HNRNPU在重度少、弱精子癥的表達及其對卵泡漿內單精子顯微注射治療臨床結局的影響

梁嘉穎 曾偉宏 張杰 賴有行 黃志承 鄭毅春

廣東省婦幼保健院1生殖健康與不孕癥科，2兒童遺傳代謝與內分泌科，3檢驗科（廣州510010）

精子異常是男性不育癥的最主要病因，嚴重少、弱精子癥病因及發病機制尚未明確，是男性不育研究的熱點。精子數目異常不是一個單獨的疾病，而是多種疾病的一種臨床表現或結果。致病因素可能包括藥物、內分泌、免疫、感染、創傷等，由于重度少、弱精子癥的病因復雜，調控精子發生和運動能力的機制仍不明確，因此對此類疾病的治療尚處于經驗性治療階段［1］，嚴重的少、弱精子癥需通過卵泡漿內單精子顯微注射（ICSI）治療獲得后代。

蛋白質組學技術可以發現疾病特異性的靶點和標記物，可以提供廣泛的診斷及預后信息。近年來，相對和絕對定量的等量異位標簽（iTRAQ）多重標記?串聯質譜技術發展迅速。本研究在前期運用iTRAQ 技術篩選發現HNRNPU 蛋白為嚴重少、弱精子癥組及正常生育組的精子表達差異蛋白質，并且對HNRNPU 蛋白進行初步驗證。

在細胞核中，剪接體通用蛋白組件編碼基因HNRNPU 主要參與轉錄和剪接過程。剪接體是真核生物mRNA 前體去內含子轉變成熟工具，由5 個亞基（U1、U2、U4、U5 和U6）和150 多種結構蛋白質組成的核糖核蛋白復合物（snRNP）［2］。HNRNPU在維持染色質正常結構中起著核心作用，被認為是凋亡蛋白酶的關鍵靶點［3］。HNRNPU 缺陷會影響睪丸精原細胞分化，抑制精子發育和成熟［4］，但其相關的病理調控機制和對輔助生殖治療的預測能力尚不清楚。因此，本研究的目的是探討HNRNPU 與常規精子質量參數的相關性，及其對ICSI 臨床妊娠結局的影響。

1 資料與方法

1.1 研究對象連續收集于2019年1-12月在廣東省婦幼保健院行ICSI 治療的嚴重少、弱精子癥患者和正常孕產婦丈夫的精液標本各500例。診斷標準參照《WHO 人類精液檢驗與處理實驗室手冊》（WHO 第5 版）［5］，精子濃度≥15×106/mL，前向運動（PR）精子百分率≥32%，正常形態精子百分率≥4%為正常精子；按照本院生殖中心臨床操作規程，ICSI（嚴重少、弱精子癥）組納入標準：PR精子總數≤5×106/mL。排除標準：染色體核型異常及Y 染色體微缺失等遺傳性疾病，全身系統性疾病及先天性疾病，傳染性疾病及生殖道感染，睪丸外傷、隱睪等手術史，長期藥物或毒性物質接觸史等。所有受試者均簽署知情同意書，研究經醫院倫理委員會同意。

1.2 試劑珠海貝索生物技術有限公司精子（細胞）形態學快速染色液（Diff?Quik 法）；Sigma 公司鈣離子載體A23187，異硫氰酸熒光素標記的豌豆凝集素（FITC?PSA）；深圳博銳德生物科技有限公司精子DNA 碎片檢測試劑盒（SCD 法）和苯胺藍染色液試劑盒（核蛋白）；Vitro Life 公司SpermGrad?梯度液、SpermRinse?洗精液；北京百泰克生物技術有限公司TRIpure 總RNA 抽提試劑，Agilent 公司反轉錄試劑盒及相關軟件等。

1.3 主要儀器西班牙Microptic 公司SCA 計算機輔助精液分析系統（CASA）；美國Applied Biosys?tems 公司ABI7500 實時PCR 系統；日本Olympus 公司BX53 普通光學顯微鏡、熒光顯微鏡。

