升溫方式對鰱魚肌球蛋白結構和理化性質的影響

梁雯雯，楊 天，郭 建,，汪秋寬，叢?；?*，陳勝軍

（1.大連海洋大學食品科學與工程學院，海洋食品精深加工關鍵技術省部共建協同創新中心，遼寧省水產品加工及綜合利用重點實驗室，遼寧省水產品分析檢驗及加工科技服務技術中心，遼寧 大連 116023；2.中國水產科學研究院南海水產研究所，農業農村部水產品加工重點實驗室，廣東 廣州 510300）

隨著魚糜產業的飛速發展，魚糜需求量的上升，鰱魚（Hypophthalmichthys molitrix）作為四大淡水魚之一，因其產量豐富和價格低廉常用來生產淡水魚糜，從而提高鰱魚的附加值，并解決魚糜原料短缺的問題。傳統魚糜熱處理方式為水浴二段加熱，一段式加熱魚糜在溫度50～65 ℃之間發生凝膠劣化，肌原纖維蛋白降解嚴重，因此，為避免凝膠劣化，行業中一般先采用5～40 ℃放置一段時間再90 ℃加熱一段時間進行處理[1]。熱處理加工過程中，當樣品中心溫度要求較高時，不同處理方式加熱至樣品目標中心溫度的升溫時間差異顯著[2]，升溫過程的不同導致產品品質不同這一結論已經得到證實，但現有報道和實際熱加工生產中升溫過程往往被忽略，通常默認為此階段樣品中心溫度已經達到設定值，將升溫時間計入保溫時間。

微波加熱是一種新興的魚糜熟化方式。二段式微波加熱的魚糜凝膠強度明顯高于直接微波加熱[3]；閆虹[4]和Cao Hongwei[5]等發現先微波后水浴加熱（微波加熱代替傳統水浴二段加熱的低溫段）產品的凝膠品質低于水浴二段加熱，而先水浴加熱后微波加熱（微波加熱代替傳統水浴二段加熱的高溫段）在提高白鰱魚糜凝膠特性方面，明顯優于微波加熱，且均顯著優于傳統水浴二段加熱，無論是保溫模式還是時間依賴模式都能明顯提高魚糜凝膠的品質。目前研究對微波輔助水浴加熱的報道較少。肌球蛋白在魚糜凝膠化過程中起關鍵作用，基于交變電場變化的微波快速加熱更有利于肌球蛋白分子展開，促進肌球蛋白分子的聚集[6]。汪媛等[7]發現微波功率密度8 W/mL條件下，肌球蛋白分子在短時間（80 s）內變性和聚集同時發生，而在2.67 W/mL條件下，肌球蛋白分子則呈現逐漸變性而后聚集的趨勢。

加熱方式不同引起的升溫速率差異導致魚糜蛋白變性和聚集程度不同[8]，在實際生產中傳統水浴二段加熱過程中往往忽略的升溫過程對肌球蛋白的影響尚未有研究。本實驗比較分析了在傳統水浴二段加熱的低溫段和高溫段分別采取水浴升溫（water bath heating，WH）、微波升溫（microwave heating，MH）或微波輔助水浴升溫（microwave assisted water bath heating，MWH）對鰱魚肌球蛋白結構和理化性質的差異，以期為快速加熱方式在魚糜加工業中的應用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

鮮活白鰱購于大連熟食品交易中心，運至實驗室，宰殺后去頭去內臟，用4 ℃去離子水沖洗干凈待用。

三磷酸腺苷（化學純） 美國Sigma公司；溴化鉀（光譜純） 天津市大茂化學試劑廠；三(羥甲基)氨基甲烷（生化試劑） 國藥集團化學試劑有限公司；其余試劑均為國產分析純。

1.2 儀器與設備

DS-1高速組織搗碎機 上海標本模型廠；8807電子溫度計 得力集團有限公司；HR/T20MM立式高速冷凍離心機 湖南赫西儀器裝備有限公司；NEXUS670型傅里葉變換紅外光譜儀 美國PerkinElmer公司；Q20差示掃描量熱（differential scanning calorimeter，DSC）儀美國TA公司；Epoch2型酶標儀、SynergyH1/H1M酶標儀美國伯騰儀器有限公司；F-2700熒光分光光度計 日本Hitachi公司；G80D23CSL-Q6格蘭仕微波爐 佛山市順德區格蘭仕微波爐電器有限公司；UV-9000型雙光束紫外-可見分光光度計 上海元析儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 肌球蛋白的提取

