吉馬酮調控JAK2/STAT3信號通路對卵巢癌SKOV3細胞增殖、遷移、侵襲的影響

何超月，任黔川

西南醫科大學附屬醫院，四川瀘州 646000

卵巢癌是女性生殖系統常見的惡性腫瘤之一，發病率僅次于子宮頸癌及子宮體癌，其早期病變一般無明顯癥狀及體征，且早期篩查缺乏敏感度，病情進展較快，死亡率居各類婦科腫瘤的首位，嚴重威脅廣大婦女生命健康[1]。目前卵巢癌的一線治療方式為先行標準的腫瘤細胞減滅術，術后進行以紫杉醇和鉑類藥物為主的化療。雖然化療藥物的作用機制明確，療效顯著，但有一定的毒性及耐藥性[2]。近年來國內外文獻大量報道一些中藥治療卵巢癌具有多靶點、多途徑、不良反應小、經濟有效等優勢[3-4]，吉馬酮是從莪術中提取的一種單環倍半萜類天然化合物，具有抗病毒、抗菌、抗炎、抗氧化等藥理作用[5-6]。本文主要研究吉馬酮對卵巢癌SKOV3細胞增殖、遷移、侵襲的影響及其作用機制，以期為研究吉馬酮治療卵巢癌提供實驗基礎。

材料與方法

1 實驗試劑與儀器 吉馬酮(上海源葉生物，貨號B20589)分子式C15H22O，規格20 mg，純度HPCL ≥ 98%。二甲基亞砜(DMSO)溶解吉馬酮，并經直徑0.22 μm除菌濾器過濾分裝后作為母液，置于-20℃冰箱保存備用。人卵巢癌SKOV3細胞(第4代，由西南醫科大學中心實驗室提供)；人正常卵巢上皮細胞IOSE-80(第4代，廣州佰匯生物，貨號FH1132)。McCoy’5A培養基(普諾賽，貨號PM150710)，RPMI1640培養基(Gibco，貨號c11875500bt)，胎牛血清(杭州四季青，貨號11011-8611)，CCK8試劑盒(同仁化學，貨號CK04)，Transwell小室(康寧，貨號P0012)，基質膠(康寧，貨號356234)，BCA蛋白濃度測定試劑盒(碧云天，貨號P0012)，ECL發光液(葆光生物，貨號GB0001)，兔抗人JAK2、STAT3、p-JAK2、p-STAT3、MMP2、MMP9抗體(萬類生物，貨號WL01836)，HRP標記的山羊抗兔IgG(萬類生物，貨號WLA023)。超凈工作臺，酶標儀，倒置相差顯微鏡，BIO-RAD垂直電泳儀等。

2 細胞培養 將SKOV3細胞培養于McCoy’5A培養基(含1%青霉素-鏈霉素雙抗，10%胎牛血清)，將人正常卵巢上皮細胞IOSE-80培養于RPMI 1640培養基(含1%青霉素-鏈霉素雙抗，10%胎牛血清)，37℃、5% CO2孵箱培養，當細胞 生長密度達到80%～90%時，進行傳代培養。

3 CCK-8法檢測細胞活性 設置濃度70 μmol/L、140 μmol/L、210 μmol/L、280 μmol/L、350 μmol/L吉馬酮組，對照組(0 μmol/L)和空白對照組(無卵巢癌SKOV3細胞、正常卵巢IOSE-80細胞)。取呈對數生長期的SKOV3細胞及IOSE-80細胞，分別用相應的完全培養基重懸細胞，接種于96孔板中，每孔5 000個細胞，每組設置3個復孔。置于37℃、5% CO2培養箱中培養24 h使細胞貼壁后更換為完全培養基配置的各個濃度吉馬酮溶液，繼續培養24 h、48 h、72 h。棄培養基，每孔加入新鮮培養基100 μL及CCK8試劑10 μL，放入孵箱孵育0.5 h、1 h、2 h和4 h后分別檢測OD值。發現在2 h時測得的OD值大小適宜，后續實驗選取2 h作為測定時間點。用酶標儀檢測各組細胞在450 nm處的吸光度(OD值)，計算細胞抑制率。根據CCK8實驗結果選擇0 μmol/L、1 40 μmol/L、280 μmol/L吉馬酮用于后續實驗。

4 細 胞 劃 痕 實 驗 設 置 濃 度140 μmol/L、280 μmol/L吉馬酮組，對照組吉馬酮濃度0 μmol/L，每組設置3個復孔。在12孔板的背面劃5條相互平行的直線，橫行穿過培養孔，每根直線距離約為0.5 cm。接種SKOV3細胞于12孔板，每孔1×105個細胞。置于培養箱中過夜使細胞貼壁。棄舊培養基，以0 μmol/L、140 μmol/L、280 μmol/L吉馬酮處理細胞24 h，用200 μL槍頭在孔底垂直劃線，用PBS清洗掉被劃下的細胞，加入含2%FBS培養基，拍照記錄此時的劃痕面積。將12孔板置于孵箱中再培養24 h，再次拍照記錄劃痕面積 ，并計算劃痕愈合率。

