中藥材昆布中25 種溴系阻燃劑殘留量的測定和風險評估*

李珂瑜，孫 晶，曹 玲，譚 力，王沁怡，杭太俊**，馮有龍**

1 中國藥科大學 藥學院，南京 211198；2 江蘇省食品藥品監督檢驗研究院，南京210019

溴系阻燃劑（brominated flame retardants，BFRs）是一類典型的持久性有機污染物（persistent organic pollutants，POPs），在環境中廣泛存在，具有環境持久性、遠距離大氣運輸、生物蓄積性和強烈的生物毒性等特性。BFRs 通常用于電子電氣設備、紡織品、塑料、建筑材料等[1]。市售BFRs 主要包括多溴二苯醚（polybrominated diphenyl ethers，PBDEs）、六溴環十二烷（hexabromocyclododecane，HBCD）和四溴雙酚A（tetrabromobisphenol A，TBBPA）以及一系列新興溴化阻燃劑（emerging BFRs，eBFRs）。PBDEs 是一類應用最為廣泛的添加型BFRs，分子式為C12H（9-0）Br（1-10）O，理論上同源物有209 種，取決于兩個苯環上Br 原子的數量和位置，分為10 個同族物（單溴代到十溴代）。毒理學研究表明，PBDEs 會影響人的神經系統發育、內分泌系統、認知能力、運動功能等[2]，PBDEs 的三種商業產品五溴二苯醚（pentabromodiphenyl ether，pentaBDE）、八溴二苯醚（octabromodiphenyl ether，octaBDE）和十溴二苯醚（decabromodiphenyl ether，decaBDE）已于2009 年和2017 年被列入《關于持久性有機污染物的斯德哥爾摩公約》（POPs 公約）受控名單，禁止生產使用。我國于2014 年禁止了商業pentaBDE、octaBDE 的生產使用，但到目前為止，decaBDE 在中國尚未受到限制[3]。由于PBDEs 的逐步禁用，eBFRs 作為PBDEs 的替代品得到了廣泛應用，包括六溴苯（hexabromobenzene，HBB）、五溴甲苯（pentabromotoluene，PBT）、1，2-二（2，4，6-三溴苯氧基）乙烷[1，2-bis（2，4，6-tribromophenoxy）ethane，BTBPE]和十溴二苯乙烷（decabromodiphenylethane，DBDPE）等[4]，其中DBDPE 已成為中國市場上生產和使用最多的eBFRs[5]。

中藥材大部分來自動植物，它們的生長、發育與周圍自然環境密切相關?，F階段，國內對于中藥材中POPs 的研究主要是有機氯農藥殘留，僅幾篇文獻報道中藥材中另一類POPs 多氯聯苯的殘留[6]，而對于中藥材中BFRs 的研究知之甚少。昆布是一種生活在海洋里的大型褐藻，其藥用來源是海帶科植物海帶Laminaria japonica Aresch 或翅藻科植物昆布Ecklonia kurome Okam 的干燥葉狀體，具有軟堅散結、消痰、利水之功[7]，多分布于我國遼寧、山東、浙江和福建東部，多位于我國BFRs 的重污染區。因此，建立中藥材中BFRs 殘留量的測定方法并評估其潛在風險對于評估中藥安全性具有重要的現實意義。

1 材 料

1.1 儀器

7890A-7000B 氣相色譜-三重四極桿質譜聯用儀（配CI 離子源，美國Agilent 公司）；XP6 百萬分之一分析天平（Mettler Toledo 公司)；UA22MFD 超聲波清洗儀（德國Wiggens 公司）。

1.2 藥品與試劑

BDE-47、-66、-69、-71、-85、-99、-100、-138、-153、-154、-183、-190、-196、-197、-203、-205、-206、-207、-208、-209、BTBPE、DBDPE 的對照品均購自美國AccuStandards Inc 公司，其中DBDPE 質量分數＞99.5%，BTBPE 的質量濃度為100 μg·mL-1，其余PBDEs 對照品的質量濃度為50 μg·mL-1；BDE-201、-202 對照品購自Wellington Laboratories Inc 公司，質量濃度為50 μg·mL-1；HBB 對照品購自德國Dr.Ehrenstorfer GmbH，質量分數＞99.5%。內標BDE-77、-118、-181 購自美國AccuStandards Inc 公司，質量濃度均為50 μg·mL-1；13C12-BDE-209 購自美國劍橋同位素實驗室，質量濃度為50 μg·mL-1。

