新疆傳統泡菜中乳酸菌的分離鑒定及其益生性能評價

夏勒合特·巴克爾拜，劉晶晶，賀紅軍，林祥娜，劉云國,*

（1. 新疆大學生命科學與技術學院，新疆 烏魯木齊 830002；2. 臨沂大學生命科學學院，山東 臨沂 276000；3. 煙臺大學生命科學學院，山東 煙臺 264005）

泡菜是新鮮蔬菜經過發酵加工成的傳統發酵食品，新疆泡菜的經典做法是將大白菜或蘿卜與紅辣椒、大蒜、姜、蔥等各種香料混合后鹽漬或醋漬。泡菜是利用蔬菜表面附著的或外源添加的乳酸菌（Lactic acid bacteria, LAB）作為主導微生物的發酵制品[1]。泡菜擁有獨特的風味和口感，還含有多種乳酸菌以及豐富的維生素和礦物質等營養物質[2]。LAB 為革蘭氏陽性，無芽孢的球菌或棒狀細菌，廣泛存在于發酵食品中，也是人體內具有重要生理功能的菌群[3]，能夠調節和改善胃腸微生物生態平衡，并預防由病原體引起的腹瀉[4-5]，LAB 還具有增強免疫力、減少血清總膽固醇、抗癌等作用[6-7]。

傳統泡菜常常是自然發酵而成，無需外源添加任何發酵劑。然而，近年來為了提高泡菜的質量、功能性和益生性，在泡菜制作過程中還可以添加一些優良的發酵劑，該類發酵劑應具有益生菌所需的特性，即能在人體腸道中存活、增殖并發揮其益生特性。研究學者從發酵食品中分離得到具有不同發酵性能和益生特性的菌株，如耐鹽菌株[8]、拮抗性菌株[9-10]等。熊蝶等[11]從陜西泡菜中篩選出可作為發酵菌種的乳酸菌，其發酵性和耐鹽性均較強；發酵食品中微生物的耐藥性已成為食品安全的重要隱患，許女等[12]對醋醅、泡菜和發酵乳制品中乳酸菌的抗生素耐藥性進行了評估，并對其耐藥基因進行了分析，所分離的97 株乳酸菌對所有測試抗生素均呈不同程度的耐藥性；栗永樂[13]從傳統農戶自制的酸菜中分離篩選出了對人工胃腸液表現出良好耐受性的乳酸菌。優良發酵劑的開發不僅可以提升泡菜的營養價值，還可使益生菌菌種多樣性。

本試驗組人員通過傳統方法結合16S rRNA 分子鑒定對分離于傳統自然發酵泡菜中的乳酸菌進行了鑒定，在此基礎上，從對低pH 的耐受性、耐鹽性、在人工模擬胃腸液中的存活情況和對抗生素的耐受性以及對常見致病菌的抑制性等方面對分離出的乳酸菌生長代謝特征進行了測定分析，為開發具有益生作用的新型泡菜發酵劑提供理論依據與原料來源。

1 材料與方法

1.1 材料與設備

1.1.1 材料與試劑

收集新疆烏魯木齊市不同家庭自制的泡菜于無菌袋中，密封置于冰盒內并迅速帶回實驗室進行乳酸菌的擴培及分離等相關試驗。

指示菌：大腸桿菌（Escherichia coli）ATCC 25922，金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）ATCC 25923，鼠傷寒沙門氏菌（Salmonella typhimurium）CTCC 10982，單核細胞增生李斯特菌（Listeria monocytogenes）ATCC 19115。

培養基：MRS 肉湯培養基、MRS 瓊脂培養基，購自北京陸橋技術股份有限公司。

細菌基因組DNA 提取試劑盒，購自北京索萊寶科技有限公司；紅霉素（E）、諾氟沙星（NOR）、環丙沙星（CIP）、復方新諾明（SXT）、青霉素（P）、氯霉素（C）、氨芐西林（AM）、頭孢唑啉（CZ）、丁胺卡那霉素（AK）、慶大霉素（GM）抗菌藥物藥敏紙片（以上每片藥物含量均為10 μg）、革蘭氏染色液試劑盒、牛膽鹽等，購自杭州微生物試劑有限公司；胰蛋白酶（3 000 U/g）、胃蛋白酶（250 U/g），購于廣州賽國生物科技有限公司；氯化鈉、重碳酸鈉等試劑均為分析純。