5 Transwell遷移實驗 取處于對數生長期SKOV3細胞種植于6孔板，每孔2×105個，在培養箱中培養過夜，細胞貼壁后棄去舊培養基，分別以0 μmol/L、140 μmol/L、280 μmol/L吉馬酮處理細胞24 h，收集藥物處理后的細胞，無血清McCoy’5A培養基將細胞密度調至2×105/mL。取24孔板配套Transwell小室，24孔板中加入含20% FBS培養基700 μL，放入Transwell小室，1 h后分別加入200 μL各組細胞懸液至Transwell上室，每組設置3個復孔。置于培養箱中培養24 h，取出小室，PBS輕柔清洗1次，4%多聚甲醛固定10 min，PBS洗滌2次，1%結晶紫染色30 min，PBS洗去多余結晶紫，用棉簽輕輕擦去上室內側細胞，晾干用顯微鏡下拍照(100×)計數，同一倍鏡選取5 個不同視野細胞數取平均值。

6 Transwell侵襲實驗 細胞處理方式同5，將基質膠(Matrigel)在4℃提前1天融化，Transwell小室、24孔培養板、槍頭置于-20℃冰箱過夜預冷。用新鮮培養基稀釋基質膠(冰上操作)，將4℃預冷的含20% FBS的McCoy’5A培養基加入24孔板中，每孔700 μL，放入Transwell小室(避免產生氣泡)，加入100 μL基質膠于Transwell上室底部，置于37℃孵箱4～5 h，基質膠聚成后取出24孔板，加入100 μL單純培養基水化30 min，分別加入各組細胞200 μL于Tanswell上室培養24 h，后 續步驟同5。

7 Western blot檢測相關蛋白 以濃度0 μmol/L、140 μmol/L、280 μmol/L吉馬酮處理細胞24 h，棄去舊培養基，4℃預冷PBS清洗3次，加入含蛋白酶抑制劑(PMSF)的裂解液裂解30 min，收集裂各組細胞解液，超聲機粉碎，4℃ 12 000 r/min下離心15 min，收集上清液。BCA法測定蛋白濃度后將各組蛋白濃度調整一致，加入5×上樣緩沖液，100℃金屬浴15 min。制膠，每孔上樣15 μL，進行電泳、轉膜。5%脫脂奶粉封閉PVDF膜2 h后置于一抗孵育液中，4℃搖床孵育過夜。PBST洗膜3次，放入HRP山羊抗兔二抗中孵育1 h。PBST洗膜3次，滴加適量ECL發光液曝光分 析。

8 統計學處理 應用SPSS19.0統計學軟件對實驗數據進行統計學處理，計量數據以 xˉ±s表示，CCK8中不同濃度、不同時間下吉馬酮對SKOV3細胞的影響采用多因素方差分析，其余多組實驗數據采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢 驗，P＜0.05為差異有統計學意義。

結 果

1 吉馬酮對卵巢癌SKOV3細胞增殖能力的影響 不同濃度的吉馬酮作用于卵巢癌SKOV3細胞及正常卵巢IOSE-80細胞24 h、48 h、72 h后，結果顯示，同一濃度下，隨著時間的延長，SKOV3細胞增殖抑制率逐漸增加，呈時間依賴性，但當吉馬酮濃度為70 μmol/L、140 μmol/L時，24 h和48 h的SKOV3細胞抑制率差異無統計學意義(P＞0.05)；相同時間下，各濃度吉馬酮對SKOV3細胞抑制率均顯著增高(P＜0.05)，呈濃度依賴性。在相同濃度及作用時間下，吉馬酮對正常卵巢IOSE-80細胞的增殖抑制作用明顯低于卵巢癌SKOV3細胞(P＜0.05)，見圖1。吉馬酮作用于卵巢癌SKOV3細胞及正常卵巢IOSE-80細胞24 h的IC50分別為3 64.7 μmol/L、1 661.0 μmol/L。

圖1 不同濃度吉馬酮作用24 h、48 h、72 h時SKOV3細胞增殖抑制率(A) (aP＜0.05, vs 70 μmol/L 24 h; bP＜0.05, vs 70 μmol/L 48 h;cP＜0.05, vs 70 mmol/L 72 h)、SKOV3細胞與IOSE-80細胞的增殖抑制率(B) (aP＜0.05, vs SKOV3, 70 μmol/L; bP＜0.05, vs IOSE-80,70 μmol/L; cP＜0.05, vs SKOV3)Fig.1 Proliferation inhibition ratio of SKOV3 cells (A. aP＜0.05, vs 70 μmol/L, 24 h; bP＜0.05, vs 70 μmol/L, 48 h; cP＜0.05, vs 70 mmol/L,72 h), SKOV3 cells and IOSE-80 cells treated with different concentrations of germacrone at 24 h, 48 h and 72 h (B. aP＜0.05, vs SKOV3, 70 μmol/L; bP＜0.05, vs IOSE-80, 70 mmol/L; cP＜0.05, vs SKOV3)

