骨肉瘤相關長鏈非編碼RNA的研究進展

吳廷瑞，魏波

(廣東醫科大學附屬醫院骨科中心，廣東 湛江 524001)

骨肉瘤是兒童和青少年最常見的原發性惡性骨腫瘤，好發于長骨的干骺端，以股骨遠端和脛骨近端最為常見[1]。據報道，骨肉瘤的年發病率為(1～4)/100萬，且男性發病率略高于女性[2]。生長迅速和早轉移是骨肉瘤預后差的主要因素[3-5]。目前，手術與新輔助化療藥物的聯合應用已成為臨床絕大部分骨肉瘤患者的標準治療策略，患者的生存率(60%～70%)也顯著提高[6-7]。但仍有許多骨肉瘤患者對化療藥物不敏感或產生耐藥性，且腫瘤的復發和廣泛轉移也嚴重影響患者的臨床療效和遠期生存率。雖然骨肉瘤相關的分子生物學研究為其發病機制提供了一定理論依據，但有關骨肉瘤增殖凋亡、侵襲轉移以及化學耐藥性的分子機制仍未明確。隨著新一代測序技術的發展，非編碼RNA逐漸成為研究熱點。研究認為，至少有90%的人類基因組轉錄成RNA，但其中只有約2%的基因轉錄并翻譯合成蛋白質；不編碼蛋白質的RNA曾被認為是轉錄過程中的“垃圾”序列，被定義為非編碼RNA，包括微RNA(microRNA，miRNA)、環狀RNA和長鏈非編碼RNA(long non-coding RNA，lncRNA)[8-9]。研究發現，多種lncRNA的異常表達與骨肉瘤的增殖、凋亡、遷移、侵襲等惡性生物學行為有密切聯系；同時，部分lncRNA在骨肉瘤診療與預后中扮演腫瘤生物標志物的角色[10]?，F就骨肉瘤相關lncRNA的研究進展予以綜述。

1 lncRNA概述

lncRNA是一類定位于細胞核或細胞質中、長度>200 nt且不具有開放閱讀編碼區的RNA序列分子。目前lncRNA的來源尚未明確，但普遍認為可能有5個來源途徑：①編碼蛋白質序列的開放閱讀編碼區獲得結構性改變轉化為lncRNA；②染色體重新排列，兩個非轉錄片段并列產生具有多個外顯子的lncRNA；③非編碼基因逆轉座復制形成功能性逆基因或非功能性逆假基因；④兩個復制子串聯引起非編碼RNA內的相鄰重復；⑤插入轉座子形成lncRNA[11]。根據與鄰近的具有蛋白質編碼功能的基因片段的位置關系，lncRNA又可分為5類：①反義lncRNA；②正義lncRNA；③內含子lncRNA；④雙向lncRNA；⑤基因間lncRNA[11-13]。研究發現，lncRNA既可參與染色體表觀遺傳學修飾或通過與轉錄因子的相互作用在轉錄水平調節靶基因，也可參與轉錄后信使RNA的修飾等多水平調控，從而發揮促癌或抑癌作用[10]。

2 lncRNA在骨肉瘤中的差異表達

許多lncRNA在骨肉瘤中異常表達，與骨肉瘤發生、發展中大量基因及轉錄水平的顯著改變密切相關。Li等[14]通過微陣列芯片技術分析了9對人的骨肉瘤組織和對應的瘤旁組織樣本，結果發現了25 733個lncRNA，其中403個lncRNA上調，798個lncRNA下調(≥2.0倍，P<0.05)；且通過生物信息學進一步分析存在差異表達的lncRNA，發現了34條與轉錄本上調相關的信號通路及32條與轉錄本下調相關的信號通路。Zhu等[15]通過lncRNA芯片對5對骨肉瘤和癌旁組織進行分析，同時篩選差異表達的lncRNA，結果發現65個lncRNA上調，13個lncRNA下調，隨后從差異表達的lncRNA中選擇5個上調和5個下調表達程度最顯著的lncRNA，在20對骨肉瘤和瘤旁組織中進行進一步驗證，結果發現lncRNA核仁小RNA宿主基因16(ENSG00000163597)在骨肉瘤中的表達水平最高；進一步研究表明，核仁小RNA宿主基因16(ENSG00000163597)可作為miR-205的內源海綿，上調鋅指E盒鋅指蛋白1的表達，顯著增強骨肉瘤細胞的增殖能力。張浩萌等[16]通過對5對骨肉瘤組織和瘤旁組織進行高通量轉錄組學測序，篩選出差異表達的lncRNA，并驗證了lncRNA纖維肉瘤癌基因同源物G-反義RNA1(antisense RNA1，AS1)在骨肉瘤細胞內高表達且具有促進細胞增殖的作用。Liu等[17]使用微陣列芯片技術分析了7對骨肉瘤與瘤旁組織中lncRNA的表達情況，結果顯示1 995 個lncRNA上調，2 226個lncRNA下調(≥2.0倍，P<0.05)，其中特異AT序列結合蛋白2(special AT-rich sequence-binding protein 2，SATB2)的反義轉錄物SATB2-AS1是被上調的lncRNA之一，SATB2-AS1可影響SATB2基因的翻譯表達，調節骨肉瘤細胞周期并促進骨肉瘤的增殖和生長?？梢?，lncRNA在骨肉瘤發生、發展中具有重要作用，可能是診斷骨肉瘤的新型候選生物標志物或潛在的治療靶標。

