益生菌類保健食品中雙歧桿菌計數不確定度的評定

商迎輝，李夢潔，劉蕓如，黃漢昌，勞鳳學

（北京聯合大學功能因子與腦科學研究院 生物化學工程學院 北京 100191）

益生菌是對人體有益的活性菌群，能增強人體的免疫力[1]，促進腸道的健康，預防和改善腹泄等狀況[2]。其中，雙歧桿菌不但可產生B1、B2、B6、B12等多種維生素及氨基酸，還可產生有機酸，使有害菌或一些致病菌因腸內pH 值的下降而死亡。另外，益生菌必須滿足可食用性、安全性和穩定性。經過再加工生產后仍然穩定且具有活性，可以耐受胃酸、膽汁和胰酶的消化，可在體內繁殖[3]。

益生菌每日的攝入量決定其益生效果，到達腸道內的益生菌數為106CFU/g（mL）時才能對人體產生益生效果[4]。益生菌類保健食品應含有與其益生作用相對應的菌種和最低的含量值?！兑嫔惐＝∈称飞陥笈c審評規定（試行）》中規定益生菌類保健食品在其保質期內的活菌數量的最小值為106CFU/g（mL）。

不確定度是表征合理地賦予被測量值的分散性與測量結果相聯系的參數[5]?！稒z測和校準實驗室能力的通用要求》[6]和《檢測和校準實驗室能力認可準則在微生物檢測領域的應用說明》[7]中明確要求：微生物檢測實驗室應具有對測量不確定度評定的相應能力。

不確定度的評定一般用A 類評定和B 類評定來評定測量不確定度分量。其中，A 類評定用統計方法評定不確定度分量，重復性檢測引入的不確定度屬于A 類不確定度；而另一類B 類評定用任何非統計方法評定不確定度分量，儀器和設備校準引入等的不確定度屬于B 類不確定度[8]。

同時含有乳桿菌和雙歧桿菌的益生菌類保健食品中雙歧桿菌的計數是按照《食品安全國家標準 食品微生物學檢驗 乳酸菌檢驗》（GB 4789.35-2016）[9]進行，其中，樣品稀釋和加樣時既可以使用1 mL 吸管也可以使用微量移液器。其操作方便，耗材成本較低，在實驗室檢驗過程中微量移液器的使用更普遍。益生菌類保健食品中雙歧桿菌的數量較大，稀釋倍數大，由于與微量移液器相比吸量管的允差小，因此帶入的不確定度變小。本研究目的是比較以上兩種量具對雙歧桿菌計數的測量不確定度產生的影響。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

市售益生菌類保健品（同時含乳桿菌屬和雙歧桿菌屬），湯臣倍健股份有限公司；莫匹羅星鋰鹽、半胱氨酸鹽酸鹽改良的MRS 培養基，北京陸橋技術有限責任公司。

1.2 儀器與設備

1.2.1 引入B 類不確定度的儀器與設備 依據《食品安全國家標準 食品微生物學檢驗 乳酸菌檢驗》（GB 4789.35-2016）。

1）天平 感量0.01 g，依據檢定證書，量程0～25 g 時，最大允許誤差±0.025 g。

2）量筒 250 mL，依據《常用玻璃量器》（JJG 196-2006）[10]，容量允差為±2.0 mL。

3）無菌吸量管（A 類）依據 《常用玻璃量器》（JJG 196-2006），1 mL（具0.01 mL 刻度），容量允差為±0.008 mL；10 mL（具0.1 mL 刻度），容量允差為±0.05 mL。

4）微量移液器（100～1 000 μL）依據《移液器檢定規程》（JJG 646-2006）[11]，移取1 mL 時，容量允差為±0.01 mL。

1.2.2 其它設備 恒溫培養箱（36 ℃），上海博訊實業有限公司醫療設備廠；均質器，西班牙IUL 及無菌均質袋；厭氧包，日本MGC 公司。

1.3 方法

1.3.1 依據《食品安全國家標準 食品微生物學檢驗 乳酸菌檢驗進行雙歧桿菌計數》（GB 4789.35-2016）

1.3.2 雙歧桿菌計數過程

1.3.2.1 樣品稱量與制備 充分混勻樣品，按無菌操作要求稱取25.00 g，置于含225 mL 無菌生理鹽水的均質袋中，用均質器均質120 s，制成1∶10 的樣品勻液。