1.4 方法

1.4.1 精液采集受檢者禁欲2 ~ 7 d，手淫采集精液，隨即放置37 ℃恒溫水浴箱，1 h 內檢測。

1.4.2 精液常規按照WHO 第5 版進行精液常規參數檢測，采用CASA 系統分析精子濃度和PR%，自動計算PR 精子總數。

1.4.3 精子形態按照WHO 第5 版，采用Diff?quik染色法，普通光學顯微鏡10×100 倍計數200 條精子，計算正常精子形態百分率。

1.4.4 鈣離子載體激發頂體反應（ARIC）3~4 mL生理鹽水加入1 mL 待測精液，混勻，400 g 離心5 min，棄上清，將沉淀物加到1 mL SpermRinse 底部，上游1 h。取上游后精子加入另一管SpermRinse液中，活動精子調至1×106/mL，孵育3 h 誘導精子獲能。獲能后精子分為測定和對照管。測定管中加入足量鈣離子載體A23187，終濃度為10 μmol/L；對照管中加入等體積DMSO，37 ℃孵育15 min，3%戊二醛終止反應。400 g 離心5 min，棄上清。取沉淀20 ~ 30 μL 移至載玻片上，觀察精子密度與活動率等情況后，吸取多余液體，空氣干燥。將載玻片浸泡于95%乙醇30 min，空氣干燥。迅速加入0.1 mg/mL FITC?PSA 40 μL，水平放置4 ℃濕盒內10~12 h。蒸餾水浸泡3 次，每次2 min。熒光顯微鏡下觀察200 條熒光標記染色精子，計算ARIC%。

1.4.5 精子DNA 碎片化指數（DFI）嚴格按照試劑盒說明書操作。普通光學顯微鏡10 × 40 倍計數500 條精子，計算大暈環、中暈環（無碎片）和小暈環、無暈環（有碎片）精子的百分率。

1.4.6 精子核成熟度嚴格按照苯胺藍染色液說明書操作。普通光學顯微鏡10 × 100 倍計數200條精子，計算精子核蛋白成份中魚精蛋白（成熟精子）與組蛋白（不成熟精子）的百分率。

1.4.7 實時定量基因擴增熒光檢測系統嚴格按照TRIzol 試劑說明書提取精子總RNA［6］，使用低起始量快速擴增基因表達標記試劑盒將純化后的RNA 反轉錄成cDNA，以此cDNA 為模板在ABI7500實時PCR 系統進行PCR 擴增，以GAPDH 作為內參照，HNRNPU 的引物序列：

F：5?TGCCCAACAGAGGGAACTATAACC?3

R：5?CCTTGGTGATAATGCTGACTCCA?3

1.4.8 ICSI 治療嚴格按照診療規程對嚴重少、弱精子癥患者夫婦進行ICSI 治療，胚胎移植后第13~15 天若月經未來潮，抽血驗β?hCG、E2、P4，術后5 周做B 超確認臨床妊娠。

1.5 統計學方法應用SPSS 20.0 進行數據處理，計量數據以均數±標準差表示，兩兩比較采用t檢驗；相關性采用Spearman 秩相關分析；P< 0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 一般資料正常生育組和ICSI 組患者年齡、精液量比較，差異無統計學意義（P> 0.05），兩組精子濃度和PR 精子總數（#）比較，差異有統計學意義（P<0.01），見表1。

表1 兩組受試者分組資料比較Tab.1 The baseline semen samples characteristics of two groups ±s

表1 兩組受試者分組資料比較Tab.1 The baseline semen samples characteristics of two groups ±s

正常生育組ICSI 組t 值P 值例數500 500年齡（歲）32.0±4.1 31.4±3.9 1.004 0.206精液量（mL）2.51±1.01 2.59±0.85 1.478 0.200精子濃度（×106/mL）49.11±22.34 15.82±9.38 7.328 0.001 PR#46.21±7.17 4.50±1.08 9.635<0.001

