.4.2 無性繁殖 天麻無性繁殖生產試驗產量見表7，可見ZY-17伴栽天麻7點次的無性繁殖生產試驗中，比對照品種“京-234”增產28.22%，其中4點次伴栽天麻品種為紅桿天麻，ZY-17比“京-234” 平均增產27.22%，3點次伴栽天麻品種為烏桿天麻，ZY-17比“京-234” 平均增產29.55%。

表7 天麻無性繁殖生產試驗產量統計

3 討論與結論

通過系統選育篩選出具有目標性狀的菌株ZY-17，定名“陜蜜2009”。該品種在秦巴山區多年多點的區域試驗和生產試驗中，表現出伴栽天麻產量高、菌種適應性強、穩定性好的特點，符合非主要農作物品種鑒定登記的條件，達到新品種審定要求。該品種于2017年4月25日通過了陜西省農作物品種審定委員會辦公室非主要農作物品種鑒定登記。通過上述生產試驗結果表明，陜密2009新品種可以進行推廣伴栽天麻。