檳榔黃化病病原研究及防控中存在的問題及展望

唐慶華　宋薇薇　于少帥等

中圖分類號： S432.4 文獻標識碼：A DOI：10.16688/j.zwbh.2020202

Areca catechu L.是一種典型的熱帶作物，在中國和印度等主要種植國的經濟地位是“小檳榔，大產業”。2015年，印度檳榔種植業產值達到300億印度盧比（約合人民幣28.8億元，筆者注），成為邊遠地區3000萬農民的主要經濟來源。在中國，海南省檳榔種植面積和總產量均占全國的95%以上。2015年底檳榔產值已超越天然橡膠，躍居為海南第一大支柱產業。截至2018年，全省種植面積超過11萬hm2，產值達287.3億元，成為海南省中東部地區230多萬農民（約占海南省常住總人口的1/4）的主要收入來源之一，在海南“精準扶貧”戰略實施中起著重要作用。

檳榔黃化?。▂ellowleafdiseaseofarecanut，YLD）是一種由植原體引起的毀滅性病害。印度和中國分別于1914年和1981年首次發現YLD，其發生和流行已給兩國檳榔產業造成了嚴重威脅。此外，該病在斯里蘭卡也有少量發生。在中國，有部分學者對該病病原尚存在爭議或質疑。與此同時，近年來椰心葉甲犅狉狅狀狋犻狊狆犪犾狅狀犵犻狊狊犻犿犪等重要病蟲害頻繁發生，加上除草劑的不當施用和氣候等因素的影響，給病害田間診斷和防控帶來一系列問題。檳榔黃化病現已成為嚴重威脅中國檳榔產業可持續發展的瓶頸，引起了海南省政府以及社會各界的普遍關注。為此，有必要對上述問題做出回應、分析和總結，以便更好地解決檳榔黃化病帶來的問題。本文旨在進一步系統梳理病原及防控中存在的誤區和問題，理清主次并提出新形勢下的檳榔黃化病綜合防控建議。

1 檳榔黃化病研究現狀

1.1 檳榔黃化病的發生

最早的檳榔黃化病記錄可追溯到20世紀初期。1914年，印度Kerala（喀拉拉邦）部分地區首次發現YLD。1949年Kerala中部幾個地區種植的檳榔開始發病，至60年代，YLD 已在該邦普遍發生。1987年，YLD 在Karnataka（卡納塔卡邦）的DakshinaKannada以及Sullia地區危害，3年后該病引起的產量損失達50%。目前，YLD 已給印度檳榔產業造成了嚴重損失。

在中國，YLD 自1981年在海南屯昌縣烏坡鎮（原海南藥材場）首次出現以來，該病現已擴散至三亞、陵水、瓊海等12個市縣（本課題組未發表數據）。2008年，全省檳榔染病面積達0.2萬hm²，至2017年超過1.33萬hm²（本課題組未發表數據）。目前，萬寧、屯昌等重病區發病率高達90%，造成減產70%～80%，嚴重者絕產。據不完全統計，該病給海南省造成的經濟損失超過20億元/年。

1.2 檳榔黃化病病原研究

印度學者對YLD病原或病因的深入研究始于20世紀中期，經過20多年的艱苦探索，至1971年才發現植原體與黃化病相關。印度學者的探索可分為兩個階段。第一階段為探索期（1914年-1970年），從非生物因素角度分別排除了營養、水分、pH 等與黃化病的直接相關性;也從生物角度排除了螨蟲、真菌、根部細菌以及線蟲與黃化病的相關性。期間，盡管發現接種病毒可以引起檳榔以及指示植株豇豆、洋刀豆等發病并進行了組織病理學方面的研究，但并未發現病毒與黃化病相關的證據。第二階段為進展期（1971年-迄今），Nayar通過組織培養從感病檳榔葉片中獲得一種微生物，電鏡觀察后發現是一種類菌原體（mycoplasmalikeorganism，即植原體），此為首次發現植原體與黃化病相關。該發現開啟了檳榔黃化病病原研究的大門。目前，印度學者已通過各種試驗證據確認該國的YLD 病原為植原體。其常規證據包括電鏡觀察、迪納氏染色、血清學、媒介昆蟲甘蔗斑袖蠟蟬Proutista