根據Cao Liwei等[9]的提取方法略作修改。手工剔取白鰱背部白肉，切成肉糜狀，加入10 倍體積的溶液A（0.1 mol/L KCl、0.02 mol/L Tris，pH 7.0）于4 ℃下漂洗10 min，3 000 r/min均質，3 000 r/min離心5 min；沉淀于5 倍體積溶液B（0.45 mol/L NaCl、0.2 mol/L醋酸鎂、0.001 mol/L乙二胺四乙酸、0.02 mol/L Tris、0.005 mol/Lβ-巰基乙醇，pH 6.8）中懸浮，并加ATP至終濃度為0.005 mol/L，于4 ℃下放置2 h；8 000 r/min離心20 min，上清液加入3 倍體積溶液D（0.001 mol/L KHCO3）于4 ℃下放置15 min；9 000 r/min離心15 min取沉淀；沉淀加入2.5 倍體積的溶液C（0.5 mol/L KCl、0.02 mol/L Tris、0.005 mol/Lβ-巰基乙醇，pH 7.5）懸浮，于4 ℃下放置10 min后加入2.5 倍體積的溶液D稀釋，并加MgCl2至終濃度為0.01 mol/L，于4 ℃下放置過夜；10 000 r/min離心15 min，沉淀用1 倍體積溶液E（0.5 mol/L KCl、0.02 mol/L Tris，pH 7.0）溶解，5 000 r/min離心10 min，取上清液，透析過夜，所得即為肌球蛋白。采用十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）檢測肌球蛋白純度。

1.3.2 肌球蛋白質量濃度的測定

采用雙縮脲法[10]，使用Epoch2型酶標儀在540 nm波長處測定吸光度，以牛血清白蛋白（bovine serum albumin，BSA）的質量濃度為橫坐標，吸光度為縱坐標繪制標準曲線。準確吸取1 mL鰱魚肌球蛋白溶液，加入4 mL雙縮脲試劑并混合均勻，避光靜置30 min后測定540 nm波長處的吸光度，按照標準曲線求出相應的肌球蛋白質量濃度。

1.3.3 升溫方式

將提取的肌球蛋白用含0.5 mol/L KCl的20 mmol/L Tris-HCl（pH 7.5）緩沖液稀釋成10 mg/mL，分別取稀釋后的肌球蛋白溶液25 mL于50 mL離心管中，按表1進行加熱（溫度使用手持式電子溫度計測得）。WH：將離心管置于40 ℃或90 ℃的水浴鍋中，待樣品中心溫度升至40 ℃或90 ℃時停止加熱。MH：將離心管置于微波爐轉盤中心，微波間歇加熱（加熱10 s停10 s），待樣品中心溫度至40 ℃或90 ℃時停止加熱。MWH：將離心管放在裝有200 mL去離子水（20±2）℃的250 mL燒杯中，置于微波爐轉盤中心，微波間歇加熱（加熱10 s停10 s），待樣品中心溫度至40 ℃或90 ℃時停止加熱。

表1 肌球蛋白不同升溫方式Table 1 Different heating methods designed in this study

1.3.4 肌球蛋白理化性質的測定

1.3.4.1 總巰基含量的測定

根據朱東宏等[11]的方法略作修改。取10 mg/mL肌球蛋白樣液0.5 mL，加入4.5 mL的Tris-HCl（0.2 mol/L Tris、8 mol/L尿素、質量分數2% SDS，10 mmol/L乙二胺四乙酸，pH 6.8）緩沖液，混勻后取混合液4 mL，加入0.4 mL的2-硝基苯甲酸（質量分數0.1%）溶液，40 ℃保溫25 min，于412 nm波長處測定吸光度。按下式計算總巰基含量。

式中：A為412 nm波長處的吸光度；D為稀釋倍數；ρ為蛋白質量濃度/（mg/mL）。

1.3.4.2 表面疏水性的測定

根據Benjakul等[12]的方法略作修改。將10 mg/mL樣品稀釋成0.1～0.5 mg/mL，然后取各質量濃度肌球蛋白溶液2 mL加入10 μL 8-苯胺基-1-萘磺酸（8-anilino-1-naphthalenesulfonic acid，ANS）（10 mmol/L ANS、20 mmol/L Tris，pH 7.5），混勻避光靜置10 min。采用十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）檢測肌球蛋白純度，使用Image J軟件分析計算。使用SynergyH1/H1M酶標儀設置激發波長303 nm、發射波長485 nm、增益50。以熒光強度對肌球蛋白各質量濃度作圖，所得直線斜率即為肌球蛋白表面疏水性系數（ANS-S0），以此表示表面疏水性。