2.2 正常生育組和ICSI組的精液質量參數比較兩組正常形態精子百分率、ARIC%、DFI、精子核成熟度比較差異有統計學意義（P< 0.01），見表2。

表2 兩組受試者精液質量參數比較Tab.2 The semen quality characteristics of two groups ±s

表2 兩組受試者精液質量參數比較Tab.2 The semen quality characteristics of two groups ±s

精子參數正常生育組ICSI 組t 值P 值例數500 500正常形態精子百分率（%）5.01±1.49 2.70±1.81 6.371 0.001 ARIC（%）6.86±1.43 2.42±1.31 6.498 0.001 DFI（%）16.58±3.37 27.30±2.69 5.358 0.002核成熟度（%）70.63±10.18 50.98±10.79 6.384 0.001

2.3 正常生育組和ICSI組的精子HNRNPU mRNA表達水平比較實時熒光定量PCR熔解曲線顯示，熔解曲線均為單峰，無引物二聚體或其他雜峰出現，表明擴增特異性良好。HNRNPU mRNA 在正常生育組和ICSI組的相對表達量分別為（0.14±0.03）、（0.38±0.04），差異有統計學意義（P<0.05），見圖1。

圖1 正常生育組和ICSI 組的精子HNRNPU mRNA 表達水平Fig.1 Relative expressions of HNRNPU mRNA in the sperm of two groups

2.4 精子HNRNPU mRNA 表達水平與其他精液質量參數的相關性精子HNRNPU 基因mRNA 的相對表達量與PR 精子總數、正常形態精子百分率、誘發頂體反應率和精子核成熟度等均存在負相關（P< 0.01）；與精子碎片化指數存在正相關（P<0.01），見表3。

表3 精子HNRNPU mRNA 表達水平與其他精液質量參數的相關性分析結果Tab.3 Correlation of different semen parameters with HNRNPU mRNA

2.5 精子HNRNPU mRNA 表達水平與ICSI 治療結局的相關性選擇研究時間內，女方采用長效長方案促排卵，并行新鮮胚胎移植的104 個ICSI治療周期，男方精子HNRNPU 基因mRNA 的相對表達量與PR 精子總數、正常受精（2PN）率存在負相關（P<0.05），與男方年齡、精液量、精子濃度、卵裂率和優質胚胎率無顯著相關（P>0.05），見表4。按患者妊娠結局分為臨床妊娠組（n= 55）和非妊娠組（n= 49）。HNRNPU mRNA 在臨床妊娠組和非妊娠組精子表達量分別為（0.36 ± 0.03）、（0.39±0.06），差異無統計學意義（P>0.05），見表5。

表4 精子HNRNPU mRNA 表達水平與ICSI 治療結局的相關性分析結果Tab.4 Correlation of ICSI outcome with HNRNPU mRNA

表5 ICSI 臨床妊娠組與非妊娠組患者基本情況和各項精液參數比較Tab.5 The patients characteristics and semen parameters of two pregnancy outcome groups ±s

表5 ICSI 臨床妊娠組與非妊娠組患者基本情況和各項精液參數比較Tab.5 The patients characteristics and semen parameters of two pregnancy outcome groups ±s

妊娠組非妊娠組t值P值例數55 49女方年齡（歲）29.0±1.6 30.3±3.2 0.564 0.773男方年齡（歲）33.5±3.8 32.8±2.7 0.782 0.609不孕年限（年）3.0±0.1 3.1±0.2 0.021 1.247女方BMI（kg/m2）20.91±2.22 20.94±1.30 0.186 0.853獲卵數（#）13.31±1.60 12.57±1.33 1.083 0.471 HNRNPU mRNA 0.36±0.03 0.39 ±0.06 0.671 0.715正常形態精子百分率（%）3.01±1.49 2.70±1.81 0.371 0.890 ARIC（%）2.86±1.43 2.42±1.31 1.498 0.225 DFI（%）27.30±9.69 27.58±4.37 1.358 0.337核成熟度（%）50.31±12.28 50.94±10.32 0.062 0.940