正己烷、甲醇、異辛烷、甲苯均為色譜純（德國Merck 公司）；二氯甲烷為色譜純（美國Anaqua Chemicals Supply 公司）；濃硫酸、氫氧化鈉均為優級純，購自南京化學試劑公司；無水硫酸鈉（農殘級）購自上海阿拉丁生化科技股份公司；硅膠（分析純，100～200 目）購自青島海洋化工公司；硅鎂合劑（分析純，100～200 目）購自國藥集團化學試劑公司。

共收集了19 批昆布和4 批海帶。經江蘇省食品藥品監督檢驗研究院胡浩彬鑒定均為合格的藥材。樣品編號為S1～S19，其中S1～S3 產地為浙江；S4～S8 產地為福建；S9～S11 產地為遼寧；S12～S14 產地為廣東；S15～S19 產地為山東。海帶為市售品，編號為S20～S23，產地分別為遼寧、福建、山東、福建。

1.3 實驗材料預處理

正己烷和異辛烷使用前需經過2 次蒸餾。

無水硫酸鈉用前于馬弗爐450 ℃活化6 h，冷卻密封，保存于干燥器中；硅膠和硅鎂合劑用前依次以甲醇和二氯甲烷超聲清洗2 次，晾干后分別以450 ℃和180 ℃活化6 h，冷卻密封，保存于干燥器中。

2%堿性硅膠：取活化硅膠98 g，加入0.05 g·mL-1NaOH 溶液40 mL，充分混勻后放置12 h 備用。

44%或50%酸性硅膠：取活化硅膠分別為56 g和50 g，加入濃硫酸44 g 或50 g，充分混勻后放置12 h 備用。

2 方法與結果

2.1 儀器條件

2.1.1 色譜條件色譜柱：AgilentDB-5MS（15 m×0.25mm，0.1μm）；進樣方式：脈沖不分流進樣（30psi，維持1 min）；進樣體積：1 μL；進樣口溫度：290 ℃；載氣：高純氦氣（純度>99.999%）；流速1.0 mL·min-1；程序升溫：初始溫度90 ℃，保持0.5 min，以15 ℃·min-1的速率升高到180 ℃，然后以10 ℃·min-1的速率升至315 ℃并保持5 min。

2.1.2 質譜條件負化學電離模式（NCI），甲烷反應氣，離子源溫度230 ℃，四極桿溫度150 ℃，傳輸線溫度300 ℃，溶劑延遲時間10 min，離子監測模式（SIM）?；衔锖蛢葮说谋Ａ魰r間、質譜參數見表1。

表1 目標化合物的保留時間和質譜檢測離子信息

2.2 對照品溶液的配制

DBDPE 對照品儲備液（40 μg·mL-1）：精密稱取DBDPE 對照品1.0 mg 置25 mL 量瓶中，用甲苯溶解并稀釋至刻度，混勻，即得。

HBB 對照品儲備液（50 μg·mL-1）：精密稱取HBB 對照品1.0 mg 置20 mL 量瓶中，用異辛烷溶解并稀釋至刻度，混勻，即得。

混合對照品儲備液：精密量取BTBPE 對照品（100 μg·mL-1）20μL，BDE-209 對照品（50 μg·mL-1）200 μL，DBDPE 對照品儲備液400 μL，其余對照品（50 μg·mL-1）40 μL，置同一50 mL 量瓶中，用異辛烷稀釋至刻度，搖勻，即得。

定量內標溶液：分別精密量取BDE-77、-118對照品（50 μg·mL-1）各10 μL 和13C12-BDE-209 對照品（50 μg·mL-1）25 μL，置同一250 mL 量瓶中，用異辛烷稀釋至刻度，搖勻，即得。

