表面增強拉曼光譜結合主成分分析快速篩查食品接觸材料中多環芳烴

葛 琨，何致峰，林佳娜，胡玉玲，李攻科

（中山大學 化學學院，廣東 廣州 510275）

近年來，由食品接觸材料（Food contact materials，FCMs）引起的食品安全問題受到了廣泛關注[1－2]。作為FCMs的重要污染物，多環芳烴（Polycyclic aromatic hydrocarbons，PAHs）由于危害大、難降解等特征亟需發展快速分析方法[3－4]。目前，常用的PAHs分析方法包括液相色譜法[5－6]、氣相色譜－質譜法[7－8]等，但這些方法所需儀器昂貴，分析過程繁瑣，無法滿足現場檢測和快速篩查的需求。表面增強拉曼光譜（Surface-enhanced Raman spectroscopy，SERS）快速、靈敏，具有分子指紋特征，非常適用于FCMs中污染物的快速篩查[9－10]，目前已經應用于多氯聯苯[11]、鄰苯二甲酸酯類[12－13]、酚類化合物[14－16]、農獸藥[17－18]、染料[19－21]等多種污染物的檢測。

但是，結構類似化合物的SERS指紋圖譜信息往往存在譜峰重疊的問題。為了解決該問題，本課題組建立了薄層色譜結合SERS檢測食品接觸材料中芳香伯胺的分析方法，得到了較好的結果[22]。另外，也有一些學者利用適配體的特異性識別作用檢測環境中的污染物[23－25]，提高選擇性。借助數據挖掘技術實現食品接觸材料中污染物的快速篩查和污染物鑒別是另一種重要途徑，其中，主成分分析（Principal component analysis，PCA）作為數據挖掘的有利工具已經被廣泛采用[26－27]。PCA可以對大數據進行降維處理，從而快速提取數據中的有用信息并進行分類。目前，SERS結合PCA已經被用于多目標物如多種疾病標記物的快速檢測[28－29]，并取得了較好的結果。

針對食品接觸材料中PAHs種類多、結構類似、拉曼信號弱以及拉曼譜峰重疊的問題，本研究利用碘化鉀（KI）對納米銀溶膠（Ag nanoparticles，AgNPs）的聚沉效應獲得高密度熱點，增強PAHs的拉曼信號，并借助數據分析軟件SPSS對獲取的拉曼譜峰進行PCA分析，考察了PCA在不同條件下的適用性，從而實現了FCMs中4種PAHs（芘、熒蒽、苯并[b]熒蒽、苯并[k]熒蒽）的快速篩查及鑒定。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

i－Raman Plus便攜式拉曼光譜儀（必達泰克光電科技（上海）有限公司），激發波長為785 nm，光譜測量范圍為150～2 800 cm－1；島津UV－2600紫外－可見分光光度計（日本島津公司）。

硝酸銀（AgNO3）、芘（Pyrene，Pyr）、熒蒽（Fluoranthene，FlA）、苯并[b]熒蒽（Benzo[b]fluorathene，BbF）及苯并[k]熒蒽（Benzo[k]fluorathene，BkF）購自上海阿拉丁生化科技股份有限公司；無水檸檬酸鈉（C6H5Na3O7）購自日本TCI化成工業有限公司；碘化鉀（KI）購自廣州化學試劑廠；上述試劑均為分析純，實驗用水為18．25 MΩ·cm的超純水。

1.2 AgNPs的制備

本實驗所用AgNPs采用文獻報道的方法合成[30]：將10．0 mL濃度為10．0 mmol/L的AgNO3加入90．0 mL超純水中并加熱至沸騰，隨后快速加入2．0 mL 10．0 g/L的檸檬酸鈉溶液，沸騰條件下冷凝回流1 h。待冷卻至室溫，獲得的AgNPs經0．22μm尼龍濾膜過濾后，避光保存于4℃冰箱備用。

1.3 遷移實驗

將聚對苯二甲酸乙二醇酯（Polyethylene terephthalate，PET）和聚丙烯（Polypropylene，PP）2種餐盒裁剪成1 cm×1 cm尺寸，總表面積為150 cm2，置于0．25 L 95%（體積分數）乙醇溶液中，于100℃下保持4 h。整個遷移過程需保持恒溫且遷移液不揮發。最后，將遷移液濃縮20倍備用。

1.4 SERS測試

將50μL KI（2．0 mol/L）與200μL PAHs標準溶液或遷移液加入96孔板中，均勻混合后，加入50μL AgNPs，均勻混合15 min后進行SERS測試。SERS測試條件為：激發波長：785 nm；掃描波長范圍：200～2 000 cm－1；積分時間：5 s；掃描功率：60 mW。

