1株豬鼻支原體的分離鑒定及致病性

王 佳，華利忠，劉蓓蓓，張 磊，袁 廳，甘 源，韋艷娜，邵國青,3，馮志新，熊祺琰,2*

(1.江蘇省農業科學院獸醫研究所/農業部獸用生物制品工程重點實驗室，南京 210014；2.江蘇大學生命科學學院，鎮江 212013；3.江蘇大學食品與生物工程學院，鎮江 212013)

豬鼻支原體(Mycoplasmahyorhinis，Mhr)是豬上呼吸道的一種常見寄生菌，在豬群中廣泛流行，尤其是在斷奶仔豬及生長豬中感染率極高[1-2]。豬群感染豬鼻支原體后通常不表現出明顯的臨床癥狀，但特定情況下可以引起仔豬的多發性漿膜炎、關節炎、結膜炎、中耳炎等癥狀，在大豬中則主要引發關節炎。同時豬鼻支原體在臨床中常與其他病原菌混合感染，有報道顯示豬鼻支原體在與豬繁殖與呼吸綜合征病毒或豬圓環病毒共感染時會加重對肺部的損傷[3-4]。目前國內養豬行業對豬鼻支原體認識較少，因其與副豬嗜血桿菌感染引起的臨床癥狀極其相似，常因誤診導致豬鼻支原體在豬場內的持續性感染，造成豬群生產性能下降，產生嚴重經濟損失。由于豬鼻支原體感染的普遍性，臨床常用抗生素已產生了一定的耐藥性[5]。目前豬鼻支原體致病機制尚不清楚，缺乏特異性血清診斷試劑盒，亦無商品化疫苗。

感染模型是致病機制研究和疫苗研發的基礎。從20世紀60年代開始陸續有多家研究機構對豬鼻支原體發病模型開展研究，但至今為止尚沒有標準的攻毒方法或菌株。本實驗室從安徽某豬場的發病豬關節液中分離得到一株支原體，經PCR鑒定為豬鼻支原體。將該菌株人工感染自然分娩不吃初乳豬(SF-pCD豬，snatch-farrowed, porcine-colostrum-deprived pigs)，成功建立感染模型，為研究豬鼻支原體的致病機制及疫苗奠定了重要基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 主要試劑 PCR試劑、DNA分子量標準購自南京諾維贊生物科技股份有限公司；細菌基因組DNA提取試劑盒購自天根生化科技(北京)有限公司；KM2培養基由本實驗室自制。

1.1.2 實驗動物 試驗豬選用1月齡SF-pCD豬(杜長大三元豬)9頭，由本實驗室和南京洲邦生物科技有限公司聯合培育。試驗豬使用前經PCR/RT-PCR方法和血清抗體檢測確定豬偽狂犬病病毒(PRV)、豬繁殖與呼吸綜合征病毒(PRRSV)、豬鼻支原體(Mhr)、豬肺炎支原體(Mhp)抗原、抗體均為陰性。

1.1.3 病料來源 病料采集自安徽省合肥市某豬場，該豬場20%左右保育豬出現精神沉郁、被毛粗亂、食欲下降，跛行及關節腫大的癥狀，期間使用阿莫西林、頭孢噻呋等藥物治療無效，判斷可能存在豬鼻支原體強毒株感染。選擇關節腫脹的發病豬，于無菌條件下抽取關節液用于后續支原體的分離。

1.2 方法

1.2.1 豬鼻支原體的分離培養 將關節液用KM2培養基稀釋10倍，用0.45 μm無菌濾器過濾除菌，將濾液按1∶10的比例接種入KM2培養基中，置37 ℃培養箱中靜置培養，每天觀察培養物顏色的變化。

1.2.2 培養物鑒定 待培養物由紅色變為黃色后，利用細菌基因組提取試劑盒按說明書操作進行培養物基因組的提取。采用本實驗室以P37基因為靶標建立的套式PCR方法進行初步鑒定[6]，然后利用英聰[7]以16S rRNA基因為靶標建立的PCR方法進行再次確認，所用到的引物序列及PCR參數見表1。測序后通過BLAST與NCBI公布的豬鼻支原體相關序列信息進行比對。

表1 引物信息

1.2.3 菌株純化及形態觀察 將新鮮的豬鼻支原體分離株菌液作104倍稀釋后涂布KM2固體平板，置于37 ℃靜置培養，進行連續3次單克隆。3次 單克隆后用體視顯微鏡觀察菌落形態。將新鮮培養的豬鼻支原體菌液離心收集菌體，用磷酸緩沖液洗滌兩次后，用2.5%戊二醛電鏡固定液固定，用于電鏡觀察其顯微形態。