1.1.2 儀器與設備

LDZX-50KBS 立式壓力蒸汽滅菌器，上海申安醫療器械廠；SW-CJ-2FD 超凈工作臺，上海一恒科學儀器有限公司；MJX-250B-Z 電熱恒溫培養箱，上海博訊實業有限公司；LC-LX-H185C 臺式高速離心機，上海力辰邦西儀器科技有限公司；MIKRO220R 752 紫外可見分光光度計，上海光學儀器一廠；S1000 Thermal Cycler PCR 儀、DYY-6D 電泳儀、JY04S-3E 凝膠成像系統，北京六一生物科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 乳酸菌的篩選

從7 份自然發酵的泡菜中分別取25 g 樣品置于裝有225 mL 無菌生理鹽水的三角瓶中，搖勻后進行梯度稀釋。分別取0.1 mL 106、107、108稀釋液涂布MRS 平板，37 ℃培養48 h。挑取單菌落分別在MRS瓊脂培養基上劃線分離，反復純化。將純化后的菌落進行革蘭氏染色、鏡檢及過氧化氫酶試驗，挑選出無芽孢、過氧化氫酶陰性且革蘭氏染色呈陽性的菌株[14-15]。挑選出的菌株置于-80 ℃保存備用。

1.2.2 耐酸性能測試

將純化后獲得的乳酸菌進行活化并培養24 h，調節OD600為0.5，以1%的接種量分別接種至pH 值為4.0、3.0 和2.5 的MRS 液體培養基中（pH 值用4 mol/L的鹽酸調節），37 ℃厭氧培養24 h，600 nm 下測定各組菌液的吸光度值。以未接種的相應pH 值的培養基作為對照，并選取耐酸性能較好的乳酸菌進行后續試驗。

1.2.3 膽鹽耐受性能測試

在MRS 肉湯培養基中分別添加0、1、2、3.0 g/L的牛膽鹽，滅菌?；罨蟮木暌?%的接種量接入MRS 肉湯培養基中，37 ℃培養3 h，于600 nm 下測定吸光度值，以未添加牛膽鹽的培養基作為對照。

1.2.4 生物學鑒定

參照Yang 等[16]的方法，采用CTAB 法提取待鑒定菌株的基因組DNA，使用細菌基因通用引物（上游引物27F 和下游引物1492R）進行PCR 擴增。以1%的瓊脂糖凝膠電泳法檢測PCR 產物后，送至上海生工公司測序。測序結果在NCBI 數據庫中進行BLAST 分析[17]。

1.2.5 生長曲線的測定

將乳酸菌活化兩代，每次活化按1.0%接種量接種到MRS 培養基中，于培養箱中37 ℃培養24 h，以不接種的MRS 培養基作為空白對照，每2 h 對發酵液進行取樣，于600 nm 波長下測定菌液的吸光度值。吸光度值越大，菌液濃度越高。

1.2.6 耐鹽性能的測定

將供試菌以1%的接種量接種至NaCl 濃度分別為2.0%、4.0%、6.0%、8.0%和10.0%的MRS 肉湯培養基中，以未添加NaCl 的MRS 肉湯培養基為對照（CK），37 ℃培養24 h，于600 nm 波長下測定發酵液吸光度值，每組試驗設置3 次重復，以不添加NaCl 的MRS液體培養基作為空白對照。

1.2.7 模擬胃腸道環境試驗

1.2.7.1 模擬胃液和模擬腸液的配制

模擬胃液：氯化鈉為0.2 g/100 mL，胃蛋白酶為0.35 g/100 mL，用HCI 將pH 值調整為3.0，過濾除菌備用。

模擬腸液：a 液配方為重碳酸鈉1.1 g/100 mL，氯化鈉0.2 g/100 mL，胰蛋白酶0.1 g/100 mL，用NaOH將pH 值調整為8.0，過濾除菌備用；b 液配方為牛膽鹽1.8 g/100 mL，用NaOH 將pH 值調整為8.0，過濾除菌備用。將a 液和b 液以2∶1（V/V）的比例混合，過濾除菌備用。

