不同酵母發酵對柿子酒、柿子醋風味的影響

陳 穎，陳曉明，張志軍，劉 勛，王占文，張 峻,*

（1. 天津市農業科學院農產品保鮮與加工技術研究所，天津 300384；2. 天津薊州綠色食品集團有限公司，天津 301900）

柿子（Diospyros kaki Thunb.），又名長生果，屬柿樹科柿屬植物，其味甘、性寒，能清熱生津、潤肺，內含蛋白質、糖類、脂肪、果膠及多種維生素和礦物質，具有較高的營養價值和藥用價值[1]。盤山磨盤柿作為天津市地理標志保護產品，主要分布于天津市薊州區北部山區，具有品質優、風味佳等特點。

柿子醋作為一種柿子深加工產品，采用柿子原漿釀造而成，不僅可以保留柿子原果香氣，同時溶解了柿子中的有機酸、維生素、氨基酸等多種營養成分，補充了糧食醋中礦物質含量的不足，具有較高的營養價值及保健功能[2]。

本系統服務器端即為教師端，而客戶端即為學生端。但是一般Client/Server結構系統在應用前都需要進行系統部署、設置和調試工作，很多情況下，Client/Server架構數據庫也需要進行一系列參數設置和環境設置，譬如連接時數據庫就至少需要配置連接字符串。由于網絡環境不同，連接字符串并非固定不變的，因此往往專業人員上門進行部署和測試。

傳統柿子醋發酵工藝一般采用釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）發酵后再接種醋酸菌完成醋酸發酵，發酵過程中產生的芳香物質相對較少，導致柿子醋風味淡薄、典型性香氣不夠濃郁。因此，增加柿子醋的天然香氣成分對于提升柿子加工品品質有著非常重要的意義。有研究表明，一些非釀酒酵母（Non-Saccharomyces cerevisiae）在果酒的發酵過程中對果酒香氣的整體特征具有重要影響[3-4]。非釀酒酵母菌是指存在于水果表皮、果園土壤甚至發酵設備上的參與果酒發酵，對果酒品質（口感、色澤、風味、營養物質等）產生重要影響的一類酵母菌的總稱[5]。目前常用的主要非釀酒酵母包括假絲酵母屬（Candida）、漢遜酵母屬（Hansenual）、有孢漢遜酵母屬（Hanseniaspora）、畢赤酵母屬（Pichia）、接合酵母屬（Zygosaccharomyces）、裂殖酵母屬（Schizosaccharomyces）、有孢圓酵母屬（Torulaspora）、克魯維酵母屬（Kluyveromyces）、克勒克酵母屬（Kloeckera）和梅奇酵母屬（Metschnikowia）[6-7]。 其中， 馬 克 斯 克 魯 維 酵母（Kluyveromyces marxianus）作為“天然香氣的生產工廠”引起眾多學者的關注[8]。馬克斯克魯維酵母來源極其廣泛，具有較高的代謝多樣性和種類多態性，其底物寬泛、生長速度快、耐熱性強、安全性好、且具有高產乙酸乙酯等多種風味物質的能力。大量研究表明，馬克斯克魯維酵母可以分泌菊粉酶（能夠水解β-2,1-果糖糖苷鍵）、β-半乳糖苷酶、β-葡萄糖苷酶、木糖酶、氨肽酶等十多種水解酶類，在果酒發酵中，其可通過新的代謝途徑產生新的不同于其他酵母的產物，對果酒的品質產生重要影響[9-10]。因此，近年來馬克斯克魯維酵母被作為“天然香料的生產者”應用于諸多生物技術領域[11-13]，而將馬克斯克魯維酵母用于柿子酒、柿子醋發酵的報道至今尚未發現。

(1)提出一種基于MATLAB的動態位移監測圖像處理方法。對預處理后的圖像進行形心算法計算得到形心坐標，最后通過位移計算公式得到動態位移。測得的位移與實際位移誤差在一個像素對應的實際距離內。