moesta接種及菟絲子傳病;分子檢測證據包括巢式PCR、real-timePCR、環介導等溫擴增技術（loop-mediatedisothermalamplification，LAMP）。目前，已發現印度檳榔黃化植原體存在3個組或亞組，分別為16SrⅪ-B 亞組、16SrⅠ-B組和16SrⅪⅤ組。由此可見，印度檳榔黃化植原體具有多樣性。Ponnamma證實檳榔黃化病可通過甘蔗斑袖蠟蟬傳播。由于媒介昆蟲與植原體存在高度?；?，3個組或亞組的植原體是否均可通過甘蔗斑袖蠟蟬傳播尚待進一步研究。

對于檳榔黃化病，我國科研人員同樣也經歷了較長時間的探索過程。1981年屯昌縣檳榔出現該病后，俞浩等認為是一種生理性病害，系由于土壤缺鉀引起。吳影梅提出寄生性線蟲可能是檳榔黃化病直接病原或間接起到加速病害發生的作用，并對廣東、海南2 省檳榔園中的線蟲種類進行了調查，最近，依然有學者或公司認為線蟲與檳榔黃化病的發生相關，但迄今為止國內尚未見二者具有相關性的報道。1995年，金開璇等采用電鏡技術，在黃化病病株中發現了類菌原體和類細菌，最早提出中國檳榔黃化病為類細菌（束頂型）和類菌原體（黃化型）復合侵染所致。然而，羅大全等在隨后進行的電鏡試驗中并未觀察到類細菌，僅觀察到植原體，且發現注射2種四環素族藥物后病株病情發展被不同程度抑制，由此提出“植原體是黃化型黃化病的病原之一”。隨后羅大全等通過病原PCR 檢測，發現黃化型病樣可擴增到植原體特異條帶，而對照無擴增條帶，這與電鏡觀察、四環素注射和大田流行規律研究結果一致。2010年，車海彥、周亞奎等對檳榔黃化植原體進行了巢式PCR 擴增、測序及系統發育分析，根據16SrRNA 序列分別將其劃分為16SrⅠ-G亞組和16SrⅠ-B亞組。

1.3 檳榔黃化病病原研究存在的問題及爭議

關于檳榔黃化病病原，目前依然存在一些需要解答或解決的問題。首先，束頂型黃化病病原尚未明確。金開璇等將中國檳榔黃化病劃分為黃化型和束頂型2種癥狀，并提出束頂型癥狀是類細菌引起，但羅大全等通過電鏡未觀察到類細菌。因此，束頂型癥狀是否由植原體引起尚待進一步研究。其次，印度檳榔黃化植原體分屬于3個組（16SrⅠ、16SrⅪ 和16SrⅪⅤ），中國僅報道了1個組（16SrⅠ），中國黃化植原體在16Sr組水平上是否也存在多樣性尚有待進一步研究。最后，國內檳榔黃化病的傳播途徑尚無試驗證據。盡管我們在海南也發現了甘蔗斑袖蠟蟬，然而在染病檳榔園很難發現該蟲，這給該蟲的植原體檢測、驗證工作帶來了困難。此外，我們還發現了另外一種刺吸式口器昆蟲，植原體檢測呈陽性（本實驗室未發表資料），該蟲是否為YLD的媒介昆蟲尚需研究。檳榔黃化病能否通過檳榔種子、帶菌種苗等調運遠距離傳播也尚不明確。