進樣內標溶液：精密量取BDE-181 對照品（50 μg·mL-1）10 μL 置250mL 量瓶中，用異辛烷稀釋至刻度，搖勻，即得。

2.3 供試品溶液的制備

2.3.1 樣品提取取昆布藥材，研細。準確稱取1.0g，與無水硫酸鈉2.0 g 混勻置150 mL 玻璃碘量瓶中，精密加入定量內標溶液200 μL，加入正己烷-二氯甲烷（1∶1，v/v）混合溶劑70 mL 超聲提?。?9 kHz，500 W）30 min，加入50%酸性硅膠7 g 混勻，靜置過夜（約15 h）超聲提取20 min，取上清液置250 mL 茄形瓶中，殘渣中再次加入正己烷-二氯甲烷40 mL（1∶1，v/v）超聲提取20 min，重復操作1 次，合并有機萃取液，旋蒸濃縮至1～2 mL，并置換溶劑為正己烷。

2.3.2 樣品凈化采用復合硅膠柱進行樣品凈化。層析柱底部用脫脂棉封堵，加入40 mL 正己烷，從下往上依次填充1.5 g 無水硫酸鈉、1.0 g 中性硅膠、2.0 g硅鎂合劑、1.0 g 中性硅膠、4.0 g 2%堿性硅膠、1.0 g中性硅膠、8.0 g 44%酸性硅膠、1.0 g 中性硅膠、1.5 g無水硫酸鈉。使用前依次使用二氯甲烷30 mL、正己烷15 mL 清洗復合硅膠柱。

將上述提取濃縮液全部轉移到復合硅膠柱上（5 mL 正己烷蕩洗茄形瓶3 次），用正己烷-二氯甲烷（1∶1，v/v）120 mL 洗脫，收集洗脫液，旋蒸濃縮至約1 mL，用正己烷約5 mL 分3 次轉移濃縮液至10 mL離心管中，室溫下離心濃縮揮干，精密加入進樣內標溶液200 μL 復溶，渦旋10 s，轉移至玻璃襯管待測。

2.4 方法學考察

2.4.1 專屬性考察按“2.3”項下方法制備供試品溶液，同法處理添加內標的方法空白，向200 μL 供試品溶液中加入混合對照品儲備液10 μL，即得系統適用性溶液。注入GC-MS 分析，結果表明方法空白中無污染物干擾，昆布樣品在內標處無干擾，各目標分離度良好，見圖1。

圖1 25 種分析物GC-NCI-MS 典型總離子流色譜圖

2.4.2 線性與范圍精密量取“2.2”項下混合對照品儲備液和內標溶液適量，配制成含BDE-69 質量濃度為0.010、0.050、0.20、0.50、2.0、5.0、10 ng·mL-1的系列標準溶液，其中內標的質量濃度為含BDE-118 2 ng·mL-1。按“2.1”項下儀器條件測定，記錄峰面積。以目標物與內標物質濃度比值為橫坐標（BDE-209和DBDPE 的內標為13C12-BDE-209，其余均為BDE-118），峰面積的比值為縱坐標，繪制標準曲線，結果見表2。各目標化合物在各自的線性范圍內呈良好的線性關系。

2.4.3 檢測限和定量限向200 μL 供試品溶液中加入10 μL 低濃度混合對照品溶液，進樣測定。檢測限（LOD）和定量限（LOQ）分別確定為3 倍和10 倍的信噪比（S/N），計算得出檢測限和定量限分別為0.000 2～0.030 ng·g-1和0.000 6～0.090 ng·g-1（見表2）。

