果實采后響應病原菌侵染的生理生化及分子機制研究進展

程 辰，紀艷青，冷 鵬，艾合買提江，劉 軍，劉云國,*

（1. 新疆大學生命科學與技術學院，新疆 烏魯木齊 830002；2. 臨沂大學生命科學學院，山東 臨沂 276000；3. 臨沂市農業科學院，山東 臨沂 276000）

水果為人類飲食中不可缺少的一部分，其營養豐富，但在貯藏過程中極易腐敗而造成嚴重損失。大多數情況下，水果采摘后僅簡陋包裝，甚至沒有包裝；貯藏和運輸過程中會因為擠壓、摩擦而出現機械損傷，損傷處極易受病原菌侵染而腐爛變質。果實因腐敗而造成的損失主要發生在采摘后，據測算，果蔬流通腐損率高達20%～30%，每年損失1 000 多億元[1]。因此研究果實采后對病原菌侵染發生的應答反應機制，對于減少采摘后果實的損失具有十分重要的意義。

真菌侵染是引起果實腐敗的一個主要因素（見表1），由于腐敗微生物可以寄生或腐生在種子、土壤、灌溉水、肥料中。采摘后的果實因保存不當等因素很容易受到微生物的侵染而腐爛。果實富含多種礦物質、維生素以及糖分，水分活度高，這為細菌、霉菌、酵母菌的生長提供了有利條件，但由于大多數水果的pH小于4.5，比細菌最適生長pH 值低，但適合酵母菌與霉菌生長的pH 值較廣[2-3]，因此，一些酵母菌、霉菌會在果皮表面繁殖并深入果內，使果肉變酸腐爛。若采后貯藏不當，果實非常容易被腐敗霉菌侵染（尤其是青霉屬、曲霉屬、葡萄孢屬和鏈格孢屬[4]的霉菌），從而引起果實的迅速腐爛。本文綜述了果實在生理生化和分子機制方面抗病性的途徑，以期增進人們對果實抗病性的認識和利用。

表1 幾種常見果實采后病害Table 1 Several common postharvest diseases of fruits

1 果實細胞結構表現的抗性

果實細胞壁由纖維素、半纖維素、果膠多糖和蛋白質組成，其對大多數病原菌具有防御作用[16]，病原菌通常通過釋放細胞壁降解酶來打破這一屏障，然后侵入果實內。果實細胞壁由薄壁細胞構成，比較薄，而且胞間層不發達，病原菌很易侵入[17]。但在受到病原菌的侵染后，果實細胞壁也會做出相應的抗性反應。

細胞壁作為一個被動的屏障可以抵御病原菌的侵染。例如，病原菌侵染過的果實部位，會沉積胼胝質、木質素和酚類化合物等與果實抗病性密切相關的物質。在病害發生的初期，利用掃描電鏡可以明顯觀察到果實的細胞壁會變厚，這是宿主對入侵者表現出的抗性反應。具體表現為致密性物質沉淀增多，沉淀物的主要成分為纖維素、半纖維素、β-1,3-葡聚糖等，這些物質是抵御病原菌侵染的防御系統主要成分[18-19]。近年來，越來越多的學者開始報道采后外源處理對果實細胞壁結構抗病性的影響。孫翠[20]使用掃描電鏡觀察青霉侵染后的梨果實傷口組織的超微結構，發現β-1,3-葡聚糖處理會誘導梨果實細胞壁加厚，增強其抗病性。Han 等[21]利用光學顯微技術和透射顯微技術研究了輪紋病菌在侵染果實的互作過程。在蘋果上接種病原菌后，菌絲侵入皮層厚角組織，最后發育成分生孢子器，與此同時寄主細胞壁膨脹變形，蘋果病傷組織附近形成周皮從而阻止了病原菌擴散。

在防御病原菌侵染時，由于果實品種和個體之間都存在差異，細胞壁發生的抗性反應也不同。Luo 等[22]用青霉侵染紅陽和祁陽兩個品種的獼猴桃，紅陽獼猴桃接種青霉后的發病率更低，病斑直徑較小，表現出較強的組織結構抗性。通過掃描電鏡觀察果皮結構，紅陽獼猴桃的果皮結構具有典型的抗病特征，即表皮結構致密，細胞排列整齊，微裂縫不明顯。通過對比研究抗性品種和易感品種，對揭示果實細胞壁的抗病機制有重要意義。