目前，國內部分學者對檳榔黃化病病原尚存在質疑。首先，此前國內僅有2個課題組成功檢測到檳榔黃化植原體，部分課題組因未能檢測到植原體，從而質疑甚至徹底否定“植原體是檳榔黃化病的病原”這一試驗結論，并認為該病是病毒病或根部病害所致。實際上，植原體檢測對試驗技術要求比較高，采樣或試驗技術等問題均可能導致檳榔黃化植原體檢測失敗。本課題組在引進一名有植原體檢測技術背景的專業人員后，于2018年-2019年用了近一年的時間通過采樣部位選擇、基因組DNA 提取等優化才實現檳榔黃化植原體的穩定檢測。其次，盡管印度學者已通過菟絲子、甘蔗斑袖蠟蟬接種試驗證實檳榔黃化病病原為植原體，但依然有部分學者提出必須用植原體接種、驗證其致病性。此前，學界一直認為植原體無法在人工培養基上培養。盡管2012年意大利學者Contaldo等獲得突破，成功獲得植原體菌落，其結果未被其他實驗室重復出來。因此，用經典的柯赫氏法則驗證檳榔黃化植原體致病性可能會面臨植原體培養、接種等技術難題。此外，染病檳榔通常多從樹冠倒數第2～3片葉表現黃化癥狀，而此部位的巢氏PCR檢出率為30.6%（49個黃化樣品中僅有15個檢測到植原體）、實時熒光PCR檢出率僅為26.7%～46.7%（車海彥博士論文，未公開發表）。有學者認為“檳榔園黃化植株檢出率需達到90%以上才能確認植原體與黃化病具有相關性”。我們認為該觀點顯然是錯誤的。因為檢測是病害診斷技術，檢出率是衡量植株群體帶菌率高低的依據（文衍堂，個人聯系），不是衡量兩個事物相關性的依據。同時，試驗結果證實采用現有技術（real-timePCR和巢式PCR）很難達到90%檢出率的目標，這首先受real-timePCR 和巢式PCR 檢測靈敏度的制約。其次，研究發現植原體在棕櫚科寄主植物檳榔（車海彥博士論文，未公開發表）和椰子體內分布不均，這可能是造成檢出率較低的原因?？傊?，在檳榔黃化病研究中需要摒棄上述片面甚至錯誤認識的干擾。

2檳榔黃化病防控中存在的問題

2.1檳榔黃化病田間診斷存在干擾

迄今，科研人員在檳榔黃化病病原研究上取得了豐碩成果，然而該病的防控依然極具挑戰性。調查發現除黃化病外，炭疽病、細菌性條斑病、葉斑病、褐根病和紅根病、病毒病及椰心葉甲等病蟲害、生理性缺素、干旱、肥害、除草劑等均可引起檳榔葉片變黃。在黃化病區，通常是1種或多種病蟲害與黃化病同時發生;加上營養和氣候等因素干擾，“真假”黃化病并存情況較多，易造成混淆，給黃化病識別帶來了許多困擾，大大增加了檳榔黃化病防控的難度。因此，中國檳榔黃化病問題更具復雜性。上述因素中椰心葉甲和除草劑問題最為突出。我們調查發現在陵水、萬寧等重病區，已有大面積檳榔園遭受黃化病以及椰心葉甲共同為害，導致樹勢迅速下降，樹冠縮小、枯黃甚至植株死亡，產量損失嚴重，重病園幾近絕產，造成疫區許多農戶“談黃色變、談黃恐慌”，由此喪失種植信心，致使黃化檳榔園失管情況非常突出。椰心葉甲已成為黃化病綜合防控中需要優先考慮和解決的問題。吳童童等調查發現生產上除草劑的使用非常普遍，且除草劑使用歷史越長、頻率越高時，園中檳榔長勢越差。其他因素與檳榔黃化病癥狀或危害上有一定程度的相似性，但較易區分。如炭疽病、細菌性條斑病、葉斑病、病毒病等為典型葉斑類病害，褐根病和紅根病等根部病害從最外層葉片開始出現黃化癥狀、折斷垂掛至植株死亡。芽腐病也多見于瓊中縣。營養元素缺乏或過量以及肥害、除草劑以及干旱、臺風等引起的黃化同樣與檳榔黃化病癥狀有明顯區別，前者采取施肥、灌水、科學施用除草劑、養殖（牛、羊、雞）、間種其他作物等措施后通常幾個月至一兩個生長季即可得到明顯改觀甚至恢復正常生長狀態，而后者無論采取何種防控措施均無法恢復到健康狀態?？傊?，檳榔黃化病田間診斷時需要認真分析，綜合考慮，逐項排除，方能做出準確判斷并采取相應的防控措施。需要指出的是田間診斷僅是根據病株的表觀癥狀做出判斷，不能排除其他因素引起的黃化植株是否感染植原體，因為處于潛育期的植株并不表現癥狀，對于這些病株只能通過檢測手段確診。