表2 線性范圍、線性方程、相關系數、LOD 和LOQ

2.4.4 方法回收率和精密度取昆布S6-S8 混合樣品約50 g 作為基質空白樣品，研細，準確稱取1.0 g，共11 份，分別添加低、中、高3 個濃度水平的混合標準溶液，每個加標水平3 份，其中BDE-209 加入量為0.5、2、8 ng·g-1，DPDBE 加入量為0.8、3.2、12.8 ng·g-1，其余阻燃劑加入量為0.1、0.4、1.6 ng·g-1，2 份用于監測本底水平。照“2.3”項下處理，進樣測定。取低、中、高濃度水平混合標準溶液各1 份，連續進樣6 次，記錄峰面積，測定進樣精密度，結果見表3。方法平均回收率為74.82%～105.3%，RSD 為2.4%～24.2%，精密度為0.6%～8.8%（n=6）。根據美國環境保護署方法1614[8]，對于含3～9 個溴原子的PBDEs，其回收率應在50%～150%，而對于BDE-209，其回收率可在40%～200%，表明分析方法的準確度較高。

表3 各目標化合物的平均回收率

2.5 實際樣品測定

采用上述建立的方法測定昆布中各目標物的殘留量。23 批昆布樣品BFRs 殘留量的統計信息見表4。共檢出BFRs22 種，BDE-69、-85、-138 低于檢測限，BDE-196、-197、-201、-206、-207、-208、-209、DBDPE 是樣品中發現的主要單體，檢出率較高（>90%）。昆布樣品中∑PBDEs 的濃度范圍為0.24～30.3ng·g-1，平均值為2.72ng·g-1，而∑eBFRs 的濃度范圍為0.44～8.42ng·g-1，平均值為1.99ng·g-1（見表4）。

表4 昆布樣品中目標物的濃度（ng·g-1）和檢出率（%）

2.6 風險評估

由于目前尚未建立中藥材中BFRs 的風險評估方法，參考歐洲食品安全局（EFSA）建議的暴露限值（MOE）方法，評估攝入BFRs 的健康風險[9]。MOE 定義為引起10%不良反應的基準劑量下限值（BMDL10）與估計的每日攝入量（EDI）的比值，MOE＞2.5 表明不太可能造成健康問題[9]。根據對神經發育的影響作為毒理終點，相關毒性數據僅適用于BDE-47、-99、-153、-209，ESFA 建議的BMDL10分別為172、4.2、9.6 ng·kg-1·day-1和1.7 mg·kg-1·day-1（kg 指體重）[9]。

據國家食品安全風險評估指南對風險評估數據的要求[10]，未檢出結果按LOD 計算，污染物殘留量取均值評估長期膳食暴露風險。參考左甜甜等[11]報道的中藥材農藥殘留暴露評估方法，估算中藥材中PBDEs 的EDI，結果見表5 EDI 1。同時，在食品的暴露評估中EDI 估算為食品中污染物濃度乘以每日消費量、除以人體質量（以63 kg 計）[9]。本研究按昆布最大日消費量100 g 估算，見表5 EDI 2。

表5 BDE-47、-99、-153 和-209 的暴露限值

按中藥和食品兩種方法估算EDI，調查的昆布樣品中BDE-47、99、153、209、MOE 值均＞EFSA 設定的閾值2.5，表明其攝入的健康風險關注度較低。

3 討論

3.1 提取條件的選擇

索氏提取法是持久性有機污染物痕量分析的經典方法，但索氏提取法提取時間相對較長（需回流24 h）且消耗溶劑量較大，對于處理大批量的樣品并不是很好的選擇。超聲輔助提取可以增加目標分析物向液相的傳質過程，縮短了樣品前處理時間，樣本通量高，溶劑使用量有所減少。

在生物樣品中，POPs 的測定通常需排除脂質的干擾，一般利用凝膠滲透色譜法或濃硫酸。本研究改進了傳統方法在萃取液中直接加入濃硫酸溶液或酸性硅膠的方法，在提取前預加入50%酸性硅膠，去除脂質的同時還可使酸性硅膠有效附著中藥材成餅狀，有利于上清液的傾倒；但酸性硅膠會吸附部分提取溶劑，需相對增加溶劑以補償回收率的損失。