當病原菌突破細胞壁的防御時，還會引起細胞內部結構的變化。趙娟[23]對接菌后不同侵染時間的梨愈傷組織進行普通細胞學觀察，發現組織內部侵染進程與表觀變化一致。進行DAPI 染色后觀察發現，輪紋病菌侵染初期梨組織細胞核出現染色質的不均一，核質濃縮并有部分細胞核DNA 發生斷裂的現象。提取愈傷組織的DNA 進行瓊脂糖凝膠電泳后發現：輪紋病菌侵染的24～48 h 時出現了較為明顯的DNA Ladder現象，但是褐腐病菌侵染的組織未發現上述現象。這可能是梨組織在防制輪紋病菌侵染的過程中發生了細胞過敏性反應，這對研究果實細胞核抗性變化具有重要意義。目前，有關果實細胞核在病原菌侵染過程中形態結構變化的研究較少，尚不能確定果實細胞核如何表現抗性。

2 果實防御酶系統表現的抗性

果實被病原菌侵染后發生的保護反應是復雜的新陳代謝過程，其對病原菌侵入及擴展的生理反應是以酶的活動而實現的。健康狀態下，果實體內防御酶系統處于平衡狀態，而被病原菌侵染后，果實體內的防御酶如過氧化物酶（POD）、多酚氧化酶（PPO）、苯丙氨酸解氨酶（PAL）、脂氧合酶（LOX）等的活性會發生變化。當水果被輪紋病菌和褐腐病菌侵染后，以梨為例，其愈傷組織防御酶PPO、PAL 等的活性均呈先升高后降低的趨勢，但不同酶的酶活性高峰峰值和出現的時間不同[24]，被輪紋病菌侵染的果實愈傷組織內酶活性升高速度快、上升幅度大，酶的高活性維持時間長，說明防御酶系酶活性被誘導和加強應該是梨愈傷組織抗輪紋病的表現之一。

研究防御酶活性的變化規律可以為鑒定果實染病后的早期抗性提供參考。張寧[25]研究發現，甜瓜接種蔓枯病菌后不同時間3 種防御酶PAL、PPO 及POD 活性與甜瓜對蔓枯病的抗性關系非常密切。甜瓜受蔓枯病菌侵染后，防御酶活性比對照明顯增高，其中PAL 和PPO 活性整體呈先緩慢上升再快速上升最后緩慢回落的趨勢，在接種病菌4 d 時達到峰值；而POD 活性在接種3～5 d 時迅速上升，并且后期仍然保持活性上升的狀態。還有研究者發現[26]，果實防御系統酶在果實被侵染的各個時期都起作用，如哈密瓜中相關抗性酶：POD 等參與了抵御青霉菌侵染的反應；貯藏前期，低溫和保鮮劑處理可以誘發抗性酶活性升高；貯藏后期，霉菌侵染再次誘導防御酶活性升高，提高哈密瓜的抗病性。對采后果實中抗病性相關酶活性進行分析測定，可了解相關防御酶在控制病害中的作用，為采后果實的保鮮提供理論依據。

3 果實代謝產物表現的抗性

果實與病原菌相互作用的過程中，體內會發生一系列的信號傳遞，這會激發植物的防御體系，使植物產生抗病性反應，如超敏反應（HR）、系統獲得性抗性（SAR）和誘導的系統抗性（ISR）[27]。這樣的防御系統由幾種植物激素協作完成，如水楊酸、茉莉酸、乙烯等。

水楊酸（Salicylic acid, SA）作為植物內生激素，不僅在植物生長中扮演著重要角色，還可以激活防御信號來誘導植物合成防御化合物。Wang 等[28]在白僵菌（Botryosphaeria dothide）侵染的蘋果愈傷組織中檢測到內源水楊酸水平升高，發現蘋果組織存在通過調節SA 合成途徑來提高對白僵菌的抵抗力，說明SA 能夠誘導果實產生獲得抗菌性，從而有效抑制病程發展。

茉莉酸（Jasmonic acid, JA）也是一種植物內生調節物質，作為信號物質在植物生長發育，尤其是抵御生物和非生物脅迫等生物學進程中起著非常重要的作用[29]。JA 信號通路包含了兩條支路：一條是能對機械損傷和害蟲侵蝕做出應答的MYC 支路；另一條是能增強死體營養型病原體抗性的ERF 支路[30]。在Yao等[31]的研究中發現，接觸過砧木的柑橘被假絲酵母（Candidatus Liberibacter asiaticus，CaLAS）侵染而獲得柑橘黃龍病的幾率大大下降，iTRAQ 蛋白質組圖譜分析驗證表明：健康果實上的差異表達蛋白遠遠多于染病果實的差異表達蛋白，染病果實的許多防御相關蛋白表達下調，導致茉莉酸合成途徑、茉莉酸信號轉導途徑、小泡運輸途徑等受阻。因此，可以推測茉莉酸信號通路相關蛋白的變化與柑橘對CaLAS 病原菌的敏感性有關，還可推測果實調動次生代謝物抑制病原菌效應表達的同時，也利用其胞內免疫受體（主要是NLR 蛋白）識別進入到其細胞內部的效應蛋白，激活免疫反應，保護自身免受侵害。