1.3.2.2 樣品稀釋

1）吸量管組 用1 mL 無菌吸量管吸取1∶10 樣品稀釋液1 mL，沿管壁緩緩注入含有9 mL無菌生理鹽水的試管內，充分振搖后制成1∶100的樣品稀釋液。按上述操作，依次作10 倍系列稀釋。

2）移液器組 使用微量移液器進行上述操作。

1.3.2.3 加樣

1）吸量管組 選擇3 個適宜的連續稀釋度，每個稀釋度用1 mL 無菌吸量管吸取1 mL 樣品稀釋液于無菌平皿內，每個稀釋度做2 個平皿。

2）移液器組 使用微量移液器進行上述操作。

1.3.2.4 培養與計數 稀釋液被移入平皿后，將冷卻至48 ℃的莫匹羅星鋰鹽和半胱氨酸鹽酸鹽改良的MRS 培養基傾注平皿約15 mL，轉動平皿使之混合均勻。從樣品稀釋到平板傾注在15 min內完成。36 ℃厭氧培養72 h。培養后計數平板上的所有菌落數。

2 結果與分析

2.1 雙歧桿菌菌落計數

選取菌落數在30～300 CFU 范圍，無蔓延菌落生長的平板計數雙歧桿菌菌落總數。

2.2 結果表述

只有一個稀釋度平板上的菌落數在計數范圍，計算2 個平板上的菌落數平均值，將平均值乘以相應稀釋倍數，作為每克樣品中雙歧桿菌菌落數。

2.3 不確定度的評定

2.3.1 樣品重復性檢測引起的A 類不確定度 依據《食品安全國家標準 食品微生物學檢驗 乳酸菌檢驗》（GB 4789.35-2016），對同一含乳桿菌和雙歧桿菌的保健食品做10 次獨立測試，結果只有稀釋度為108的雙歧桿菌菌落數在計數范圍。由于每克樣品中雙歧桿菌的數量在109數量級，因此對試驗數據取對數進行A 類不確定度的評定[12-14]。

2.3.1.1 吸量管組 按貝塞爾公式計算檢驗結果對數值標準差：

式中，S——標準差；xi——第i次測量的測得值；——n次測量所得一組測得值的算數平均值。

相對標準不確定度為：

式中，urel（）——相對標準不確定度；u（）——標準不確度；——n次測量所得一組測得值的算數平均值。

2.3.1.2 移液器組 按貝塞爾公式計算出檢驗結果對數值標準差：

相對標準不確定度為：

2.3.2 B 類不確定的度評定[15-17]

2.3.2.1 樣品制備過程中引入的不確定度 用天平（精度0.01 g）稱取25.00 g 樣品，由天平檢定證書可知，最大允許差為±0.025 g。按級使用的數字儀表、測量儀器最大允許誤差導致的不確定度屬于矩形（均勻）分布，天平引入的標準不確定度為：

相對不確定度為：

用容量250 mL 的量筒量取225 mL 無菌生理鹽水，加入樣品中制備樣品勻液?！冻Ｓ貌ＡЯ科鳌罚↗JG 196-2006）規定，250 mL 量出式量筒的容量允差為±2.0 mL。取矩形分布，量筒引入的標準不確定度為：

相對不確定度為：

以上2 項合成可得樣品制備過程中引入的相對合成不確定度為：

2.3.2.2 樣品稀釋過程中引入的不確定度

1）吸量管組 樣品10 倍系列稀釋方法：吸取樣品1 mL 加入9 mL 稀釋液中。依據《常用玻璃量器》（JJG 196-2006），1 mL（具0.01 mL 刻度），容量允差為±0.008 mL。取矩形分布，其標準不確定度為：

相對不確定度為：

10 mL 吹出式（A 類）分度吸量管容量允差為±0.05 mL，取矩形分布，其標準不確定度為：

相對不確定度為：

該過程產生的相對不確定度U稀釋依據泊松關于微生物培養產生的不確定度定量測定理論中的公式計算：

因樣品的梯度稀釋方法相同，則=k×，k為10 倍系列梯度稀釋的次數，本試驗中雙歧桿菌計數的稀釋倍數是108，則k=7。

2）移液器組 根據 《移液器檢定規程》（JJG 646-2006）規定，100～1 000 μL 移液器吸取1 000 μL 時容量允差為±1 000 μL×1.0%=0.01 mL，取矩形分布，其標準不確定度為：