3 討論

據統計，全球范圍內不孕不育癥患病率約為8%~12%，其中男性因素為主要病因的約50%［7］。男性不育癥的病因復雜，主要與影響精子生成的因素有關，如遺傳因素、精索靜脈曲張和脊髓損傷等；許多不良生活方式也會損害男性生育力，如吸煙、酗酒和肥胖等。近年對不育男性精子的蛋白質組學研究揭示，無精子癥和少弱精子癥患者的精子中，精囊蛋白Ⅱ前體（semenogelin Ⅱprecursor）和硫酸糖蛋白1（clusterin isoform 1）表達下調，導致精子數量減少、活力受損［8-9］；原發和繼發性不育癥患者精子中，低表達的蛋白質均與翻譯后修飾和折疊有關，如BAG6［10］，表明蛋白質組學分析在不育癥男性精子功能評估的重要性。

本研究組前期對不同生精功能的無精子癥患者睪丸組織和嚴重少、弱精子癥患者精液精子進行蛋白鑒定和功能分析，經KEGG 數據庫注釋歸類后，與轉錄后修飾相關的剪接體代謝通路富集，發現剪接體通用蛋白組件編碼基因HNRNPU 在正常對照組與病例組的睪丸組織或精液精子之間的表達均存在顯著差異，其在生精功能低下的睪丸組織表達顯著下調，在嚴重少、弱精子癥患者精液精子表達顯著上調，提示剪接體可能參與精原細胞的形成［11］。剪接體是一類調控RNA 之間相互結合并介導前體mRNA 轉化為mRNA 的大分子復合體［12-13］。本研究目的為探討需行ICSI 的嚴重少、弱精子癥患者精液精子中HNRNPU 的表達與精子質量參數的相關性，并探討其對ICSI 臨床結局的影響。

本研究利用RT?qPCR 進一步驗證了HNRNPU mRNA 在ICSI 組（嚴重少、弱精子癥）精子中相對表達量高于正常組精子（P< 0.001），結果與轉錄組測序一致，驗證了測序結果，提示剪接體蛋白可能通過影響生精細胞的凋亡、死亡和生長而在生精過程中發揮重要作用。由于HNRNPU 在生精功能較差的睪丸組織顯著下調，使得mRNA 的轉錄后修飾第一步即無法進行，HNRNPU 在精子中表達上調可能是由于剪接功能在睪丸組織中受阻后機體代償的結果。與WU 等［4］的研究相似，其認為剪接體缺陷會影響睪丸精原細胞分化，抑制精子發育和成熟，并與非梗阻性無精子癥的發生相關。

研究還將HNRNPU mRNA 和常規精子質量參數進行了相關性分析，結果顯示精子HNRNPU mRNA 的相對表達量與PR 精子總數、正常形態精子百分率、誘發頂體反應率和精子核成熟度等均存在負相關，與精子碎片化指數存在正相關（均P< 0.01），提示其可能成為判斷精子質量的潛在分子靶標。

選擇研究時間內，女方采用長效長方案促排卵并行ICSI 治療的104 個周期，男方精子HNRNPU基因mRNA 與PR 精子總數和2PN 率存在負相關（P< 0.05），與男方年齡、精液量、精子濃度、卵裂率和優胚率無顯著相關（P> 0.05）；同時分析了臨床妊娠組和非妊娠組精子HNRNPU mRNA 表達量，差異無統計學意義（P> 0.05）。提示HNRNPU對男性生育力的作用主要是對精子生成和受精能力的影響，可能與本研究女方年齡較小、卵子質量較高、修復精子基因損傷的能力較強有關，說明ICSI 受精后，胚胎發育潛能可能與女方因素關系更大［14-15］。

在精子數< 5 × 106/mL 的不育男性中，遺傳異常的發生率是正常男性的10 倍，基因變異不可忽視［16］。精子發生需眾多基因協作，多個基因變異可導致生精阻滯［17］。因此，本研究中精子HNRN?PU mRNA 表達上調可能是嚴重少、弱精子癥發病的原因之一，對ICSI 受精率有一定的預測作用。在臨床工作中，應更多關注男性精子特異基因的變化，其可能影響生育力。