乙烯作為一種常見的果實類代謝產物，作用機制為激活防御酶系統以增強果實的抗氧化性能。Dong等[32]研究發現乙烯可以誘導成熟果實在感染后產生抗性。其機理為：乙烯通過激活抗氧化系統，誘導自由基清除系統工具酶的活性，導致防御反應的發生，從而增強組織的抗性及對傷害脅迫的適應性。

研究表明，無論是抗病植物還是感病植物，都具有潛在的抗病能力，這一潛在的抗病能力可經誘導表達出來。水楊酸、茉莉酸和乙烯作為外源調控物質處理果實，可誘導果實獲得對病原菌進一步侵害的抵抗反應。

4 基因介導的果實抗病反應

4.1 果實防衛基因

防衛基因是一類在抗病機制中最終起作用的基因，受病原體等分子的誘導，它們的編碼產物直接或間接地作用于病原體[33]。它們與植物抗病基因的區別在于防衛基因及其表達產物并不像抗病基因那樣僅抗病植株所特有，而是在感病植株中也存在，只是感病植株中的防衛基因相對抗病植株被激活得慢且表達微弱而已，抗病基因編碼產物具有特異性，而防衛反應基因編碼產物具有普遍性[34]。即不同的寄主植物中有一套類似的防衛反應基因，抗病基因產物是果實防衛反應基因表達的直接或間接調節因子，防衛反應基因一般受病原體誘導表達，編碼產物比較容易分離。

4.1.1 次生物質合成基因

次生物質合成基因在果實抗病中具有重要的作用，其表達產物包括富含輕脯氨酸的糖蛋白、植保素、木質素合成關鍵酶、乙烯和酚類化合物合成酶等[35]。Liu 等[36]發現SLMYB75 基因的過度表達促進了茉莉酸的積累，并促進了JA 介導的信號通路抵抗灰霉病菌的侵染。在轉基因番茄植株中，過氧化物酶和超氧化物歧化酶的活性被激活，以清除由灰霉病菌侵染產生的過氧化氫。用掃描電鏡觀察到轉基因番茄果皮表面的蠟質雖然有所減少，但SLMYB75 通過提高果實對灰霉病的抗性，延長了果實的貯藏期。Sun 等[37]利用PCR 和cDNA 末端快速擴增技術分離到一個新的獼猴桃類NPR1 基因，命名為AeNPR1a。同源性分析表明，獼猴桃AeNPR1a 表達蛋白與葡萄的VvNPR1 表達蛋白有明顯的相似性。從獼猴桃中克隆的AeNPR1a基因在轉基因煙草中表達，提高了煙草對病原菌的耐受性。

4.1.2 細胞壁修飾相關基因

纖維素、半纖維素、β-1,3-葡聚糖等的積累是果實防衛反應中細胞壁成分變化的主要表現。研究表明，這些物質既是細胞壁的固有組成成分，也可以在病原菌侵染時通過誘導而產生，而這些物質的產生受到基因的調控。Shan 等[38]研究表明，香蕉的轉錄因子MaBZR1/2 與MaMPK14 相互作用，增強細胞壁修飾基因MaEXP2、MaPL2 和MaXET5 的轉錄抑制作用。Jaiswal 等[39]研究生物炭誘導番茄植株對土傳尖孢鐮刀菌（Fusarium oxyporum f.sp.）冠腐病的系統抗性的能力時，在番茄的轉錄分析（RNA-seq）中發現生物炭對基因表達具有啟動作用，上調了茉莉酸、油菜素甾體、細胞分裂素、生長素等與植物防御和生長相關的途徑和基因，增加了類黃酮和苯丙烷的合成。細胞壁合成的關鍵基因，如纖維素合成酶（CS）、1，4-β-D-木聚糖合成酶（XS）和糖基轉移酶（GT）合成基因的表達上調。