相對不確定度為：

10 mL 吹出式（A 類）分度吸量管容量允差為±0.05 mL，取矩形分布，其標準不確定度為：

該過程產生的相對不確定度U稀釋依據泊松關于微生物培養產生的不確定度定量測定理論中的

公式計算：

2.3.2.3 加樣過程引入的不確定度

1）吸量管組 用吸量管吸取1 mL 樣品稀釋液加入平板，加樣引入的相對不確定度等同于稀釋樣品過程中吸取1 mL 產生的相對不確定度。

U（1mL）=0.0046，U加=0.0046

2）移液器組 用移液器吸取1 mL 樣品稀釋液加入平板，加樣引入的相對不確定度等同于稀釋樣品時吸取1 mL 產生的相對不確定度。

U（1ml）=0.0058，U加=0.0058

2.3.3 合成不確定度

2.3.3.1 吸量管組 雙歧桿菌計數的合成相對不確定度為：

則合成不確定度為：

2.3.3.2 移液器組 雙歧桿菌計數的合成相對不確定度為：

則合成不確定度為：

2.3.4 擴展不確定度 測定結果按正態分布估計，置信水平為95%時，包含因子k=2。擴展不確定度可由合成不確定度乘以包含因子獲得，U吸量管=2×0.14=0.28，U移液器=2×0.18=0.36。

2.3.5 不確定度結果計算 當包含率在95%時，保健食品樣品中雙歧桿菌計數結果的擴展不確定度U吸量管為0.28，X=±U吸量管。以吸量管作為稀釋和加樣量具，樣品中雙歧桿菌計數的對數X值區間為9.35～9.91。取反對數后，其取值為（2.2～8.1）×109CFU/g，樣品雙歧桿菌總數的置信區間為（2.2～8.1）×109CFU/g。同樣，以移液管作為稀釋和加樣量具，樣品中雙歧桿菌計數的對數X值區間為9.43～10.15。取反對數后，其取值為（2.7～14）×109CFU/g，樣品雙歧桿菌總數的置信區間為（2.7～14）×109CFU/g。

2.4 數據分析

2.4.1 兩種量具對雙歧桿菌計數結果（對數值）的影響 使用MATLAB 軟件對吸量管組和移液器組雙歧桿菌計數結果對數值（見表1、表2）進行方差分析（ANOVA）。ANOVA 箱形圖見錯誤！ 未找到引用源。ANOVA 計算結果見圖2，結果中P=1.2816×10-4，證明兩組數據差異非常明顯。

圖1 ANOVA 箱形圖Fig.1 ANOVA boxplot

圖2 MATLAB 軟件中ANOVA 分析結果Fig.2 ANOVA result from the MATLAB analysis

表1 吸量管組雙歧桿菌計數結果（×108 CFU/g）Table 1 Counting result of the Bifidobacterium using pipette（×108 CFU/g）

表2 移液器組雙歧桿菌計數結果（×108 CFU/g）Table 2 Counting result of the Bifidobacterium using micropipettor（×108 CFU/g）

2.4.2 兩種量具對雙歧桿菌計數結果不確定度的影響 除A 類不確定度外，吸量管組樣品稀釋和加樣引入的不確定度以及置信區間均略小于移液器組。

表3 兩種量具對雙歧桿菌計數結果不確定度的影響Table 3 The influence of the two different tools to the uncertainty of counting the Bifidobacterium

3 討論

依據《食品安全國家標準 食品微生物學檢驗乳酸菌檢驗》（GB 4789.35-2016）[9]對益生菌類保健食品中的雙歧桿菌計數，其中樣品稀釋和加樣既可使用1 mL 吸量管也可使用微量移液器。由于益生菌類保健食品中雙歧桿菌的數量較大，稀釋倍數大，因此引入的不確定度均較大。稀釋過程中使用吸量管與移液器相比，使用吸量管帶入的不確定度略小，且使用吸量管對加樣過程帶入的不確定度、合成相對標準不確定度和擴展不確定度均略小，而使用吸量管對A 類不確定度的影響比使用移液器略大。另外，使用兩種量具對同一益生菌類保健食品中雙歧桿菌進行計數，結果差異顯著。應進一步分析產生差異的原因，使用哪種量具計數結果更為準確，以及如何縮小或消除這種差異。