水體原位修復中沉水植物化感物質的分離與鑒定

張之浩, 李威, 吳曉芙

1.長沙環境保護職業技術學院 2.中南林業科技大學生命科學與技術學院

無需轉移水體而直接在原位進行生態治理的原位生態修復技術，因其高效益低成本的優勢而得以在污染水體修復的眾多方法中備受關注[1]。其中富營養化水體治理是污水原位生態修復的關鍵環節[2-5]。富營養化水體中優勢藻類如藍綠藻的爆發增長是造成污染進一步加劇的原因[6-7]，而沉水植物在生長過程中可以通過釋放一些化感物質直接或間接影響藻類的生長[8-11]，沉水植物的根、莖、葉均能吸收和富集水體中的營養元素，在通過根部釋放氧氣增加水中含氧量的同時改善好氧生物的生長環境進而影響污染物的生物降解過程，達到水質凈化、水環境改善、系統穩定性得以提升的效應[12-14]。

目前的研究多集中于探明挺水植物在污染水體原位生態修復中的功效與機理[15]，而聚焦于沉水植物抑藻效應的研究較少，已有的報道也多僅限于關注單一沉水植物的抑藻作用與機理研究。由于實際水體中污染情況復雜多樣、不具統一性，且污染水體中優勢藻類種類較多，加之沉水植物的生長易受外界環境因素的影響[16]，故沉水植物的抑藻作用也因植物種類的不同而有所差異。此外，化感物質的抑藻周期有限，故而在實際水體修復中應用單一沉水植物對藻類進行抑制的效果不佳，難以進行持續且穩定的水體修復。1949年Hasler等[17]首次發現水生植物的抑藻現象，此后便引發了植物抑藻作用的研究熱潮。當前的研究普遍認為抑藻作用是由植物分泌的化感物質實現的，研究者也順利從狐尾藻、金魚藻、鳳眼蓮、蘆葦、苦草等水生植物的水培液中提取出多種化感抑藻物質，并證實了其抑藻作用[18-19]。作為植物的分泌產物，化感物質是聯系生物與環境的紐帶，植物化感物質對周圍環境的影響是環境生態領域的研究熱點，在相關研究中已有不少化感物質被分離提純出來[20]。

筆者選取狐尾藻、苦草、黑藻、金魚藻和伊樂藻5種沉水植物，通過對各沉水植物的水培液進行物質結構的鑒定分析，對各水培液中化感抑藻物質進行定性、定量分析，進而探明不同種類化感物質抑藻的作用機理，以期為后續研發高效抑藻劑進而加強污染水體原位生態修復的效果提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 沉水植物水培液樣本

在5個半徑30 cm，深40 cm的干凈水缸中加入15 L Hoagland(0.25×)營養液，選取根、莖、葉完整且葉色正常，長勢較好的狐尾藻、苦草、伊樂藻、黑藻和金魚藻5種沉水植物各150 g(鮮質量)放入水缸中，各沉水植物的生物量為10 g/L。將水缸放置在陽光棚(15～25 ℃)中進行為期10 d的沉水植物培養。沉水植物在培養前需用蒸餾水反復沖洗以去除植株上的附著物，每次沖洗時間至少達10 min[21]。

1.2 水培液的濃縮提取

選用循環水式真空泵(上海予華)及玻璃纖維膜對5種沉水植物的水培液(各10 L)進行抽濾，調節濾液pH為2～3，將濾液過waters Oasia HLB固相萃取小柱(500 mg，6 cm，GILSON固相萃取儀，使用前需用甲醇和水進行活化)，每個小柱富集1 L水后用甲醇溶液進行洗脫，合并所有洗脫液于旋轉蒸發儀蒸至近干，再用250 mL超純水進行溶解，用2 mol/L NaOH調節溶液pH到12。配置50 mL的正己烷和乙酸乙酯(體積比為1∶1)萃取試劑，合并萃取液，用無水硫酸鈉干燥后再于旋轉蒸發儀蒸至近1 mL，經濾膜過濾后備用。

1.3 GC-MS測定與數據處理

采用GC-MS(島津GC-MS QP2010plus串聯質譜儀)來同步檢出提取液中存在的包括有機酸類、醇類、酚類、醛類和酯類等物質種類和含量，毛細管色譜柱為HP-5ms(60 m×0.25 mm×0.25 mm)，用全掃描模式進行定性分析，載氣為氦氣，流速為1.0 mL/min，不分流進樣，進樣量1 μL。色譜分析條件如下：進樣口溫度280 ℃，初始溫度60 ℃(1 min)，以8 ℃/min升至280 ℃，保持10 min。MS條件如下：EI離子源，溫度230 ℃，四級桿溫度150 ℃，電子能量70 eV，質譜掃描范圍50～450 amu。選用其內置的GC-MS再解析程序對數據進行分析處理，樣品各組分采用峰面積歸一化法定量，參照NIST05及NIST05s標準譜庫鑒定各組分的化學結構。