4.1.3 病程相關蛋白基因

病程相關蛋白是指只有在病理或病理相關的環境下才被誘導產生的蛋白[40]。Shan 等[41]研究發現香蕉果實轉錄因子WRKY、MaWRKY1 和MaWRKY2 通過與病程相關基因（PR）啟動子結合，參與了水楊酸和茉莉酸甲酯誘導的對炭疽病菌的抗性。香蕉在感染炭疽病菌（Colletotrichum musae）后，3 種轉錄因子MaNAC1、MaNAC2 和MaNAC5 的表達上調，SA 和茉莉酸甲酯（MeJA）處理也顯著增強了MaWRKY1 和MaWRKY2 的表達。病程相關蛋白可被多種因子所誘導表達，并在植物抗病以及適應其它環境脅迫中起到重要作用[42]。Li 等[43]將番茄接種灰霉后，病程蛋白相關基因表達顯著增加。過氧化物酶、抗壞血酸過氧化物酶活性的升高和過氧化氫酶活性的降低共同調節了番茄的活性氧動態平衡。此外，茉莉酸和乙烯信號通路中涉及的防御基因的誘導進一步增強了番茄的抗病性。

4.2 果實抗病基因

研究果實抗病基因是進一步研究果實抗病機制的關鍵?？共』蚪閷У目剐苑磻饕嬖谝韵聶C制：抗病基因編碼產物能鈍化病原菌侵染時產生的毒素，進而抑制病原菌的繁殖，顯性基因能編碼病原菌致病性的靶標物，若果實缺乏該靶標物就會產生抗性抗病基因表達產物，引發抗病反應[44]。張政等[45]利用農桿菌介導進行Pti6 基因遺傳轉化，獲得Pti6 基因過表達番茄植株，對其表型進行初步分析，發現在Pti6 過表達番茄果實中，CAT 和POD 活性顯著提高，CAT 和POD 的活性高低直接影響了酚類物質的代謝，有效抵御丁香假單胞菌（Pseudomonas syringae）的侵染，表明番茄Pti6 基因在番茄抗病中發揮了作用。

果實抗病基因表達產物能特異性識別病原菌中相應無毒基因編碼的產物，并產生信號分子，這些信號分子經信號傳遞因子傳遞后，啟動植物防衛基因的表達，最終對病原菌產生抗性，編碼植物新陳代謝相關酶的基因在植物病害防治中起到關鍵性作用。王秋穎[46]研究發現粉紅粘帚霉菌（Clonostachys rosea）或其代謝產物或與灰霉（Botrytis cinerea）的互作產物為誘導物激發子，引發番茄對抗灰霉病的非寄主抗性；啟動超敏反應和系統獲得性抗性，誘導潛在防御基因atpA 和Lexyl2 的活化，增強已活化基因WRKY 和MAPK 的表達；有效減輕了B.cinerea 侵染導致的細胞和葉綠體超微結構損傷；促進了PAL、PPO、H2O2和NO 升高，降低了CAT 活性，從而使番茄更加有效地抵抗灰霉的侵染。目前，有關果實抗病基因表達調控分子機制的有關資料還較為零碎，尚難形成整體認識，這將是今后研究的主題。

5 小結與展望

果實防衛反應的相關研究現已取得顯著進展，果實細胞壁是通過沉積胼胝質、木質素的方式增加厚度，抵御病原菌的侵染；受到侵染后的果實體內的防御酶，如過氧化物酶、多酚氧化酶、苯丙氨酸解氨酶活性升高，從而提高了果實的抗病性；代謝產物水楊酸和乙烯激活相關信號通路來誘導果實合成防御化合物，但仍有許多尚未解答的問題，如調控細胞壁增厚的準確機制，相關防御酶和代謝產物參與果實防衛反應的調控機制等。果實在受到病原菌侵染后，果實細胞的各種生理生化機制都在不斷地發生變化，果實靠這種動態平衡來維持自身的各種新陳代謝。但是不同類型的果實對不同病原菌的感抗性表現不同，其生理的變化也各不相同，這些變化反應了果實細胞與病原菌之間長期相互作用的復雜性，甚至同一類型果實不同個體之間也存在著較大的差異，這為研究果實采后的統一機制增加了難度。因此，需要更深層次地研究果實抗病的相關機理，為研究果實抗病機制提供更多新的思路。

隨著現代生物信息學和高通量測序方法的普及和應用，可以將果實的生理生化抗性與果實抗病基因相結合，探討果實響應病原菌侵染后的抗性反應。今后還可通過代謝工程操縱生化途徑，大規模生產果實抗病相關產物及其在田間種植上的應用，綠色高效地解決采后果實易被病原菌侵染的問題。由于果實抗病不僅受某個基因的調控，還可能與功能蛋白或基因相互作用或有關，這可以作為將來的研究方向之一。