2 結果與討論

2.1 SERS測試條件優化

由于本文選擇的目標物均屬于多環芳烴，在結構和物理化學性質上有許多相似之處，因此選擇其中一個目標物可以代表其它目標物。對于溶膠狀SERS增強基底，無機鹽的加入可以有效降低溶膠體系的穩定性，從而使納米溶膠發生團聚而產生高密度的SERS熱點。因此，本文采用無機鹽加入的方法，以0．50 mg/L BbF為目標分子，并記錄BbF在687 cm－1處的拉曼強度，考察了SERS測試條件的影響，包括無機鹽種類、KI濃度、孵育時間以及KI、BbF和AgNPs的混合體積比例，結果如圖1所示。與其它無機鹽相比，KI對BbF的增強效果最好，其最佳濃度為2．0 mol/L，最佳孵育時間為 15 min，KI（2．0 mol/L）、BbF（0．50 mg/L）、AgNPs（0．2 nmol/L）的最佳混合體積比例為 1∶4∶1。

圖1 BbF的SERS測試條件優化Fig．1 Optimization of determination condition for BbF

在優化條件下，分別比較了不添加KI與添加KI的BbF的SERS圖，如圖2A所示。在不添加KI的體系中，0．50 mg/L的BbF表現出較差的SERS增強效果；添加KI后，BbF的拉曼信號得到了極大的增強，證明本實驗采用的KI體系可用于PAHs的SERS測試。另外，考察了AgNPs、AgNPs+KI、AgNPs+KI+BbF的紫外－可見吸收光譜（圖2B），從圖中可以看出，AgNPs在418 nm處有明顯的吸收峰，加入KI或KI+BbF后，AgNPs在418 nm處的吸收峰消失，即KI的加入可導致AgNPs聚沉從而提高SERS增強效果。

圖2 BbF在不同增強基底下的SERS譜圖（A）與AgNPs、AgNPs+KI、AgNPs+KI+BbF的紫外－可見吸收光譜（B）Fig．2 SERS spectra of BbF with different substrates（A）and UV－Vis absorption spectra of AgNPs，AgNPs+KI and AgNPs+KI+BbF（B）

2.2 SERS譜峰判定

在最優條件下，對4種多環芳烴進行特征譜峰判定。圖3給出了Pyr、FlA、BbF和BkF的譜峰位置，各譜峰具體振動模式見表1。從圖3和表1可以看出，4種多環芳烴的拉曼譜峰存在譜峰重疊的現象，例如，Pyr、FlA、BbF和BkF均在1 600 cm－1左右存在苯環的伸縮振動峰；FlA、BbF和BkF在1 447 cm－1左右存在C—C的伸縮振動峰；BbF和BkF均在1 040 cm－1左右存在C—H的彎曲振動峰等。其共有拉曼位移及振動模式見表2。拉曼譜峰的重疊給實際樣品中PAHs的快速篩查帶來了極大的不便，因此需要有效的數據處理方式實現PAHs的快速鑒別。

圖3 4種多環芳烴的SERS圖譜Fig．3 SERS spectra of 4 PAHs

表1 4種多環芳烴的拉曼位移及振動模式Table 1 Characteristic Raman peaks and assignment of 4 PAHs

表2 4種多環芳烴的共有拉曼位移及振動模式Table 2 The overlapping of characteristic Raman peaks and assignment of 4 PAHs

2.3 多環芳烴的PCA分析

2.3.1 同濃度多環芳烴的PCA分析為了快速鑒別4種同質量濃度的PAHs（0．50 mg/L），使用PCA對獲取的拉曼數據進行分析。首先對采集的4種PAHs的SERS譜峰進行編號，根據拉曼位移的大小排序，每個譜峰對應一個編號，如表3所示，4種PAHs共有28個SERS譜峰。將各PAHs的譜峰標出，按照上述同樣的方式進行排序，無特征峰的位置用0代替，獲得4種多環芳烴相關譜峰的陣列，將該數據導入SPSS軟件進行PCA分析。最終，依據PCA分析結果得到各次SERS測試的主成分因子得分，導入繪圖軟件后即可觀察結果。為了保證數據的有效性，每種多環芳烴采集40個SERS光譜信息，共160個SERS光譜信息，滿足樣品數：變量數（特征峰數）＞5的要求。PCA結果如表4和圖4A所示，從表4中可以看出，160條SERS光譜信息經PCA分析后被提取出3個主成分，其中第一、第二、第三主成分的特征值均大于1，且貢獻率分別44．4%、37．1%和18．1%，累計貢獻率為99．6%，因此采用該3個主成分進行得分計算并繪圖。從圖4A中可以看出，4種PAHs經PCA分析后可顯著分開，并可判斷出各PAHs的位置。上述結果表明，采用PCA分析可以對拉曼譜峰重疊的PAHs進行快速鑒定。