2.2 檳榔黃化病防控難度大

目前，海南省檳榔黃化病防控難度極大，主要有以下原因。首先，近幾年陵水縣、萬寧市、瓊海市等重病區輸出種苗較多，給黃化病隨種苗傳播提供了方便。第二，檳榔植株高大，人工噴藥費工費時，且成本較高。因此，生產上急需研發精準施藥、智能機械化施藥設備及配套技術。第三，健康種苗保障體系建設不足，這包括健康種苗培養基地建設和檳榔黃化植原體快速、高效檢測技術研發和單位資質授權。第四，科研單位研發的高效栽培、防控技術及配套產品儲備尚顯不足，已開發的技術、產品在生產上應用度亟待提高;科研單位與企業合作也明顯不足，未充分發揮后者的強大推廣能力。第五，集成防控技術和措施時需要計算投入產出比。只有防控后挽回的損失明顯高于防控投入，防控措施才能獲得推廣。否則僅靠省、市（縣）或廳、局財政經費支持、補貼，各級政府會面臨非常大的經費壓力。最后也是最重要的問題就是，廣大農戶一直以來都是把檳榔作為“懶人植物”，管理（肥、水、草）粗放、病蟲害防控意識淡薄，廣種薄收情況很普遍;砍除病株是一項防止植原體及其類似病害進一步擴散的有效措施，在柑橘黃龍病防控上已被廣泛接受，然而在檳榔黃化病防控上尚未得到廣泛認同;相反，可治、治愈的觀念卻很普遍，這明顯地阻礙了砍病樹等清除毒源措施的貫徹。

3 檳榔種植業前景、黃化病發展趨勢分析及黃化病防控建議

3.1 檳榔種植業前景及黃化病發展趨勢分析

根據近5～6年的檳榔種植發展動態、消費市場以及宏觀政策，我們預計檳榔種植面積會繼續增加。2014年-2018年檳榔價格一直處于較高水平，農戶種植積極性高漲，在海南省，除中東部地區外，西部地區也在快速發展檳榔產業。目前，全國檳榔消費群體不斷擴大，現已發展至北方多個省份。與此同時，海南省省政府正在加快推進“大力提升熱帶高效現代農業”的戰略性產業規劃，積極扶植檳榔產業。因此，未來檳榔種植范圍、面積會持續增大。迄今，對于植原體病害尚無有效治療藥劑。在中國，檳榔黃化病抗性種質材料研究、媒介昆蟲鑒定、生物學特性和傳毒機理的研究尚處于初期階段。在此背景條件下，我們預期未來5～10年內檳榔黃化病會隨著種植面積的擴大繼續擴散、加重。