2 吉馬酮對SKOV3細胞遷移能力的影響 濃度0 μmol/L、140 μmol/L、280 μmol/L吉馬酮組細胞劃痕愈合率分別為69.00% ± 6.76%、40.33% ± 5.21%、13.79% ± 9.23%，藥物組與對照組相比，細胞劃痕愈合率顯著降低(P＜0.05)，差異有統計學意義。Tanswell遷移實驗中濃度0 μmol/L、140 μmol/L、280 μmol/L的吉馬酮組穿過小室的細胞數分別為466.5 ± 47.7、319.4 ± 41.2、149.7 ± 26.3。藥物組與對照組相比，穿過小室的細胞數明顯減少(P＜0.05)，呈濃度依賴性，見圖2。說明吉馬酮能減 弱SKOV3細胞遷移能力。

圖2 吉馬酮對SKOV3細胞遷移能力的影響A：細胞劃痕圖片(40 ×)；B：細胞遷移圖片(100 ×)；C：細胞劃痕統計圖；D：細胞遷移統計圖(aP＜0.05，vs 0 μmol/L)Fig.2 Effect of germacrone on the migration of SKOV3 cellsA: Images of cell scratch assay (40 ×); B: Images of cell migration (100 ×); C: Statistical analysis of cell scratch assay; D: Statistical analysis of cell migration (aP＜0.05, vs 0 μmol/L)

3 吉 馬 酮 對SKOV3細 胞 侵 襲 能 力 的 影 響 0 μmol/L、140 μmol/L、280 μmol/L在Tanswell侵襲實驗中，吉馬酮組穿過小室的細胞數分別為278.6 ± 71.8、161.0 ± 35.4、70.1 ± 24.9。藥物組與對照組相比，穿過小室的細胞數明顯減少(P＜0.05)，呈濃度依賴性，見圖3。說明吉馬酮可減弱細 胞侵襲能力。

圖3 吉馬酮對SKOV3細胞侵襲能力的影響A：細胞侵襲圖片(100 ×)；B：細胞侵襲統計圖(aP＜0.05，vs 0 μmol/L)Fig.3 Effect of germacrone on the invasion of SKOV3 cellsA:Images of cell invasion (100 ×); B: Statistical analysis of cell invasion (aP＜0.05, vs 0 μmol/L)

4 Western blot法 檢 測JAK2、STAT3、p-JAK2、p-STAT3、MMP2、MMP9蛋白表達 0 μmol/L、140 μmol/L、280 μmol/L吉馬酮處理SKOV3細胞24 h后各組細胞JAK2、STAT3蛋白表達無統計學差異(P＞0.05)，組間兩兩比較均無統計學差異。p-JAK2、p-STAT3、p-JAK2/JAK2、p-STAT3/STAT3、MMP2、MMP9差異有統計學意義(P＜0,05)，對照組最高，140 μmol/L吉馬酮組次之，280 μmol/L吉馬酮組最低，組間兩兩比較均有統計學差異。見表1，圖4及圖5。

圖5 各組細胞蛋白MMP2、MMP9蛋白表達(aP＜0.05, vs0 μmol/L)Fig.5 Comparison of MMP2, MMP9 protein expressions between each group (aP＜0.05, vs 0 μmol/L)

表1 不同濃度吉馬酮處理SKOV3細胞相關信號通路蛋白表達比較Tab. 1 Expressions of signaling pathway related proteins in SKOV3 cells treated with different concentrations of germacrone

圖4 各組細胞p-JAK2、p-STAT3、p-JAK2/JAK2、p-STAT3/STAT3蛋白表達比較(aP＜0.05，vs 0 μmol/L)Fig.4 Comparison of p-JAK2, p-STAT3, p-JAK2/JAK2, p-STAT3/STAT3 protein expressions between each group (aP＜0.05, vs 0 μmol/L)