1.2.7.2 模擬胃腸道環境試驗方法

參考陳明等[18]的方法，稍作修改，供試菌培養18 h，4 ℃、4 500 r/min 離心，用0.01 mol/L 的PBS（pH 7.2）緩沖液洗滌2 次，最后用1 mL PBS 重懸菌體并混于9 mL 的模擬胃液中，37 ℃培養，分別于0 h 和2 h 取出適量培養液，涂布MRS 平板，37 ℃培養48 h，計算乳酸菌存活率；然后取1 mL 模擬胃液處理后的培養液重懸于9 mL 的模擬腸液中，37 ℃培養6 h，分別于3 h 和6 h 取樣，涂布MRS 平板于37 ℃孵育48 h 后，根據MRS 平板上的活菌數進行耐受性評價，計數菌數為30～300 個的平板，計算乳酸菌存活率。

式中：N1為經過模擬胃、腸液培養后的乳酸菌數，CFU/mL；N0為模擬胃液培養前的乳酸菌數，CFU/mL。

1.2.8 乳酸菌抑菌性能研究

以大腸桿菌ATCC 25922、金黃色葡萄球菌ATCC 25923、鼠傷寒沙門氏菌CTCC 10982 和單核細胞增生李斯特菌ATCC 19115 做為指示菌，以LB 培養基作為指示菌培養基，使用牛津杯法[19]進行抑菌活性的測定。按1%的接種量重新轉接以上4 種致病菌，28 ℃、180 r/min 振蕩培養17 h，使其菌體濃度達107CFU/mL。取2 mL 上述指示菌液與200 mL 經融化后保持在50 ℃左右的LB 培養基混合。在平板上放置4 個無菌牛津杯，吸取20 mL 上述混合液覆蓋平板，待平板凝固后取出牛津杯，在孔中分別加入100 μL 已制備好的乳酸菌菌株發酵上清液，于37 ℃下培養24 h，測量每個孔周圍區域的直徑，以空白MRS 肉湯培養基為對照，每組試驗重復3 次。

1.2.9 乳酸菌抗生素敏感性研究

參照Weinstein 等[20]的研究方法，采用K-B 藥敏紙片瓊脂擴散法測定乳酸菌對10 種抗生素的敏感性。將乳酸菌培養液濃度調整為1×108CFU/mL，吸取100 μL 涂布于MRS 瓊脂培養基上，貼藥敏片，37 ℃培養24 h，測量抑菌圈直徑，每種藥敏片進行3個重復。測定結果以抗性（抑菌圈直徑小于等于15 mm)，中等（抑菌圈直徑為15～21mm）和敏感（抑菌圈直徑大于等于21 mm）表示[21]。

1.2.10 數據處理

試驗數據以3 次重復的平均值±標準差表示；采用SPSS v24.0 軟件對數據進行分析、Duncan 多重比較法進行差異顯著性分析，使用Origin 8.0 軟件繪圖。

2 結果與分析

2.1 乳酸菌的分離與篩選

從7 份泡菜樣品中共分離得到85 株菌株，經革蘭氏染色鏡檢和過氧化氫酶陰性試驗初步判斷，其中45 株為乳酸菌。pH 值和膽汁耐受性對乳酸菌在胃腸道運輸過程中的生存、生長和發揮作用至關重要。因此，通過對45 株菌進行耐酸、耐膽鹽試驗（結果見表1），發現有5 株菌株能在pH 4.0 條件下生長較好。將這5 株菌分別編號為：R53、R62、R63、R73 和R2。其中R2 在pH 2.5 條件下無法生長。膽鹽是細菌生長繁殖的抑制因素之一，對5 株菌株進行耐膽鹽試驗。結果顯示：R2 菌株在1 g/L 和2 g/L 的濃度條件下生長一般，在3 g/L 濃度條件下無法生長。

表1 菌株在不同pH 和牛膽鹽質量濃度下的生長情況Table 1 Growth of strains under different pH values and bovine bile salt concentrations

2.2 對篩選出的5 株乳酸菌的鑒定

將5 株乳酸菌的16S rRNA 擴增產物測序結果在NCBI 數據庫中進行BLAST 比對分析（見表2），從表2 可以看出，5 株乳酸菌與Gene Bank 數據庫中參考菌株的同源性均達97%以上。該結果也與乳酸菌的形態學特征分類與生理生化鑒定結果一致。