本研究以盤山磨盤柿為原料，分別采用非釀酒酵母（馬克斯克魯維酵母）和釀酒酵母（安琪釀酒酵母）聯合醋酸菌進行發酵，最終獲得兩種不同風味的柿子酒和兩種柿子醋。通過頂空固相微萃?。℉S-SPME）與氣相色譜-質譜聯用（GC-MS）技術比較分析兩種酵母發酵的柿子酒、柿子醋中主要芳香物質的變化，以期為工業化生產果酒及果醋提供一些理論依據。

嵊縣氣候溫和，雨量豐沛，盛產各種翠竹，早在2 000多年前，就有竹籃、竹籮的編織，在光緒年間達到鼎盛時期，后來逐漸形成了典雅精美的竹編工藝特色，達到了“中外竹編第一家”的境界，外銷國內外各地，發展迅速。

1 材料與方法

1.1 材料與設備

1.1.1 材料與試劑

醋酸菌活化：將保存于4 ℃條件下的滬釀1.01醋酸菌菌種，無菌條件下接種于已滅菌的液體培養基（培養基配方為：葡萄糖1%，酵母粉1%，無水乙醇4%）中，置于搖床中30 ℃、160 r/min 培養3 d。

通過圖形用戶接口（Graphical User Interface，GUI），實現網絡插補實驗教學的交互性。使用鼠標或鍵盤來選擇菜單或按鈕以引發程序內的特定操作行為，每個交互操作都會引發不同的程序行為。在操作之前，并不知道下一步要執行哪條程序代碼。對每個操作行為，操作系統將決定在計算機上當前運行哪個程序對它進行處理，這一過程需要事件驅動程序的加載。

果膠酶（30 000 U/g），天津諾奧酶生產力促進有限公司產品；白砂糖，上海上棠食品有限公司產品；焦亞硫酸鉀，安徽中弘生物工程有限公司產品；2-辛醇，Sigma 公司產品；蛋白胨，北京奧博星生物技術有限責任公司產品；葡萄糖、氯化鈉、無水乙醇，天津市光復科技發展有限公司產品；麥芽糖、乳糖、酵母粉，北京鼎國生物技術發展中心產品。

釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）、安琪葡萄酒活性干酵母BV818，安琪酵母有限公司；馬克斯克魯維酵母（Kluyveromyces marxianus）、MPS1 菌株，本實驗室保藏；巴氏醋桿菌（Acetobacter pasteurianus）、滬釀1.01，本實驗室保藏。

1.1.2 儀器與設備

CAV214C 型電子天平，奧豪斯儀器有限公司；JYL-D055 型水果打漿機，九陽股份有限公司；TZ-62手持糖度計，泉州光學儀器廠；SW-CJ-2FD 型雙人單面凈化工作臺，蘇州凈化設備有限公司；LRH-70 型生化培養箱，上海一恒科學儀器有限公司；GL21M 型離心機，湖南湘儀實驗室儀器開發有限公司；Thermo Trace1300 氣相色譜儀、ISQ7000 質譜儀，賽默飛世爾科技公司。

1.2 方法

一年一度的全國水利廳局長會議是水利工作的航塔。翻讀近幾年的工作報告，“民生水利”這一關鍵詞頻頻提及，成為社會各界關注的熱點。

柿子酒：磨盤柿挑選→清洗→脫澀→破碎打漿→酶解→調整成分（調糖）→酒精發酵過濾→柿子酒

柿子醋：柿子酒→醋酸發酵→過濾→柿子醋

1.2.3 測定項目與方法

1.2.2.1 原料挑選

挑選新鮮無病蟲害、霉變和機械損傷的磨盤柿。

1.2.3.2 揮發性成分

將柿果分層裝入容器中，均勻噴灑75%乙醇，用量為柿果質量的0.1%，常溫下密封5～7 d。

1.2.2.3 酶解

揮發性物質定量分析：根據內標法（內標物：2-辛醇，終濃度為145 μg/L）計算待測組分含量。

將上述脫澀后的柿子破碎打漿后，加入5%（m/m）果膠酶，室溫酶解12 h。

1.2.2.4 調整成分

網絡培訓四要素（PMCT）是一個有機的整體，缺一不可，平臺是網絡培訓的基礎，沒有這個基礎，其他都是無本之末，無源之水；內容是網絡培訓的核心，工具是網絡培訓的手段，管理是網絡培訓的關鍵，可見，網絡培訓四要素（PMCT）相互依存，互為促進。