1.2.4 MLST分析 參考文獻方法設計合成豬鼻支原體6個看家基因(adk、gmk、gltX、rpoB、dnaA、gyrB)的引物序列，進行多位點序列分型(multilocus sequence typing，MLST)分析[8]。PCR擴增結束后將擴增產物進行測序，測序結果上傳至https://pubmlst.org/進行比對，獲得6個看家基因的等位基因數值和ST型。

1.2.5 分離菌株的致病性試驗 選擇9頭1月齡SF-pCD三元豬進行豬鼻支原體分離株毒力評價試驗。試驗方法：試驗豬隨機分為感染組(6頭)和對照組(3頭)，置于隔離房間分開飼養。將新鮮培養的HEF16 分離株10倍濃縮后，用磷酸鹽緩沖液進行重懸，感染組經氣管注射、腹腔注射、肺內注射和滴鼻四個途徑共接種109CCU(color change unit，顏色變化單位)的HEF16 分離株[9]。每個途徑接種2 mL(2.5×108CCU)，共8 mL。對照組用磷酸鹽緩沖液取代菌液，采用相同途徑及體積進行接種。攻毒后每天觀察臨床癥狀并記錄，每周測定試驗豬體重并采血。血清樣品用本實驗室建立的Vlp-ELISA豬鼻支原體血清抗體檢測方法進行IgG抗體的測定[10]。試驗豬于感染21 d后剖殺，觀察病變情況，參考文獻[11]方法進行關節炎、心包炎、胸膜炎、腹膜炎的評分，具體評分方法見表2。采集含有支氣管的肺組織塊進行組織固定，切片后HE染色(hematoxylin-eosin staining)，觀察。同時，采集心、肺、扁桃體和關節積液進行豬鼻支原體的再分離，并對分離得到的豬鼻支原體進行MLST分析。如試驗過程中出現死亡，立即剖檢。

表2 豬鼻支原體感染豬剖檢評分表

1.2.6 統計方法 利用SPSS20.0軟件對試驗數據進行T檢驗分析，P<0.05判定為具有明顯統計學差異。

2 結 果

2.1 豬鼻支原體分離鑒定及分離株MLST分析

采集發病豬關節液樣品，用KM2培養基進行菌株分離，平行接種3瓶，結果均在第3天時出現由紅變黃的顏色變化。收集培養物，提取核酸后分別進行豬鼻支原體P37基因及16S rRNA基因的PCR鑒定，結果如圖1所示。3份分離培養物的P37基因的外套和內套PCR產物分別在627和346 bp處出現了特異性條帶(圖1 A、B)，16S rRNA基因PCR產物在826 bp處出現特異性條帶(圖1 C)。取產物進行測序，將測序結果與GenBank中收錄的豬鼻支原體序列進行比對，相似性為99.3%，證明分離獲得的菌株為豬鼻支原體。將其中一份培養物接種固體培養基，5 d后生長出單菌落，菌落呈典型的煎蛋狀，直徑約0.4 mm(圖1 D)。離心收集菌體，用掃描電鏡觀察，菌體呈球形，直徑約400 nm(圖1 E)。對單克隆后的菌株再次進行PCR驗證，并正式命名為豬鼻支原體HEF16株。

A.P37 PCR外套試驗結果；B.P37 PCR內套試驗結果；C.16S rRNA PCR試驗結果；M.DL2000 DNA相對分子質量標準; 1.豬鼻支原體陽性對照；2.陰性對照；3～5.3份分離樣品；D.固體菌落形態；E.菌體形態(掃描電鏡)

對豬鼻支原體HEF16株的6個看家基因進行測序，結果通過網站中的數據庫進行比對，確定了6個 看家基因的等位基因數值，具體見表3。ST型在現有數據庫中未有匹配，說明該豬鼻支原體分離株屬于一個新基因型。

表3 豬鼻支原體分離株MLST分型結果

2.2 感染后臨床癥狀觀察及體重變化

豬鼻支原體感染組6頭豬在感染后的第4天開始均出現后肢關節輕度腫脹，食欲出現下降；感染7 d 后，多個關節出現中度腫大，跛行，食欲差，關節觸診疼痛；感染14 d后，試驗豬行動困難，消瘦，臥地不起，2頭試驗豬死亡；攻毒后17 d，另有1頭試驗豬死亡，剩余3頭試驗豬中有2頭狀態出現好轉。對照組的3頭豬均未出現臨床癥狀(圖2 A、B)。

豬鼻支原體感染后每7 d對試驗豬進行體重測定，結果發現感染組豬生長緩慢，在攻毒后14～21 d體重下降明顯，平均日增重為負值。對照組試驗豬隨著日齡的增加，體重持續上升，平均日增重達0.3 kg·d-1。攻毒組與對照組豬日增重差異顯著(圖2 C)。