3.2 檳榔黃化病防控建議

檳榔黃化病的有效治理事關海南省“精準扶貧”“鄉村振興”戰略的實施，需要從多個層面采取綜合防控措施。我們建議強化政府職能作用，推動“政府科研院所高等院校企業農戶”聯動，多層次多角度聯合攻關。首先，建議政府充分發揮導向和宣傳作用，加強新型農民職業培訓，提高其種植管理水平和防控意識，夯實防控基礎。政府部門的作用還體現在檢疫工作的強力執行和砍除病株措施的落實和補償。其次，建議科研院所和高等院校組織精干隊伍對全省各市縣黃化病進行普查，摸清其分布、發病面積及病情輕重等基本信息;研發早期快速診斷及高效監測技術;以黃化病為攻關核心，探明傳播途徑、發生規律，深入開展致害機理研究。防控關鍵技術方面，研發傳播途徑阻截、生物防治、化學防治等關鍵技術;研發生物防治與化學防治的田間協調病蟲兼控技術;研發適合產地生態環境和栽培模式的農藥替代產品、新劑型、化學防治替代技術，集成農藥減施增效技術模式。栽培技術方面，研發高標準、高質量、集約化的種植管理技術，積極開展抗性種質資源收集、篩選及鑒定，研發健康種苗標準化繁育及種苗檢測技術，保障種苗市場;研發專用肥、增效助劑和保水劑，建立合理的水肥綜合管理技術體系;開展水肥需求規律、林下種養模式研究，集成檳榔園不同生態栽培模式及配套技術。再次，對于相關企業，充分發揮其信息收集、示范與推廣方面的作用，熟化科研院所和高等院校研發的各項技術，集成農民易接收、可復制、可推廣的黃化災害防控及高效栽培關鍵技術。最后，建議廣大農戶加強田間管理，修建水肥一體化設施，主動砍除病株，采取林下種養、多種經營等措施，減少因檳榔黃化病造成的經濟損失、擴展收入來源。

總之，除非采取切斷傳播途徑等綜合措施，否則黃化病必然會隨著檳榔種植業持續擴展繼續向非病區及新種植區蔓延，造成的經濟損失也將持續增大。因此，只有通過上述5方緊密協作，才能達到減輕或杜絕病害蔓延、危害，保障產業健康發展。

4 展望

目前，第三代檢測技術- 微滴式數字PCR（dropletdigitalPCR）已成功應用于植原體檢測，結果顯示該技術比real-timePCR和巢式PCR檢測靈敏度高2～3個數量級。采用微滴式數字PCR技術有望提高檳榔黃化植原體檢出率，也有望實現健康種苗的保障和病害早期診斷，從而達到病害“早發現、早診斷、早防控”的目的。在檳榔黃化病田間防控上，由于植原體病害為典型的蟲傳病害，媒介昆蟲在植原體病害傳播中具有“雙寄主”角色，應對其生物生態學、傳毒特性進行深入研究。盡管迄今尚無有效治療藥劑，但棗瘋病和椰子致死性黃化?。鞲缬瓤ㄌ箍茖W研究中心DanielZizumbo-Villarreal博士，個人聯系）的抗性品種選育、小麥藍矮病的媒介昆蟲控制（西北農林科技大學吳云鋒教授，私人聯系）、柑橘黃龍病“三板斧”措施（控制柑橘木虱、挖除感病植株和培育無病毒苗木，華南農業大學鄧曉玲教授，私人聯系）防效已被證實，檳榔黃化病防控可大膽借鑒上述植原體或類似病害的相關措施。迄今，我們在檳榔黃化病流行規律、監測預警技術、健康種苗培育、健康栽培措施等方面已有一定進展（另文發表）。例如，我們在黃化病防控調查中發現林下間種胡椒、牧草以及林下養牛、雞等對于減輕檳榔黃化病危害有較好的促進作用和增收作用，但對減輕黃化病為害的機理有待深入研究。在理論研究上，為了深入研究植原體生物學特點、致病機理、植原體寄主互作等基礎問題，國內外學者從基因組學、蛋白組學、效應因子、致病因子、免疫膜蛋白等不同層次開展了研究，并取得了可喜的進展。例如，Oshima等發現翠菊黃化植原體OY菌株全基因組沒有戊糖磷酸循環和ATP合成酶亞基，具有退化性進化的特點。Sugio等發現植原體效應蛋白SAP11能夠通過控制寄主植物發育和防御性激素生物合成從而增強傳播介體葉蟬犕犪犮狉狅狊狋犲犾犲狊狇狌犪犱狉犻犾犻狀犲犪狋狌狊的產卵能力。上述研究有望為防控檳榔黃化病提供新的策略和方法。

最后，借用《科學》雜志編輯EvelynStrauss的文章“植原體研究現已開始百花齊放”（Phytoplasmaresearchbeginstobloom），檳榔黃化病科研攻關和有效防控需要政府、科研機構、企業和農戶齊心協力，通過持續不懈的努力，中國檳榔產業的持續健康發展一定能夠得到有效保障。