3 lncRNA在骨肉瘤細胞增殖、凋亡中的作用

癌癥發生的特征為不受控制的細胞周期活動，包括不受控制的DNA復制和親代細胞分裂；細胞增殖與細胞凋亡之間的失衡促進了各種癌癥的發展，歸因于致癌基因激活和(或)抑癌基因失活。而lncRNA在骨肉瘤發生、發展過程中扮演致癌因子或抑癌因子角色，通過多種信號通路調節細胞周期進程或細胞凋亡，進而調節細胞增殖，控制骨肉瘤的進展。

3.1Wnt信號通路 Wnt信號通路在胚胎發育和成人組織動態平衡中起著至關重要的作用。腫瘤的發生和轉移與Wnt信號通路的異常激活高度相關，特別是lncRNA的失調會激活Wnt信號轉導通路，導致癌癥生長和轉移。研究顯示，位于染色體21q22.3上的lncRNA整合素β2-AS1在骨肉瘤組織中顯著上調，其通過調節Wnt/β聯蛋白(β-catenin)信號通路促進骨肉瘤的增殖并抑制骨肉瘤細胞凋亡，高表達的整合素β2-AS1預示骨肉瘤患者的總體生存率較低[18]。Li等[19]研究發現，lncRNA肌動蛋白纖維相關蛋白1(actin filament-associated protein 1，AFAP1)-AS1在骨肉瘤組織和細胞系中的表達顯著上調，AFAP1-AS1高表達與骨肉瘤患者的預后不良有關；AFAP1-AS1可以通過海綿作用捕獲miR-4695-5p，從而上調轉錄因子4的表達，轉錄因子4作為Wnt/β-catenin通路中的關鍵轉錄因子可促進骨肉瘤的增殖，AFAP1-AS1/miR-4695-5p/轉錄因子4/β-catenin信號轉導級聯通路被證實參與了骨肉瘤的發展進程。Huang等[20]發現，lncRNA BE503655在人骨肉瘤和骨肉瘤細胞系中過表達，過表達的lncRNA BE503655與Enneking分期、遠處轉移以及組織學分級密切相關，敲低lncRNA BE503655可抑制細胞增殖；進一步研究表明，lncRNA BE503655正常發揮功能取決于骨肉瘤中Wnt/β-catenin信號的調節。