討 論

中藥因在抗腫瘤方面的獨特優勢，近年來有關中藥抗卵巢癌的研究熱點逐漸增加。研究報道，在體外細胞實驗中，吉馬酮對肝癌、肺癌、乳腺癌、食管癌、胃癌、腦膠質瘤、前列腺癌、人慢性粒細胞白血病、宮頸癌細胞均有抑制作用[7-14]。其抗腫瘤細胞效應涉及多個靶點，如吉馬酮可通過抑制JAK2/STAT3通路、調節PTEN-AKT通路抑制肝癌細胞的增殖[8]；可抑制周期蛋白CyclinB1、CyclinA及周期蛋白依賴性激酶CDK1表達誘導肝癌細胞G2/M周期阻滯[7]；吉馬酮可通過上調促凋亡蛋白BAX，下調抗凋亡蛋白Bcl-2促進肺癌細胞、宮頸癌細胞凋亡[15-16]；可調控hbxion介導的細胞周期、凋亡，促進自噬體形成，抑制胃癌細胞增殖[13]；可通過誘導細胞G1期阻滯誘導腦膠質瘤細胞凋亡[11]；可抑制MMP9表達抑制食管癌細胞的遷移[12]；可逆轉乳腺癌細胞、人慢性粒細胞白血病細胞對阿霉素的耐藥性，增加其化療敏感度等[17-19]。

JAKs家族JAK是一類重要的酪氨酸激酶，由JAK1、JAK2、JAK3和TYK1四個成員構成。JAK的下游信號是STAT，有STAT1、STAT2、STAT3、STAT4、STAT5A、STAT5B、STAT6七個成員。其中JAK2/STAT3信號轉導通路直接影響細胞的增殖、分化、凋亡過程，該通路異常激活可致細胞異常增殖和惡性轉化，在多種實體腫瘤中起關鍵作用[20]。許多文獻證實在卵巢癌細胞體外研究中均表達為STAT3的高磷酸化，卵巢癌JAK2/STAT3信號轉導通路通過調控其下游靶基因的轉錄，促進卵巢癌細胞增殖，抑制卵巢癌細胞凋亡，促進其侵襲轉移，抑制這一通路可能是治療卵巢癌的候選途徑[21]。

卵巢的預后與腫瘤的復發轉移密切相關，腫瘤的侵襲轉移過程包括細胞的黏附、遷移、侵入以及細胞外基質蛋白的降解。金屬基質蛋白酶由腫瘤細胞分泌，它可以降解細胞外基質，破壞腫瘤細胞侵襲的組織學屏障，促進細胞侵襲轉移，目前MMPs家族已分離出28個成員(MMP1 ～MMP28)。其中MMP2、MMP9是當前研究的熱點，其高表達與卵巢癌的發生發展、侵襲轉移呈正相關[22]。

吉馬酮是否具有抗卵巢癌細胞的作用尚不清楚。本研究首先通過CCK8法檢測發現吉馬酮能顯著抑制卵巢癌SKOV3細胞的增殖能力，抑制作用隨著時間、濃度的增加不斷增強，存在濃度和時間依賴性。再進行劃痕實驗，結果顯示吉馬酮處理后的癌細胞其劃痕愈合率顯著低于對照組。Transwell遷移及侵襲實驗表明吉馬酮處理后的卵巢癌細胞穿過小室的細胞數較對照組明顯減少，說明吉馬酮可顯著抑制其遷移侵襲能力。已有研究發現吉馬酮可以通過抑制JAK2/STAT3信號通路來抑制肝癌細胞的增殖，可以通過降低MMP9的表達抑制食管癌細胞的遷移侵襲。為探究吉馬酮抑制卵巢癌細胞增殖、遷移侵襲能力是否也與抑制JAK2/STAT3信號通路、降低MMP2、MMP9蛋白表達相關，故進行了Western blot實驗，探究不同濃度吉馬酮作用于卵巢癌SKOV3細胞后相關蛋白的表達情況。Western blot實驗結果顯示吉馬酮作用于SKOV3細胞后可抑制p-JAK2、p-STAT3蛋白表達，下調p-JAK2/JAK2、p-STAT3/STAT3。說明吉馬酮抑制卵巢癌細胞的增殖與抑制JAK2/STAT3信號通路活性有關，其對酪氨酸激酶的激活有特異性抑制作用，進而減少了其下游的STAT3發生磷酸化，這條在卵巢癌中異常激活的信號通路被阻滯，從而抑制了癌細胞的異常增殖。Western blot法顯示不同濃度吉馬酮作用于SKOV3細胞后可不同程度地抑制MMP2、MMP9表達，說明吉馬酮抑制SKOV3細胞侵襲遷移能力可能是通過抑制MMP2、MMP9蛋白表達實現的。

綜上所述，本實驗證實了吉馬酮可明顯抑制卵巢癌SKOV3細胞的體外增殖、遷移、侵襲能力，其機制可能與抑制JAK2/STAT3信號通路、下調MMP2和MMP9蛋白表達有關?？蔀檠芯考R酮治療卵巢癌提供一定的實驗依據，但吉馬酮抑制卵巢癌細胞增殖遷移、侵襲是否有其他信號途徑參與，以及這些信號通路是否與JAK2/STAT3信號通路相關尚不清楚，其是否通過多靶點抑制卵巢癌尚需進一步研究。