用蔗糖將酶解后的柿子漿可溶性固形物含量調整至19～20%（m/m），加入0.01%（m/m）焦亞硫酸鉀。

1.2.2.5 菌種活化

釀酒酵母的活化：將柿子汁稀釋至可溶性固形物含量為5%，滅菌后降溫至30 ℃，加入安琪葡萄酒活性干酵母BV818 活化30 min，每10 min 攪拌1 次。

(1)LVQ神經網絡可以很好地實現對地下水源熱泵系統EER等級劃分的預測，并能清楚地計算該系統的節能等級，對以后系統在節能方面的完善奠定了一定的基礎。

馬克斯克魯維酵母的活化：將保存于4 ℃條件下的MPS1 菌種于無菌條件下接種于已滅菌的液體培養基（培養基配方為：葡萄糖2%，麥芽糖1%，乳糖0.5%，蛋白胨0.5%）中，30 ℃恒溫條件下培養2～3 d。

盤山磨盤柿，由天津薊州綠色食品集團有限公司提供。

1.2.2.6 酒精發酵

分別將活化后的安琪酵母和馬克斯克魯維酵母以0.05%（m/m）的接種量接種于已調好成分的柿子果漿中，28 ℃培養至可溶性固形物含量不再降低時結束發酵。發酵結束后，分離沉淀物，得到酒醪。

1.2.2.7 醋酸發酵

1.2.1 工藝流程

在酒醪中加入5%醋酸菌種子液，4 層紗布封口，30 ℃靜置培養。每24 h 取樣檢測，待樣品總酸含量（以醋酸計）不再上升時結束發酵。

③結合信息化管理工具，實現對小流域高分辨率衛星數據、基礎地理信息與規劃設計信息的統一化管理、多角度查詢統計及全方位綜合展示，為生態清潔小流域的規劃管理提供科學、有效的輔助手段。

1.2.2.8 過濾處理

3）當流量為40～60m3/h（標準狀態下）時，功率應采用大于70kW，而當流量為30m3/h（標準狀態下）時，功率應采用50～60kW，一般情況下盡量不采用40kW的功率。

酒精發酵和醋酸發酵結束后用硅藻土過濾發酵液，得到柿子酒及醋澄清液。

1.2.2 操作要點

1.2.3.1 理化指標

可溶性固形物含量：參照GB/T 12143—2008[14]規定的方法進行測定。

總酸含量：參照GB 12456—2021[15]規定的方法進行測定。

酒精度：參照GB 5009.225—2016[16]，采用酒精蒸餾法進行測定。

其中，ρ為介質密度，ut為水平位移速度，wt為垂直位移速度， τxx，τzz為正應力，τxz為剪應力，λ，μ為介質的拉梅系數；c11=c33=λ+2μ，c13=λ，c44=μ。

1.2.2.2 脫澀

GC-MS 條件：色譜柱為HP-INNOWAX（長30 m，內徑0.25 mm，液膜厚度0.25 μm）。載氣為高純氦氣，流速為1 mL/min。固相微萃取采用自動進樣，不分流模式。柱溫箱的升溫程序為：40 ℃保持2 min，然后以5 ℃/min 的速度升溫至140 ℃保持1 min，再以20 ℃/min 的速度升溫至220 ℃保持14 min。質譜傳輸線溫度為250 ℃，離子源溫度為200 ℃，電離方式EI，離子能量70 eV，掃描范圍為35～550 U。

揮發性成分提?。翰捎庙斂展滔辔⑤腿》ǎ℉SSPME）進行提取。①樣品制備：準確量取8 mL 柿子酒（柿子醋）于20 mL 頂空瓶中，加入2.4 g NaCl 及終濃度為145 μg/L 的2-辛醇；②萃取頭活化：萃取頭材質為聚二甲基硅氧烷/碳篩/二乙烯苯（PDMS/CAR/DVB），活化條件為孵化爐溫度40 ℃，孵化時間10 min；③取樣：將進樣器插入頂空瓶于40 ℃恒溫下吸附30 min；④進樣：將萃取頭插入GC-MS 進樣口，250 ℃下熱解析2 min 后進樣。