2 結果與分析

2.1 狐尾藻水培液中化感物質的測定

狐尾藻水培液檢出成分色譜圖及檢出成分信息如表1所示。由表1可見，狐尾藻水培液共有16種有機化合物的匹配度超過70%，其中鑒定出的有機酸類物質有6種，含量占比為4.71%；醇和酚類物質共5種，含量占比為2.06%；酮和酯類物質有5種，含量占比為2.65%。其中匹配度在90%及以上的有乙酰丙酸(95%)、2-乙基己酸(97%)、癸二酸(96%)、α-甲基苯乙醇(92%)、2-乙基己醇(98%)和2,2-二甲基辛醇(97%)。檢出含量占比較大的有機酸類為琥珀酸(2.36%)，醇和酚類為α-甲基苯乙醇(0.56%)，酮和酯類為2-羥乙基甲酸酯(1.13%)。

表1 狐尾藻水培液的正己烷乙酸乙酯提取液中的主要成分Table 1 Major components of n-hexane and ethyl acetate extracts of Myriophyllum verticillatum hydroponic solution

2.2 苦草水培液中化感物質的檢測

苦草水培液檢出成分色譜圖及檢出成分信息如表2所示。由表2可見，共有18種有機化合物的匹配度超過70%。其中鑒定出的有機酸類物質有10種，含量占比為2.66%；醇和酚類物質有5種，含量占比為1.02%；酮和酯類物質有3種，含量占比為0.70%。其中匹配度在90%及以上的有琥珀酸(96%)、乳酸(94%)、2-甲基-2,4-戊二醇(94%)和1-己酮(97%)。檢出含量占比較大的有機酸類為癸酸(0.6%)、烏頭酸(0.46%)，醇類為2-乙基己醇(0.31%)，酯類為鄰苯二甲酸二異辛酯(0.32%)。

表2 苦草水培液的正己烷乙酸乙酯提取液GC-MS分析主要成分Table 2 Major components of n-hexane and ethyl acetate extracts of Vallisneria natans hydroponic solution

2.3 伊樂藻水培液中化感物質的測定

伊樂藻水培液檢出成分色譜圖及檢出成分信息如表3所示。由表3可見，共有12種有機化合物的匹配度超過70%。其中鑒定出的有機酸類物質有8種，含量占比為3.64%；酚類物質有1種，含量占比為0.13%；酯類物質有3種，含量占比為1.19%。其中匹配度在90%及以上的有甲基丁二酸酐(92%)、對羥基苯甲酸(93%)、2,2′-亞甲基雙-(4-甲基-6-叔丁基苯酚)(91%)和鄰苯二甲酸單(2-乙基己基)酯(99%)。檢出含量占比較大的有機酸類為三乙基乙酸(0.75%)、壬二酸(0.73%)和反式阿魏酸(0.71%)，酯類為鄰苯二甲酸單(2-乙基己基)酯(0.83%)。

表3 伊樂藻水培液的正己烷乙酸乙酯提取液GC-MS分析主要成分Table 3 Major components of n-hexane and ethyl acetate extracts of Elodea Canadensis hydroponic solution

2.4 黑藻水培液中化感物質的測定

黑藻水培液檢出成分色譜圖及檢出成分信息如表4所示。由表4可見，共有13種有機化合物的匹配度超過70%。其中鑒定出的有機酸類物質有10種，含量占比為7.14%；醇類物質有2種，含量占比為2.7%；酯類物質有1種，含量占比為0.68%。其中匹配度在90%及以上的有乙酰丙酸(91%)、壬酸(97%)和苯甲酸(92%)，檢出含量占比較大的有機酸類為反式烏頭酸(1.21%)和甲基丁二酸酐(1.09%)，醇類為苯乙醇(1.77%)。

表4 黑藻水培液的正己烷乙酸乙酯提取液GC-MS分析主要成分Table 4 Major components of n-hexane and ethyl acetate extracts of Hydrilla verticillata hydroponic solution

2.5 金魚藻水培液中化感物質的測定

金魚藻水培液檢出成分色譜圖及檢出成分信息如表5所示。由表5可見，共有15種有機化合物的匹配度超過70%。其中鑒定出的有機酸類物質有5種，含量占比為1.51%；烴類物質有1種，含量占比為0.21%；醇類物質有4種，含量占比為2.15%；酮和酯類物質有5種，含量占比為9.79%。其中匹配度在90%及以上的有正丁醇(95%)、2-乙基己醇(93%)、環己酮(97%)、2-羥乙基甲酸酯(98%)、鄰苯二甲酸二異丁酯(96%)和己二酸二(2-乙基己)酯(91%)。檢出含量占比較大的有機酸類為癸酸(0.44%)和對羥基苯乙酸(0.43%)，醇類為α-甲基苯乙醇(0.70%)，酯類為2-羥乙基甲酸酯(5.24%)。