A.感染組關節腫脹；B.對照組關節；C.日增重變化測定(**.P<0.01)

2.3 感染豬的大體與顯微病變觀察

豬鼻支原體感染21 d后對試驗豬進行剖檢觀察，并進行關節炎、心包炎、胸膜炎以及腹膜炎評分。由表4可知，攻毒組6頭豬均出現了胸膜炎、心包炎及關節炎，其中2頭豬出現了腹膜炎(圖3A)。胸膜炎、心包炎、關節炎以及腹膜炎的平均分值分別為2.3分、2.3分、3分以及0.5分。對照組3頭豬均未出現上述病變，評分均為0。

表4 豬鼻支原體感染豬剖檢發病情況及評分統計

肺肉眼變化顯示感染組肺黏連嚴重，未出現肺臟實變的情況(圖3 B1)。顯微觀察顯示肺間質增寬，淤血，肺泡內有漿液性和纖維素性滲出(圖3 C1)，支氣管黏膜層杯狀細胞增多(圖3 C2)。對照組肉眼觀察及顯微觀察均沒有明顯病變(圖3 B2、C3)。

A.豬鼻支原體感染豬剖檢病變觀察；B.豬鼻支原體感染豬肺剖檢病變(1.感染組肺；2.對照組肺)；C.豬鼻支原體感染豬肺病理組織學變化(1.感染組，肺間質增寬，肺淤血，肺泡內有漿液性和纖維素性滲出；2.感染組，氣管上皮細胞杯狀細胞增多；3.對照組肺，無明顯變化；200×)

2.4 感染豬血清中的抗體檢測

試驗豬于感染后每周采血一次，進行血清IgG抗體的檢測，結果如圖4所示，感染組豬血清的豬鼻支原體IgG抗體水平在感染14 d后開始上升，21 d維持在一定的抗體水平，而對照組試驗豬IgG抗體水平無明顯變化，組間具有統計學差異(P<0.05)。

DPI.感染后時間/d；*.P<0.05

2.5 豬鼻支原體的再分離及鑒定

試驗豬剖檢后，采集心、肺、扁桃體、關節積液進行豬鼻支原體的再分離，具體結果如表5所示。感染組試驗豬均能從至少一處組織中再分離到豬鼻支原體，而對照組均未分離到。進一步將分離到的菌株按“1.2.4”的方法進行MLST分型，結果顯示，從感染豬中再分離得到的菌株MLST分型結果均與HEF16株一致。

表5 豬鼻支原體再分離情況統計(分離數/總數)

3 討 論

豬場豬鼻支原體的感染率非常高，主要定植于上呼吸道，根據文獻報道斷奶仔豬鼻拭子中的檢出率可達98%[1]。支原體對營養要求高，且生長緩慢，一般從臨床樣品中分離培養支原體成功率較低。與豬肺炎支原體等其他豬支原體相比，豬鼻支原體具有更強的能量獲取能力及代謝能力[12]，其臨床分離率能達到7%～35%[13]。值得注意的是，大多數情況下豬鼻支原體感染陽性豬并不表現出臨床癥狀，一般認為致病性的出現與豬鼻支原體突破呼吸道實現全身性感染有關。但全身性感染的出現究竟是取決于菌株毒力的差異還是動物狀態差異導致的條件性致病，目前尚不清楚。從呼吸道分離的豬鼻支原體菌株其致病力可能并不強。本研究選擇從發病豬的關節病變部位采集樣品進行菌株分離，更容易分離到致病性強的菌株。

發病模型是開展感染機制研究或疫苗研發的基礎，雖然豬鼻支原體人工感染模型已有一些報道，但目前尚無標準的試驗方法，使用的接種途徑也各不相同。已經報道的接種途徑包括滴鼻、腹腔注射、靜脈注射、氣管內注射[3, 14-18]。多途徑聯合接種的方式也常見于豬鼻支原體的人工感染，如氣管內和腹腔注射聯用[3, 17]、滴鼻、腹腔注射和靜脈注射聯用[18]。本試驗也采用了多途徑聯用的方式接種分離株，包括滴鼻、腹腔注射、氣管內注射和肺內注射，試驗豬感染后出現精神沉郁、食欲下降的現象，感染后體重增長緩慢，后期甚至出現下降。感染4 d后部分試驗豬的關節開始腫脹，并出現跛行，一周后所有感染豬均出現較為嚴重的臨床癥狀，這與文獻報道的癥狀出現時間相近[14, 19]，剖檢觀察到明顯的多發性漿膜炎和關節炎的典型發病癥狀，說明通過滴鼻、腹腔注射、氣管內注射、肺內注射四種途徑聯合接種可以成功誘導疾病的發生。然而，四種途徑聯合接種存在操作繁瑣、對試驗豬應激較大的問題，在后續試驗中將對比各途徑感染效果，優化攻毒途徑。Martinson等[18]對滴鼻、腹腔注射、靜脈注射三種途徑及其聯合接種的感染效果進行了比較，數據顯示感染途徑的差異會導致發病程度和組織的差異性，靜脈注射更容易誘導多發性漿膜炎，腹腔注射則可增加關節腫脹和跛行的概率，而僅滴鼻不容易誘導發病，聯合接種效果優于單一途徑接種。該研究也可為我們后續的接種途徑優化提供一定參考。