3.2 SIM 模式下BFRs 殘留量分析方法的建立

在GC-NCI-MS 分析中，一般使用SIM 模式監測溴離子[Br]-（m/z 79、81）來實現定性定量，NCI-MS對溴更靈敏，但選擇性低。昆布等藻類海洋生物基質中存在一些天然的含溴化合物，對選擇監測[Br]-（m/z 79、81）作為定量離子會產生干擾。實驗過程中發現僅監測[Br]-譜圖基線較高，專屬性較差，干擾目標物質分離。在NCI 離子源全掃描模式下，PBDEs 同族物呈現順序脫溴的質譜碎片，產生一系列[HBr2]-、[MHBr]-、[M-HBr2]-、[M-HBr3]-、[M-HBr4]-的碎片離子。本研究中含有4～7 個溴取代的PBDEs，[HBr2]-（m/z 160.8）離子豐度僅次于[Br]-。據相關報道[12]，碎片離子[HBr2]-是2，4 位或2，6 位取代的PBDEs 的特征離子，且豐度隨溴原子數增加逐漸增強。具有某些特定取代位的含8～10 個溴原子PBDEs 同族物會發生醚鍵斷裂，產生[C6HxBryO]-的碎片離子豐度較大。[C6HBr4O]-（m/z 408.6）碎片離子豐度主要與鄰位溴的取代有關，八溴二苯醚BDE-202、201、197 兩個苯環上均為4 個溴取代（記為4，4 取代，下同）且鄰位均被溴取代發生醚鍵斷裂，產生m/z 408.6 碎片離子豐度略大于[Br]-；而兩個苯環為5，3 取代的八溴二苯醚BDE-203、205和4，4 取代的BDE-196 以及九溴二苯醚BDE-206（5，4 取代）的[C6HBr4O]-（m/z 408.6）離子豐度均較小，其共同點是有一個未被取代的鄰位溴。九溴和十溴二苯醚醚鍵斷裂產生[C6Br5O]-（m/z 486.6）的特征碎片離子。BDE-209 同位素峰[C6Br5O]-（m/z 492.6 理論豐度為3.1%）對13C12BDE-209 定量產生影響（[13C6Br5O]-最高豐度碎片離子為m/z 492.6），因此，選擇m/z 494.6 和496.6 作為13C12BDE-209 的定性定量離子。HBB 以分子離子峰[C6Br6]-定量，BTBPE 以醚鍵斷裂后失掉一個溴原子[C6H2Br2O]-（m/z 250.9）為定量離子，DBDPE 以[Br]-（m/z 79、81）定性定量。優化后的定量離子結合保留時間可準確測定昆布樣品中的BFRs 含量，專屬性良好。

3.3 中藥材昆布BFRs 殘留量特征

昆布樣品中普遍殘留有BFRs 污染物，其中BDE-209 和DBDPE 是主要的同族物，分別占∑PBDEs 的59.1%～95.7%、∑eBFRs 的85.6%～100%。PBDEs 同族物分布模式與報道中大型藻類的分布模式基本一致，高溴化同族物占主導[13]。廣東大亞灣和海陵灣的大型藻類樣本中∑PBDEs 濃度范圍在0.22～12.53ng·g-1，平均值為4.08ng·g-1，其中BDE-209 平均濃度為3.54ng·g-1[13]，與本研究PBDEs 含量相近。與2004 年收集自日本的海帶、裙帶菜等樣品相比，BDE-47、-100、-153 的含量相似（0.1～4.7pg·g-1），但BDE-99、-154、-183 的含量較本研究低3～10 倍（0.1～1.7pg·g-1）[14]。2011 年第五次中國總膳食研究（TDS）測定了20 個省份食物中的PBDEs，動物性食物中的PBDEs平均水平為11.5～316 pg·g-1（以濕重計），植物性食物則相對較低，平均水平為5.81～18.4 pg·g-1[3]，TDS 植物性食品的污染水平與本研究相當或略低。

PBDEs 的最高水平達30.3 ng·g-1，在福建海帶S23 中發現，其次是山東昆布S19（4.68 ng·g-1）；在浙江的昆布S3 樣品中發現eBFRs 最高含量，為8.42 ng·g-1，福建海帶S23（7.99 ng·g-1）次之。盡管目前發現的風險水平較低，但在我國溴系阻燃劑高風險地區，其對中藥材產地環境的影響應予以重視。