圖4 不同PAHs的PCA分析結果Fig．4 PCA analysis results of different PAHs samples

表3 4種多環芳烴拉曼位移的編號信息Table 3 Number information of Raman shifts for 4 PAHs

表4 PAHs總方差分析結果Table 4 Results of total variance analysis for PAHs standards

2.3.2 不同濃度多環芳烴的PCA分析在復雜體系樣品中，各個PAHs的濃度很難完全一致，因此考察了PCA對不同濃度PAHs的分離效果。分別采用0．25 mg/L的Pyr，0．75 mg/L的FlA，0．50 mg/L的BbF和1．0 mg/L的BkF進行驗證，實驗步驟與分析過程與同濃度PAHs相同，具體PCA結果如表4和圖4B所示。從表4中可以看出，160條SERS光譜信息經PCA分析后同樣被提取出3個主成分，其中第一、第二、第三主成分的特征值分別為14．1、9．2和4．5，且貢獻率分別50．4%、33．0%和16．0%，累計貢獻率為99．4%，因此該3個主成分被用于主成分得分計算。從圖4B中可以看出，4種不同濃度的PAHs經PCA分析后同樣可顯著分開，并可以明顯判斷出4種PAHs的位置。上述結果表明，采用PCA分析的方式同樣可以對不同濃度的PAHs進行快速鑒定。

2.3.3 多環芳烴混合樣品的PCA分析復雜樣品體系中，PAHs可能同時存在，因此針對PAHs混合樣品進行了PCA分析。具體過程為：采集160份PAHs混合樣品的SERS譜圖（圖5），分別對每份樣品SERS譜圖中的各特征峰按照大小順序進行標記，并將160個光譜數據分成4份，每份數據分別用于Pyr、FlA、BbF和BkF的PCA分析。結果如表4和圖4C所示，從表4中可以看出，160條拉曼信息經PCA分析后提取出3個主成分，特征值分別為12．3、9．9和5．7，貢獻率分別為44．0%、35．2%和20．5%，3個主成分的累計貢獻率為99．7%，按照主成分得分進行繪圖后（圖4C）發現4種PAHs能較好分開，但占據空間大，有誤判的風險。因此，在PCA分析的基礎上采取最小公差法進一步分析（表4和圖4D），同樣獲得3個主成分，特征值分別為11．9、10．0和6．0，在不改變累計貢獻率的基礎上，第一、第二、第三主成分貢獻率變為42．4%、35．9%和21．4%。第一主成分貢獻率下降，第二、第三主成分貢獻率上升，從而可以進一步區分4種PAHs。從圖4D中可以看出，經最小公差法處理后的PAHs被更好地分離。上述結果表明，PCA分析同樣適用于混合樣品中PAHs的分析。

圖5 一份PAHs混合樣品SERS譜圖Fig．5 SERS spectrum of a mixed PAHs sample

2.4 食品接觸材料中多環芳烴的PCA分析

最后采用PCA對PET和PP 2種FCMs遷移液中的PAHs進行篩查，圖6A和圖6B分別為PET和PP餐盒遷移液的SERS譜圖。根據圖3中的SERS譜峰，推測PET餐盒遷移液中可能存在Pyr、FlA，PP餐盒遷移液中存在Pyr、FlA、BkF。分別對PET和PP餐盒遷移液中PAHs的特征峰進行編號，其中PET餐盒共有13個特征峰，PP餐盒共有17個特征峰，因此PET和PP餐盒遷移液共采集90和120條SERS光譜信息。最后，采用“2．3．3”中PAHs混合樣品PCA分析策略進行分析。最終PCA結果如表5和圖6C、圖6D所示。從表5可以看出，PET餐盒的90條拉曼光譜信息經PCA分析后被提取出2個主成分，第一、第二主成分特征值分別為13．8和2．0，貢獻率分別為86．0%和12．4%，2個主成分的累計貢獻率為98．4%。按照主成分得分進行繪圖后（圖6C）發現Pyr和FlA被較好地分開。同樣，PP餐盒的120條拉曼光譜信息經PCA分析后也提取出2個主成分，第一、第二特征值分別為10．3和7．6，貢獻率分別為57．4%和42．1%，2個主成分的累計貢獻率為99．5%。按照主成分得分進行繪圖后（圖6D），發現Pyr、FlA和BkF同樣被明顯分開。上述結果表明，PCA分析方法可以解決PAHs的拉曼譜峰重疊問題，適用于FCMs中PAHs的快速鑒別。

圖6 PET遷移液（A）和PP遷移液（B）的SERS譜圖以及PET遷移液（C）和PP遷移液（D）中PAHs的PCA分析結果Fig．6 SERS spectra of PET migration（A），PP migration（B）and PCA analysis results of PET migration（C）and PP migration（D）

表5 FCMs遷移液總方差分析結果Table 5 Results of total variance analysis for migrates of FCMs

3 結 論

本文建立了SERS結合PCA快速篩查食品接觸材料中4種多環芳烴（Pyr、FlA、BbF及BkF）的分析方法。利用KI作為絮凝劑使納米銀溶膠聚沉獲得高密度熱點，以實現4種多環芳烴的表面增強拉曼光譜分析。針對食品接觸材料中Pyr、FlA、BbF、BkF 4種多環芳烴拉曼譜峰存在重疊難以鑒定的問題，采用PCA法分別對同一濃度、不同濃度4種多環芳烴以及4種多環芳烴混合樣品進行分析。結果表明，4種多環芳烴均可較好地分離、鑒別。將該方法用于食品接觸材料中4種多環芳烴的快速篩查及鑒別，取得了較好的效果。該方法的建立對于食品接觸材料中多環芳烴的快速篩查具有重要意義。