表5 金魚藻水培液的正己烷乙酸乙酯提取液GC-MS分析主要成分Table 5 Major components of n-hexane and ethyl acetate extracts of Ceratophyllum demersum hydroponic solution

3 討論

3.1 5種沉水植物水培液的成分比較分析

在5種沉水植物的水培液中共檢出56種化合物，主要為有機酸類、酯類、醇類化合物及少量酚類、酮類物質。其中按各水培液中檢出的化合物數量排序，表現為苦草(18)>狐尾藻(16)>金魚藻(15)>黑藻(13)>伊樂藻(12)。狐尾藻、苦草、伊樂藻和黑藻分泌的有機酸類物質含量占比高于其他檢出物質，而金魚藻的水培液檢出物中酮和酯類物質含量占比較高。

3.2 5種沉水植物化感抑藻效果分析

筆者在之前的研究中[3,21]將5種沉水植物種植于自然環境的富營養化水體中(優勢藻類為綠藻和硅藻)，對比研究了狐尾藻、苦草、黑藻、金魚藻和伊樂藻的化感抑藻效應，相關趨勢如圖1、圖2所示。由圖1可見，在狐尾藻、苦草、黑藻和金魚藻4種沉水植物的種植水中，浮游藻類的葉綠素a濃度隨培養時間的增加呈逐步降低的趨勢，且濃度均低于對照組，表明由沉水植物釋放出的化感物質可進入藻細胞內降解葉綠素a，進而導致浮游藻類的光合過程受阻，從而抑制浮游藻類的生長。從浮游藻類的抑制率來看〔圖2(a)〕，除伊樂藻外，其余4種沉水植物對水中浮游藻類均有較明顯的抑制作用，從抑制率的不同可證實由沉水植物分泌的次生代謝產物的種類和數量因植物種類的不同而存在差異。而由浮游藻類的相對生長速率曲線〔圖2(b)〕的動態變化分析可得，金魚藻處理下的浮游藻類的相對生長速率曲線變化波動較大,觀察到浮游藻類的相對生長速率先隨時間增加呈下降趨勢，隨后出現了上升的現象。

圖1 各處理下浮游藻類葉綠素a濃度Fig.1 Chlorophyll a contents of phytoplankton under each treatment

圖2 各處理下浮游藻類生長的抑制率和相對生長速率Fig.2 Inhibiting rate and relative growth rate of phytoplankton under each treatment

3.3 5種沉水植物化感抑藻物質分析

通過對5種沉水植物水培液成分進行鑒定和分析，發現各沉水植物所分泌化感物質的主要成分和可能的抑藻機理如表6所示。

表6 5種沉水植物可能的化感物質及抑藻機理Table 6 Possible allelochemicals and algal inhibition mechanisms of 5 submerged macrophytes

已有多個研究證實了有機酸類物質具有抑藻效應，亦已證明碳原子數為2～22的飽和及不飽和脂肪酸均能抑制藍藻和綠藻活性[22]，劉曉宇等[23]從美人蕉葉片中鑒定出了32種有機酸組分，并通過試驗驗證了其對銅綠微囊藻的抑制作用，且不同濃度的有機酸組分對銅綠微囊藻的生長呈現出的“低促高抑”現象。張庭廷等[24]探究了17種不同脂肪酸類物質對產毒銅綠微囊藻、蛋白核小球藻和斜生柵藻的抑藻作用，結果表明各脂肪酸對這3種藻類均呈現出不同程度的抑藻效應，且脂肪酸類物質的抑制作用與其物質結構相關。而該作者的另一研究[25]發現，加入對羥基苯甲酸會使銅綠微囊藻細胞膜出現腫脹現象，隨著處理時間的增長細胞最終破碎溶解，進而抑制了銅綠微囊藻的生長。結合本研究中5種沉水植物水培液中鑒定出的有機酸物質進行推測，即琥珀酸、檸檬酸、乳酸、癸酸、壬酸、壬二酸、硬脂酸、月桂酸、對羥基苯甲酸、棕櫚酸、阿魏酸、油酸具有一定的化感抑藻作用。雖有研究證實阿魏酸、順式阿魏酸和順式烏頭酸具有抑藻效應，但鮮有文獻對反式阿魏酸和反式烏頭酸的抑藻效應進行探究，且順反異構體的化學生理活性存在差異，故反式阿魏酸和反式烏頭酸是否存在抑藻效應仍需進一步探明。檢出的其他有機酸物質如乙酰丙酸和2-乙基己酸的抑藻能力也有待進一步的研究。