表2 乳酸菌菌株的16S rRNA 鑒定結果Table 2 Results of lactic acid bacteria strains by 16S rRNA identification

2.3 乳酸菌菌株的生長曲線

圖1 為篩選出的5 株乳酸菌生長曲線圖，由圖1可知，植物乳桿菌R62 和R63 生長速度最快，R73 次之，而鼠李糖乳桿菌R53 與腸膜魏斯氏菌R2 最差。0～2 h 為上述乳酸菌的生長延滯期，菌體濃度沒有明顯增加，2 h 后進入對數生長期，菌體生長代謝旺盛，快速消耗碳源，菌株R63 在14 h 時達到穩定期，最大吸光度值為8.50；菌株R62、R73 和R53，均在18 h 時菌體濃度逐漸趨于穩定，吸光度值分別達到8.31、8.02 和7.76；菌株R2 在16 h 時達到穩定期，吸光度值為7.68。楊靜等[22]在研究乳酸菌生長的試驗中，發現植物乳桿菌及糞腸球菌分別培養6 h 和8 h 后進入對數生長期，并于18 h 和16 h 吸光度值達到最大。楊英歌等[23]研究了耐酸乳酸菌的生長特性，其試驗乳酸菌株進入對數生長期和穩定期時間分別為4 h 和14 h。由此發現，種類不相同的乳酸菌進入對數生長期及穩定期所對應的培養時間不相同，對于同種乳酸菌，其試驗培養方法的不同也會影響對數生長期及穩定期時間。

圖1 乳酸菌菌株生長曲線Fig.1 Growth curves of lactic acid bacteria strains

2.4 乳酸菌菌株耐鹽性能

泡菜發酵時通常加入一定量的食鹽，既能調節泡菜風味，也能在一定程度上抑制雜菌生長，因此適用于發酵泡菜的乳酸菌應該具備較強的耐鹽性。5 株乳酸菌的耐鹽試驗結果如圖2 所示，乳酸菌的生長與NaCl 的濃度成反比，隨著NaCl 濃度的增加，各菌株的生長受到了不同程度的抑制，所有菌株在2% NaCl的MRS 肉湯培養基中生長最強，在NaCl 濃度為4%和6%時，乳酸菌生長沒有受到明顯的抑制，但高濃度（10%以上）的NaCl 在一定程度上會抑制乳酸菌的生長，鹽脅迫會損傷細胞膜結構，進而導致胞內各種代謝紊亂甚至細胞死亡。當NaCl 含量提高至8%時，菌株R53、R63、R62、R73 和R2 的吸光度值分別為1.03、0.31、0.23、0.17、0.15，NaCl 含量達到10%時上述菌株生長最差。

圖2 乳酸菌菌株在不同NaCl 濃度培養基中的生長情況Fig.2 Growth of lactic acid bacteria strains in media with different NaCl concentrations

2.5 乳酸菌菌株對模擬胃腸液的耐受情況

耐受胃腸液能力是益生菌篩選的另一個重要指標[24]。本研究采用pH 3.0 的人工模擬胃液和pH 8.0的人工模擬腸液評價篩選菌株對胃腸液的耐受能力，結果如圖3 所示，所有菌株均具有很強的耐受胃液能力。在胃液中培養2 h 后，R2 菌株的存活率為91%，其他菌株的存活率均達到98%以上。乳酸菌經過胃部后要在腸道定殖才能發揮其益生特性。在人工模擬腸液試驗中，所有菌株均具有很強的耐受腸液能力，在腸液中培養3 h 的存活率仍達到85%以上；6 h 時菌株R2 的存活力稍弱，為77%，其余菌株的存活率仍為83%以上；結果表明，人工腸液在pH 8.0 條件下對篩選菌株生長影響不大。

圖3 乳酸菌菌株的人工胃腸液存活率Fig.3 Survival rates of lactic acid bacteria strains in artificial gastrointestinal fluids