3.2磷脂酰肌醇-3-激酶/蛋白激酶B(phosphatidylinositol-3-kinases/protein kinase B，PI3K/Akt)信號通路 Akt作為一種原癌基因，在調控各種細胞功能的過程中發揮重要作用。PI3K/Akt信號通路通過促進細胞增殖、抑制細胞凋亡，調控腫瘤的發生、發展。He等[21]研究表明，LINC00628在骨肉瘤組織中的表達顯著減少，LINC00628低表達預示著總生存率較低，而過表達LINC00628的骨肉瘤細胞系增殖能力被顯著抑制，細胞周期被阻滯在G0/G1期，凋亡率增加；此外，磷酸化的PI3K、Akt及Bcl-2蛋白表達水平顯著升高，而p53蛋白表達水平顯著降低，因此過表達的LINC00628通過PI3K/Akt信號通路的失活抑制骨肉瘤細胞的增殖，促進細胞凋亡。肺腺癌轉移相關轉錄本1(metastasis-associated lung adenocarcinoma transcript 1，MALAT1)是最早發現的與癌癥相關的lncRNA之一，它參與了多種類型腫瘤的發生、發展，在肝細胞癌、宮頸癌、乳腺癌、卵巢癌和結直腸癌中均觀察到MALAT1的異常表達[22-23]。慢病毒介導的MALAT1小干擾RNA可以有效下調骨肉瘤細胞株中MALAT1的表達水平，敲除MALAT1可抑制人骨肉瘤細胞的增殖；同時，增殖細胞核抗原、基質金屬蛋白酶9以及磷酸化的PI3K p85α和Akt在缺失MALAT1的骨肉瘤細胞系中均受到抑制，表明MALAT1可能是通過PI3K/Akt信號通路促進骨肉瘤增殖、轉移的致癌lncRNA，同時也被認為是骨肉瘤的潛在治療靶標[24]。另有研究發現，賴氨酰氧化酶樣蛋白1(lysyl oxidase like protein 1，LOXL1)-AS1的高表達與骨肉瘤患者的Enneking分期、腫瘤大小、遠處轉移、組織學分級以及總生存時間相關，骨肉瘤組織和細胞系中LOXL1-AS1的表達水平均高于正常骨組織和正常成骨細胞系，敲低LOXL1-AS1可通過抑制PI3K/Akt信號通路顯著抑制骨肉瘤細胞的增殖[25]。

3.3轉化生長因子-β(transforming growth factor-β，TGF-β)信號通路 TGF-β的過表達是許多癌癥的標志，包括原發性骨腫瘤。腫瘤細胞或基質細胞分泌的TGF-β能夠以旁分泌的方式有效調節微環境的表型和功能，從而刺激致瘤性微環境的變化，因此TGF-β可通過促進血管生成、骨重塑和細胞遷移，同時抑制免疫監視，在原發性骨腫瘤中發揮促癌作用[26]。與健康人相比，骨肉瘤患者血清中的TGF-β水平升高[27]。lncRNA核富集轉錄本1通過競爭性地刺激miR-339-5p介導TGF-β1的表達，增加的TGF-β1可誘導骨肉瘤細胞增殖，從而導致骨肉瘤的發展[28]。另有研究表明，lncRNA前列腺癌相關轉錄本(prostate cancer associated transcript，PCAT)6作為競爭性內源RNA通過海綿吸附miR-185-5p，上調TGF-β受體1和TGF-β受體2的表達，激活TGF-β通路，促進骨肉瘤的增殖進展[29]。

3.4信號轉導及轉錄激活因子3(signal transduction and activator of transcription 3，STAT3)信號通路 STAT3是在腫瘤細胞生長、增殖、凋亡和癌變中起重要作用的轉錄因子之一。在正常細胞中，STAT3被短暫激活以維持體內平衡，但如果STAT3在異常情況下持續被激活，則持續激活的STAT3可以觸發致癌途徑[30]。近年研究表明，應用STAT3抑制劑那巴布卡星誘導骨肉瘤細胞系可降低細胞活力并誘導細胞凋亡，應用那巴布卡星治療除了可阻斷STAT3介導的轉錄和骨肉瘤細胞下游靶蛋白外，還可抑制STAT3的表達和磷酸化[31]。Wang等[32]研究表明，lncRNA AK093407可與STAT3相互作用，并促進其磷酸化。在骨肉瘤中過表達的lncRNA持續活化STAT3通路，進而促進細胞增殖，同時抑制細胞凋亡。另有研究表明，lncRNA 膀胱癌相關轉錄本1(bladder cancer associated transcript 1，BLACAT1)在骨肉瘤組織和細胞中均上調，BLACAT1的上調預示骨肉瘤患者的預后不良；同時，上調表達的BLACAT1可以激活STAT3磷酸化途徑，加速細胞增殖生長[33]。以上研究表明，lncRNA的異常表達參與了STAT3信號通路的活化，進而加速骨肉瘤的疾病進展。

3.5其他信號通路 Gao等[34]發現，lncRNA X染色體失活特異轉錄本作為一種腫瘤機會因子，抑制X染色體失活特異轉錄本會靶向激活核因子κB/PUMA(p53 upregulated modulator of apoptosis)通路，誘導細胞凋亡并減少骨肉瘤異種移植腫瘤的生長。另有研究表明，Notch途徑被證實為一種骨肉瘤致癌途徑，lncRNA母系印跡基因3的過表達可通過抑制 Notch信號通路抑制骨肉瘤細胞的增殖，并促進骨肉瘤細胞凋亡[35]。隨著對lncRNA在多種致癌信號通路中作用機制的深入研究，lncRNA與骨肉瘤細胞更深層的增殖凋亡調控機制逐漸明晰，這些lncRNA 有望成為骨肉瘤治療的潛在靶標。