王立新等[26]發現用不同有機溶劑對黑藻養殖水進行萃取提純得到的組分對銅綠微囊藻的抑制作用程度有所差異，其中乙醚提取物對藻類的抑制作用大于乙酸乙酯提取物，而石油醚提取物近乎無抑藻作用。進一步的研究發現，乙醚提取物對銅綠微囊藻的抑制率隨提取物濃度的升高而增大。此外，對乙醚提取物進行GC-MS分析共鑒定出9種組分，其中3種酯類化合物(鄰苯二甲酸二丁酯、鄰苯二甲酸二異辛酯、鄰苯二甲酸丁脂2-甲基丙酯)的含量占到總提取物的60%以上。劉光濤等[27]研究了鳳眼蓮根系分泌的5種明確具有抑藻效應的化感物質對銅綠微囊藻和斜生柵藻的抑制作用，探究了化感物質種類、劑量和不同的藻類培養方式下抑藻作用的差異。發現低劑量的亞油酸甘油酯在藻類混合培養情況下對藻類的生長具有促進作用，而高劑量時則表現出明顯的抑制傾向，當培養液中亞油酸甘油酯濃度為10 mg/L時，起初等比例培養的銅綠微囊藻和斜生柵藻的相對密度發生了改變，即斜生柵藻在混合培養液中的占比有所增加。張楠等[28]探究了棕櫚酸、琥珀酸和乙酸丁酯分析純溶劑的不同組合方式對蛋白核小球藻的抑制作用，發現3種物質組合應用情況下抑藻效應最佳。結合本研究的檢測結果分析水培液中鑒定出的鄰苯二甲酸二異丁酯和乙酸丁酯對抑藻作用具有一定的貢獻。

張玲[29]在研究時發現采用乙醚萃取鹽京九號水稻(OryzasativaL. Yanjing 9)的水稻水培液和水稻秸稈水浸液，對銅綠微囊藻的抑藻效果最佳，通過分離乙醚萃取液中的組分可鑒定出含有機酸類物質、堿性物質和中性物質及酚類物質等。高為等[30]以苯酚為例研究了酚類、醇類物質對斜生柵列藻生長的影響，發現藻濃度隨苯酚濃度增大而減小，即藻類細胞受到的抑制作用隨苯酚濃度的增大而加強。本研究中檢測鑒定出的少量醇類和酚類物質可能也具備化感抑藻效應。

已有研究表明，植物的抑藻現象可能是受其分泌的多種化感物質的聯合作用導致的。高云霓等[31]在苦草分泌物中檢測鑒定出9種酚酸，并對其中6種酚酸混合后應用的抑藻效應進行了研究，發現抑藻作用隨混合的酚酸種類增多而加強。張庭延等[32]研究結果也表明，對羥基甲苯酸和阿魏酸的聯用對水花魚腥藻和蛋白核小球藻的抑制均具有協同效應。本研究也在各沉水植物的不同水培液中檢測鑒定出了多類化感物質，因而推測不同沉水植物分泌的多種化感物質之間的相互作用造成了最終的抑藻現象。

4 結論

(1) 共有56種化合物在水培液中被檢出，其中檢出最多的是有機酸類物質。共檢出30種有機酸物質，含量占比為0.11%～2.36%；其中，酯類物質12種，含量占比為0.14%～5.24%；醇類物質7種，含量占比為0.07%～1.77%；酚類物質4種，含量占比為0.13%～0.39%；酮類和乙基苯類物質3種，含量占比為0.2%～1.33%。

(2) 推測狐尾藻水培液中檢測鑒定出的琥珀酸、檸檬酸和苯酚為主要的化感物質，苦草水培液中的乳酸、癸酸、壬二酸、硬脂酸、月桂酸和苯酚發揮主要的抑藻作用，伊樂藻水培液中的主要化感物質為壬二酸、對羥基苯甲酸和棕櫚酸，黑藻和金魚藻水培液中發揮抑藻作用的物質為壬酸、阿魏酸和癸酸、油酸、乙酸丁酯和鄰苯二甲酸二異丁酯。

(3) 狐尾藻、苦草、伊樂藻和黑藻4種沉水植物的水培液中有機酸類物質的含量占比高于其他檢出物質，推測有機酸類物質是起主要抑藻作用的化感物質。而金魚藻中酯類物質的含量占比為8.49%，酯類物質在金魚藻抑藻現象中可能發揮主要作用，有機酸類物質影響次之。沉水植物對藻類的抑制作用可能是多種化感物質聯合作用的結果，但其相互作用機理仍待進一步的研究。