2.6 乳酸菌菌株的抑菌性能

乳酸菌生長過程中產生的代謝產物（包括有機酸、抗菌肽和細菌素等）有助于抑制其他食源性致病菌的增殖[25]。本試驗評估了分離出的5 株乳酸菌對發酵食品中常見的革蘭氏陽性致病菌（金黃色葡萄球菌和單核細胞增生李斯特菌）和革蘭氏陰性致病菌（大腸桿菌和鼠傷寒沙門氏菌）的抑制作用（見表3）。結果表明R62、R53 和R63 對指示菌均有明顯的抑制效果，R73 菌株對金黃色葡萄球菌無抑制作用，R2 菌株對金黃色葡萄球菌和單核細胞增生李斯特菌無抑制作用。不同種屬的乳酸菌產生的抑菌代謝產物不同，導致其對病原菌的抑制活性和抑制機理不同。張會生等[26]研究表明，乳酸菌發酵上清液對金黃色葡萄球菌的抑制直徑為23.10 mm，鼠傷寒沙門氏菌的抑制直徑為19.75 mm，大腸桿菌的抑制直徑為17.20 mm，這與本試驗結果相似，說明不同乳酸菌菌株的培養液均對測試致病菌株的生長具有抑制作用[27]。

表3 乳酸菌菌株對不同致病菌的抑制效果Table 3 Inhibitory effects of lactic acid bacteria strains on different pathogenic bacteria 單位：mm

2.7 乳酸菌菌株耐藥試驗

乳酸菌對抗生素的敏感性是評估潛在益生菌安全性的重要指標[28]，因為它們可能使宿主含有抗生素耐藥基因，并可橫向傳播給病原體[29]。研究均表明，乳酸菌對不同抗生素的敏感性因菌種而異，且不同菌種之間的敏感性相差可達數倍[30-31]。根據CLSI 的藥敏試驗標準[32]對乳酸菌菌株進行敏感性試驗，結果如表4 所示，乳酸菌對氨基糖苷類藥物普遍耐藥，所有分離菌株對慶大霉素、丁胺卡那霉素均具有耐藥性，對紅霉素、青霉素、氯霉素、氨芐西林、頭孢唑啉敏感。

表4 乳酸菌菌株對不同抗生素的敏感性Table 4 Sensitivities of lactic acid bacteria strains to different antibiotics

3 結論

從新疆地區農家自然發酵泡菜中共分離篩選出5 株性能優良的乳酸菌，經形態學分析和生理生化試驗并結合16S rRNA 分子鑒定為3 株Lactobacillus plantarum、1 株Lactobacillus rhamnosus、1 株Weissellaparamesenteroides，并對其進行了益生性能評價試驗。結果表明：在pH 2.5 條件下R2 菌株的生長較弱，在1 g/L 和2 g/L 的膽鹽濃度下生長一般，在3 g/L 濃度下無法生長，但其余4 株菌株R53、R62、R63 和R73耐酸和耐膽鹽能力相對較好，甚至對pH 2.5 及3 g/L牛膽鹽的嚴苛條件也具有一定耐受性；植物乳桿菌R62 和R63 生長速度最快，R73 次之，而鼠李糖乳桿菌R53 與類腸膜魏斯氏菌R2 最差；在NaCl 濃度為4%時所有菌株均具有較強的生長能力；在pH 為3.0的模擬胃液中培養2 h 菌株存活率仍達90%以上，在pH 為8.0 的模擬腸液中培養6 h 存活率仍保留77%以上。益生菌最重要的特性之一是產生短鏈脂肪酸和細菌素等化合物從而提高對病原體的抗菌活性，對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、鼠傷寒沙門氏菌和單核細胞增生李斯特菌的抑制作用進行試驗，結果表明R53、R62、R63 菌株的發酵上清液對4 種致病菌都有抑制作用，R2 菌株對金黃色葡萄球菌和單核細胞增生李斯特菌無抑制作用，R73 菌株對金黃色葡萄球菌無抑制作用。此外對常見的10 種抗生素（青霉素、氨芐青霉素、頭孢唑林、丁胺卡那、慶大霉素、紅霉素、復方新諾明、氯霉素）的敏感性研究發現，所有菌株對紅霉素、青霉素、氯霉素、氨芐西林、頭孢唑啉均敏感，對人體健康不存在潛在威脅，但對其他抗生素均有不同程度的耐藥性，其中對諾氟沙星和環丙沙星耐藥性一般，對丁胺卡那和慶大霉素耐藥性較高。