四、尤其是對裁負有文化特征或符號的母材(如瓷、銅質等等)，改良和否定后產生的能源力更具有品值和品德。從而也引領了對雕塑本體的習慣勢力，而進入它的當下狀態及癥侯。

揮發性物質定性分析：選擇匹配因子大于或等于80%的色譜峰，各組分質譜由質譜數據庫NIST 11s.LIB 和Wiley 7.LIB 檢索并進行定性分析。

這話鬼才信呢。林老板找我絕對不會有好事。我說夏俊，你要找我敘舊，我一定奉陪，但林老板找我，恕我不能奉陪。夏俊有點急，說實話對你說了吧，你現在缺拋光熟手么？林老板可以幫你。

待測組分含量（μg/L）=對應組分峰面積×內標物含量（μg/L）/內標物峰面積

2 結果與分析

2.1 柿子酒及柿子醋總揮發性物質組成

安琪酵母發酵的柿子酒發酵至酒精度為6.8%時接入5%醋酸菌進行醋酸發酵，發酵結束后總酸為35.6 g/L（以醋酸計）。馬克斯克魯維酵母發酵的柿子酒發酵至酒精度為6.5%時，接入5%醋酸菌進行醋酸發酵，發酵結束后總酸為38.2 g/L（以醋酸計）。分別取樣進行SPME 與GC-MS 分析，得到的總離子流圖（圖1～4）。

圖1 安琪酵母發酵柿子酒總離子流圖Fig.1 Total ion chromatogram of persimmon wine fermented with Angel yeast

分別對安琪酵母和馬克斯克魯維酵母發酵的柿子酒、柿子醋中的主要芳香成分進行定性和定量分析，結果見表1。

由表1 可知，在柿子酒和柿子醋中檢測出的揮發性物質包括醇類、酸類、酯類、醛類、酮類，其中醇類物質和酯類物質為柿子酒中的主要揮發性物質，酸類和醇類為柿子醋中的主要揮發性物質。

表1 柿子酒及柿子醋中揮發性物質組成Table 1 Volatile substances compositions of persimmon wine and vinegar

圖2 馬克斯克魯維酵母發酵柿子酒總離子流圖Fig.2 Total ion chromatogram of persimmon wine fermented with K. marxianus

圖3 安琪酵母發酵柿子醋總離子流圖Fig.3 Total ion chromatogram of persimmon vinegar fermented with Angel yeast

圖4 馬克斯克魯維酵母發酵柿子醋總離子流圖Fig.4 Total ion chromatogram of persimmon vinegar fermented with K. marxianus

從GC-MS 檢測出的揮發性物質數量上看，以安琪酵母發酵的柿子酒共檢測出揮發性物質19 種，以馬克斯克魯維酵母發酵的柿子酒中共檢測出揮發性物質29 種。以上結果表明，馬克斯克魯維酵母在柿子酒發酵過程中可產生更為豐富的香氣成分。從揮發性物質的總含量上看，以馬克斯克魯維酵母發酵的柿子酒揮發性物質總含量較安琪酵母發酵柿子酒增加了56.42%，其中醇類物質和酯類物質增加較為顯著，分別增加了55.67%和50.22%。

分別采用安琪酵母和馬克斯克魯維酵母發酵的柿子酒接種醋酸菌發酵的柿子醋中，揮發性物質分別為21和22 種。采用馬克斯魯維酵母發酵的柿子醋揮發性物質總含量較安琪酵母發酵所得柿子醋增加了18.95%，其中酯類和醇類物質分別增加了46.67%和44.21%。