4 lncRNA對骨肉瘤侵襲轉移的影響

大多數骨肉瘤易發生早期遠處轉移，這也是骨肉瘤預后較差的重要原因[4]。腫瘤的侵襲與轉移是一個多環節、多步驟、多基因參與的復雜調控過程，包括侵襲、內滲、擴散、外滲和定植。上皮-間充質轉化(epithelial-mesenchymal transition，EMT)是一種保守的細胞過程，以上皮細胞中的細胞極性喪失和間質細胞的發育為特征，可以侵入并在體內遷移，EMT被認為是腫瘤轉移的重要機制；骨肉瘤細胞在轉移前獲得遷移增強的表型，完成EMT過程，從原發部位逃逸并侵襲鄰近的組織，然后通過脈管系統轉移至其他系統，形成遠處的繼發腫瘤灶[36]。

lncRNA也可通過調控EMT參與骨肉瘤侵襲和轉移的過程。EMT過程中伴隨上皮標志物(上皮鈣黏素)下調和間質標志物(神經鈣黏素)上調。研究表明，與癌旁的正常組織相比，lncRNA Ftx(Ftx基因是人類X染色體上的非蛋白質編碼基因，也是一段位于X染色體失活中心的保守轉錄本)在骨肉瘤組織中的表達水平更高，其表達上調與臨床分期及遠處轉移相關；lncRNA Ftx通過EMT機制影響骨肉瘤的進程，在蛋白質和信使RNA水平上皮鈣黏素水平降低，而神經鈣黏素水平升高，表明lncRNA Ftx可以作為判斷骨肉瘤進展和預后的生物標志物[37]。lncRNA PCAT1在前列腺癌中首先被發現，隨后PCAT1在其他惡性腫瘤中的作用也得到證實，包括結直腸癌、食管鱗狀癌、膀胱癌、肝癌和肺癌等，而且在這些惡性腫瘤組織中PCAT1均被上調，PCAT1的過表達促進了癌癥的進展；與正常骨組織相比，PCAT1在骨肉瘤組織中上調，PCAT1的上調與晚期臨床階段及腫瘤轉移顯著相關；體外研究表明，MG-63細胞中PCAT1的過表達增強了細胞的增殖、侵襲和遷移能力，并促進了EMT進程[38]。另有研究表明，在骨肉瘤中過表達的lncRNA HOXA遠端轉錄本可能通過與c-Myc形成正反饋環促進體外遷移、侵襲和EMT過程[39]。

5 lncRNA與骨肉瘤預后的關系

骨肉瘤發現時往往伴隨轉移，預后一般較差。既往腫瘤的大小和部位、化療反應、堿性磷酸酶水平和P-糖蛋白表達可能是判斷骨肉瘤預后的獨立因素，但隨著對骨肉瘤相關lncRNA研究的深入發現，骨肉瘤組織中異常表達的lncRNA與患者的不良預后密切相關[40]。HOX轉錄反義RNA是研究較深入的lncRNA之一，它位于HOXC基因簇反義鏈內的人類染色體12q13上，與正常組織相比，骨肉瘤組織中的HOX轉錄反義RNA表達顯著上調(P<0.001)；HOX轉錄反義RNA的過表達與晚期腫瘤階段(ⅡA期比ⅡB/Ⅲ期，P=0.043 9)和高度組織學分級(Ⅲ級比Ⅳ級，P=0.009 7)以及較低的總生存率密切相關，提示高表達的HOX轉錄反義RNA與骨肉瘤患者的不良預后相關[41]。Chen等[25]發現，骨肉瘤組織和細胞系中LOXL1-AS1的表達水平均高于正常骨組織和正常成骨細胞系，且LOXL1-AS1的高表達與骨肉瘤患者的Enneking分期、腫瘤大小、遠處轉移、組織學分級以及總生存時間相關；此外，LOXL1-AS1的過表達是骨肉瘤患者總體生存的獨立不良預測指標?？傊?，LOXL1-AS1可預測骨肉瘤患者的臨床進展和不良預后，并作為致癌lncRNA調節細胞增殖、細胞周期、遷移和侵襲。另外，一些正在探索的lncRNA也被鑒定為骨肉瘤中獨立的預后生物標志物。如一項針對94例骨肉瘤患者的腫瘤組織和相應的非癌性骨組織的鑒定研究表明，骨肉瘤組織中lncRNA?；撬嵘险{基因1(taurine up-regulated gene 1，TUG1)的表達水平顯著高于鄰近的正常骨組織，TUG1的上調與骨肉瘤患者的腫瘤大小及晚期腫瘤階段淋巴結轉移均顯著相關；Kaplan-Meier曲線顯示，TUG1高表達的骨肉瘤患者總生存時間縮短；單因素和多因素分析表明，TUG1的低表達水平是骨肉瘤患者獨立的不良預后指標[42]。這些發現表明，lncRNA有望成為骨肉瘤預后的生物標志物。將lncRNA作為預后生物標志物有利于骨肉瘤的早發現、早診斷、早治療，有助于提高骨肉瘤患者的整體生存率，具有重要的潛在臨床應用價值。