豬鼻支原體感染對肺部的影響尚存在爭議。豬鼻支原體最早被認為是豬地方性肺炎(enzootic pneumonia，EP)的致病菌之一。Lin等[16]報道，通過氣管注射的方法感染6周齡試驗豬，剖檢時肺部可見類似于豬肺炎支原體感染產生的蝦肉樣病變；危艷武等[17]將豬鼻支原體感染巴馬豬后，剖檢同樣可見肺部呈蝦肉樣病變。但肺產生肉變的數據并不多，數據的差異有可能來自毒株或接種途徑兩個方面。本研究選擇聯合接種途徑時，作者參考豬肺炎支原體的接種方式，有針對性地加入了下呼吸道攻毒常用的氣管內注射和肺內注射的方式進行聯合接種，以充分考察肺部的病變情況。結果顯示：感染組均出現了胸膜炎，顯微病理檢查發現肺間質增寬，肺泡內有漿液性和纖維素性滲出，支氣管黏膜層杯狀細胞增多，但所有感染豬的肺均未出現肉變。由此作者推測肺部肉變的發生可能更多是因為毒株毒力或嗜性的差異，而非接種途徑。

豬場中豬鼻支原體感染主要引起斷奶仔豬發病，表現為多發性漿膜炎及關節炎，而大豬很少發病，或僅出現輕微的關節炎癥狀[20]。因此仔豬更適合用于建立豬鼻支原體發病模型。根據流行病學數據，豬鼻支原體在仔豬斷奶后會出現感染率的上升[1]，因此本試驗選取1月齡剛斷奶仔豬用于感染試驗，更接近豬鼻支原體自然狀態下的臨床感染時間。在感染的過程中出現了3頭試驗豬死亡，感染狀態較為嚴重，一方面可能是由于該分離毒株的毒力較強，另一方面感染采用了4種途徑聯用，感染劑量也較大，也可能是造成臨床癥狀嚴重的原因之一。在試驗的后期，可以觀察到有部分感染豬臨床癥狀出現了一定程度的減輕。Barden 等[14]報道，通過腹腔注射途徑感染豬鼻支原體后試驗豬在第7天出現臨床癥狀，持續至1個月時癥狀出現減輕，感染時間至6個月時癥狀基本消失。豬場中大豬感染豬鼻支原體也較少發病或癥狀較輕[20]。這些數據提示機體自身的免疫系統有可能能夠逐漸對豬鼻支原體產生一定的抵抗和清除[21]。在豬肺炎支原體的感染中也存在類似的情況，當豬感染254 d后，病原會被徹底清除[22]。由于本次試驗周期較短，未能繼續觀察感染癥狀的轉歸。后續可以對感染豬進行長時間的癥狀觀察和病原檢測，豬肺炎支原體上的凈化經驗也可能為豬鼻支原體的凈化提供參考。

豬鼻支原體在臨床中常見于混合感染，為了防止試驗豬存在其他病原的影響，本試驗采用豬偽狂犬病病毒、豬繁殖與呼吸綜合征病毒、豬鼻支原體、豬肺炎支原體多病原的陰性試驗豬。同時，作者采集了試驗豬組織對3種可引起豬鼻支原體感染類似癥狀的病原(即副豬嗜血桿菌、胸膜肺炎放線桿菌和鏈球菌)，進行了PCR檢測，結果均為陰性。菌株的再分離試驗也進一步證實本次動物試驗中試驗豬的發病癥狀是由豬鼻支原體HEF16感染引發的。

4 結 論

從臨床感染發病豬關節積液中分離得到一株豬鼻支原體，菌株經過純化和鑒定后，采用多途徑聯用的方式感染1月齡三元SF-pCD豬，試驗豬在感染后出現關節腫脹、跛行等臨床癥狀，剖檢可見典型的多發性漿膜炎和關節炎癥狀。強毒株的獲得和發病模型的建立可為豬鼻支原體致病機理研究及疫苗研發奠定基礎。