上述結果可以看出，馬克斯克魯維酵母能明顯提高柿子酒和柿子醋的香氣成分含量。

2.2 柿子酒及柿子醋中各類揮發性物質分析

2.2.1 柿子酒及柿子醋中揮發性醇類物質

由表2 可以看出，以馬克斯克魯維酵母發酵的柿子酒中醇類物質比安琪酵母發酵的樣品增加了6 種新物質。兩種酵母發酵的柿子酒中含量最高的醇類物質均為3-甲基-1-丁醇（異戊醇），其含量分別占總醇類物質的55.70%（安琪酵母）和53.11%（馬克斯克魯維酵母），其次為苯乙醇。以馬克斯克魯維酵母發酵的柿子酒中所有兩者共同擁有的醇類物質的含量均較安琪酵母發酵的樣品有不同程度的提高，其中苯乙醇和3-甲基-1-丁醇提高最為明顯，分別提高了57.64%和48.42%，該兩種醇均為柿子酒中的典型性香氣物質[17]。由此可見，以馬克斯克魯維酵母發酵可增強柿子酒的典型性香氣。

表2 柿子酒及柿子醋中揮發性醇類物質組成及含量Table 2 Compositions and contents of volatile alcohols in persimmon wine and vinegar 單位：μg·L-1

兩種不同酵母發酵的柿子醋中檢測出的揮發性醇類物質中含量最高的均為苯乙醇，分別占柿子醋中總揮發醇類的77.14%和82.15%。除2-甲基-1-丁醇外，以馬克斯克魯維酵母發酵的柿子醋中的醇類物質含量均較安琪酵母發酵的柿子醋有所提高，其中柿子醋中的主要香氣貢獻者苯乙醇（具有玫瑰香味和蜂蜜香）的含量提高了53.57%，為改善柿子醋的風味起到了積極作用[18]。

2.2.2 柿子酒及柿子醋中揮發性酸類物質

由表3 可以看出，以兩種不同酵母發酵的柿子酒中檢測出的揮發性酸類物質為辛酸、正癸酸和己酸，與已有報道一致[19-21]。以馬克斯克魯維酵母發酵的樣品中酸類物質含量較安琪酵母發酵樣品增加了79.27%，其中正癸酸含量增加最為明顯，較安琪酵母發酵樣品增加了163.16%。

揮發性酸類物質是柿子醋中的主要揮發性物質。兩種不同酵母發酵的柿子醋中檢測出的揮發性酸類物質均為7 種。由表3 可知，兩種柿子醋中含量較高的酸性物質均為乙酸、辛酸、正癸酸和3-甲基-1-丁酸。從柿子醋揮發性酸類物質總含量來看，馬克斯克魯維酵母發酵的柿子醋（1 105.98 μg/L）大于安琪酵母發酵的柿子醋（998.78 μg/L）。

表3 柿子酒及柿子醋中揮發性酸類物質組成及含量Table 3 Compositions and contents of volatile acids in persimmon wine and vinegar 單位：μg·L-1

2.2.3 柿子酒及柿子醋中揮發性酯類物質

酯類化合物是構成芳香成分的重要物質，具有獨特的水果香氣[22]。由表4 可知，辛酸乙酯、正己酸乙酯、癸酸乙酯、乙酸乙酯、乙酸異戊酯為兩種不同酵母發酵的柿子酒中的主要酯類物質。馬克斯克魯維酵母在提高柿子酒酯類物質含量上具有重要作用，以馬克斯克魯維酵母發酵的柿子酒中大部分酯類物質的含量均較安琪酵母發酵的柿子酒有所提高，其中乙酸苯乙酯、癸酸乙酯、己酸乙酯含量分別提高了147.13%、91.96%和78.60%。

表4 柿子酒及柿子醋中揮發性酯類物質組成與含量Table 4 Compositions and contents of volatile esters in persimmon wine and vinegar 單位：μg·L-1