6 lncRNA與骨肉瘤的治療耐藥

在過去的幾十年中，雖然包括新輔助化療和外科手術切除在內的綜合療法已將骨肉瘤患者的5年生存率提高到了約70%[6]，但內在或獲得性化療耐藥的發生顯著阻礙了生存率的進一步提高，是癌癥治療的最大障礙[43]。骨肉瘤化療耐藥是一個多層次、多機制聯合發揮作用的復雜過程，包括藥物靶向基因表達下調、耐藥基因表達異常等。Kun-Peng等[44]通過lncRNA微陣列分析分別測定了阿霉素耐藥的人骨肉瘤細胞系和阿霉素敏感的人骨肉瘤細胞系(MG63/DXR與MG63)，結果發現，lncRNA FOXF1相鄰的非編碼發育調控RNA(FOXF1 adjacent non-coding developmental regulatory RNA，FENDRR)在阿霉素耐藥的骨肉瘤細胞中下調程度最高，且與骨肉瘤患者的不良預后呈負相關，FENDRR可能通過抑制ATP結合盒B亞家族1和ATP結合盒C亞家族1的表達發揮降低耐藥性的作用；此外，FENDRR還可以作為預測骨肉瘤患者化療敏感性和預后的生物標志物。這些結果闡明了FENDRR在降低骨肉瘤化學耐藥性方面的新作用，并提出了潛在的靶點，以提高骨肉瘤對阿霉素治療的敏感性。在骨肉瘤的順鉑化療耐藥研究方面，有研究表明，lncRNA NCK銜接因子蛋白1-AS1充當骨肉瘤的致癌基因，沉默NCK銜接因子蛋白1-AS1可改善對順鉑耐藥的骨肉瘤細胞的敏感性；進一步的機制研究表明，NCK銜接因子蛋白1-AS1通過與miR-137競爭，調節骨肉瘤細胞中的順鉑耐藥性[45]。此外，Wang等[46]報道，一種新型的lncRNA癌睪丸抗原可以被阿霉素激活，并通過競爭性結合miR-210促進骨肉瘤細胞凋亡，同時抑制細胞自噬。另有文獻報道，lncRNA NR_036444是骨肉瘤多柔比星耐藥形成過程中的重要分子，其可能作為區分骨肉瘤患者化療敏感性和判斷預后的生物標志物[47]。如果能夠能篩選出對骨肉瘤化療增敏的lncRNA并應用于臨床化療耐藥的患者，將會顯著提高化療效果，改善骨肉瘤患者的預后。

7 小 結

近年來，與骨肉瘤發病密切相關的lncRNA的研究逐漸增多，為骨肉瘤的臨床診斷以及lncRNA作為判斷預后的生物標志物提供了新的契機，也為靶向精準治療提供了理論基礎。然而，lncRNA與骨肉瘤的作用關系仍存在亟待探索和解決的問題，如現有的研究尚不能闡明lncRNA異常表達與腫瘤形成的因果關系，其深層作用機制仍待進一步探索；另外，目前的研究僅局限于單個lncRNA 對骨肉瘤惡性生物學行為等方面的影響，多個lncRNA與骨肉瘤形成的交互調控網絡值得深入研究；基因表達存在時空差異性，在不同部位的骨肉瘤以及同一部位不同腫瘤發展節點，lncRNA的表達豐度是否具有差異性，也值得深入研究。