安琪酵母和馬克斯克魯維酵母發酵的柿子醋中的酯類物質總含量分別為49.18 μg/L 和72.12 μg/L，均明顯低于柿子酒。在兩種柿子醋中含量最高的酯類物質分別為乙酸苯乙酯和癸酸乙酯。以馬克斯克魯維發酵的柿子醋中，除乙酸苯乙酯外，其余酯類物質含量均較安琪酵母發酵的柿子醋有所提高，其中，月桂酸乙酯、辛酸乙酯、癸酸乙酯含量分別提高了177.91%、137.36%和110.37%。馬克斯克魯維酵母發酵的柿子醋較安琪酵母發酵的樣品新增3 種酯類物質，分別為苯乙酸乙酯、2-甲基-1-丁醇乙酸酯和9-十六碳烯酸乙酯，一定程度上豐富了柿子醋的風味。

獨立學院辦學的時間不長，學校本身和學生對就業指導課的重視程度都不夠，大家都注重專業課、英語、計算機和一些基礎課程的學習,輕視就業指導課的學習。就業指導課開設的課時不夠，上課的內容就不夠系統、深入，不成體系，對學生的職業規劃、創業教育、就業指導等知識傳授得不夠，有些課程內容沒有開設。把大學生就業指導貫穿于大學教育全過程，這是一個完整的教學計劃，實施計劃的有效模式是建立就業指導課程體系，這個體系應包括在學校的教學體系之中[3]。

2.2.4 柿子酒及柿子醋中揮發性醛、酮類物質

兩種不同酵母發酵的柿子酒中醛類和酮類物質差異較大（見表5）。其中，以馬克斯克魯維酵母發酵的柿子酒中檢測出4 種酮類物質和1 種醛類物質，醛、酮總含量為56.70 μg/L，而這5 種物質在安琪酵母發酵的柿子酒中均未被檢測出。

表5 柿子酒及柿子醋中揮發性醛、酮類物質組成及含量Table 5 Compositions and contents of volatile aldehydes and ketones in persimmon wine and vinegar 單位：μg·L-1

3-羥基-2-丁酮和苯甲醛分別為兩種柿子醋中含量最高的酮醛類物質，以馬克斯克魯維酵母發酵的柿子醋中3,4-二甲基苯甲醛含量較安琪酵母發酵的柿子醋提高了375%，其余兩種酮醛類物質含量均較安琪酵母發酵的樣品有所降低。柿子醋與柿子酒在醛類和酮類物質的組成上的較大差異，表明醋酸菌在發酵過程中形成了新的醛酮類物質。

3 結論

本文以盤山磨盤柿為原料，采用兩種酵母菌——釀酒酵母和馬克斯克魯維酵母分別釀造柿子酒和柿子醋，通過HS-SPME 與GC-MS 技術檢測不同柿子酒和柿子醋中主要香氣物質（匹配度大于或等于80%）的組成。

經定性和定量分析，柿子酒中的主要香氣物質為醇類和酯類；酸類和醇類物質為柿子醋中的主要香氣物質。以馬克斯克魯維酵母發酵的柿子酒在香氣物質種類和總含量上均明顯優于安琪酵母；馬克斯克魯維酵母發酵的柿子醋雖然在香氣總含量上較安琪酵母未有顯著增加，但是對于柿子醋的一些主要香氣物質（如正癸酸、月桂酸乙酯、辛酸乙酯、癸酸乙酯等）含量的提高起到了積極的作用。

結合柿子酒和柿子醋來看，馬克斯克魯維酵母作為非釀酒酵母，與釀酒酵母相比，對于酯類物質（月桂酸乙酯、辛酸乙酯、乙酸苯乙酯、癸酸乙酯）、酸類物質（正癸酸）和醛類物質（3,4-二甲基苯甲醛）含量的提高有較為顯著的效果，新增的幾種高級醇（正辛醇、[R-（R*，R*）]-2,3-丁二醇、2-壬醇）、酯類（乙酸辛酯、9-十六碳烯酸乙酯）及酮類物質（2-壬酮、2-庚酮），豐富了樣品中的香氣物質種類。

綜上所述，以柿子為原料，利用馬克斯克魯維酵母進行發酵，與釀酒酵母相比，可以產生更多的天然芳香化合物，使得柿子酒、柿子醋中的香氣成分更加豐富和濃郁，從而起到提高柿子酒、柿子醋香氣品質的作用。