1.3.4.3 濁度的測定

根據Liu Ru等[13]的方法略作修改。將肌球蛋白樣液稀釋成1 mg/mL，充分混勻后靜置20 min，于320 nm波長處測其吸光度，以吸光度表示蛋白濁度。

1.3.4.4 溶解度的測定

根據周建中等[14]的方法略作修改。將肌球蛋白樣液稀釋成3 mg/mL，4 ℃放置30 min后10 000 r/min（4 ℃）離心10 min，雙縮脲法測上清液蛋白質量濃度，用上清液蛋白質量濃度與原始蛋白質量濃度的百分比表示溶解度。

1.3.4.5 色氨酸熒光光譜分析

根據Li Yue等[15]的方法略作修改。將肌球蛋白樣液稀釋成1 mg/mL。使用熒光分光光度計進行測定，設定激發光的起始波長300 nm，熒光發射波長280 nm，激發光的終止波長450 nm，該條件下熒光強度為熒光圖譜中的峰值。

1.3.4.6 紫外吸收光譜分析

根據康懷彬等[16]的方法略作修改。將肌球蛋白樣液稀釋成0.5 mg/mL，以Tris-HCl緩沖液作為空白，進行紫外吸收光譜掃描，掃描速率10 nm/s，掃描波長范圍190～600 nm。利用Origin軟件對紫外吸收光譜數據進行二階導數計算，并繪制二階導數圖譜。

1.3.4.7 傅里葉變換紅外光譜分析

根據Liu Jianhua等[17]的方法略作修改。將熱處理后的肌球蛋白冷凍干燥并粉碎，取凍干后的肌球蛋白粉末與溴化鉀按質量比1∶50充分混合，在約18 MPa的壓力下加壓2 min，掃描范圍為450～4 000 cm-1。利用Peakfit 4.12軟件在1 600～1 700 cm-1進行基線校正，在二階導數譜基礎上采用Gauss分峰擬合，根據積分面積計算各二級結構組分的相對含量[18]。本實驗僅對凝膠化過程中涉及的主要結構α-螺旋和β-折疊二級結構組分進行定量分析，各子峰與二級結構對應關系：1 610～1 639 cm-1被認為是β-折疊結構，1 661～1 680 cm-1被認為是α-螺旋結構[19]。

1.3.4.8 熱穩定性分析

根據Dergez等[20]的方法略作修改。稱量熱處理后的肌球蛋白樣液（15±1）mg于鋁坩堝中密封。以空鋁坩堝作為空白，掃描溫度為0～150 ℃，升溫速率為5 ℃/min。

1.4 數據處理與分析

數據采用Microsoft Excel 2010軟件整理，采用Origin 2018軟件進行繪圖。采用SPSS Statistics 21.0軟件對數據進行Duncan’s顯著性分析，以P＜0.05表示差異顯著。

2 結果與分析

2.1 SDS-PAGE分析結果

如圖1所示，提取的肌球蛋白主要由分子質量約為220 kDa的肌球蛋白重鏈亞基譜帶和15～25 kDa的肌球蛋白輕鏈亞基譜帶以及43 kDa的肌動蛋白條帶組成，測定肌球蛋白純度為87.8%。

圖1 鰱魚肌球蛋白的SDS-PAGE圖譜Fig. 1 SDS-PAGE patterns of myosin extracted from silver carp

2.2 升溫方式對肌球蛋白總巰基含量的影響

巰基含量的變化可作為肌球蛋白性質變化的一個重要指標。從圖2可以看出，低溫段和高溫段3 種升溫方式的總巰基含量C處理組＞A處理組＞B處理組，且C處理組顯著高于A與B處理組（A和B處理組之間無顯著差異）。與Cao Hongwei等[6]發現肌球蛋白總巰基含量在40 ℃時微波加熱比水浴加熱略有下降的研究結果一致，微波加熱的肌球蛋白分子之間形成二硫鍵，更容易導致總巰基的數量逐漸減少，由于微波與水浴加熱機制不同，微波加熱時極性分子隨著電磁場的變化而不斷變化，導致介質溫度快速升高，引起水分分布、蛋白質分子聚集方式和空間結構的改變[21]。加熱導致肌球蛋白凝膠化的其中一種條件是反應發生在較低的溫度，如40 ℃時改變肌球蛋白分子的重鏈形態，導致輕鏈脫落，暴露了肌球蛋白頭部許多部位的疏水區域，使得肌球蛋白分子形成分子間頭對頭聚集[22]。升溫至90 ℃時，微波快速加熱會使巰基轉化為二硫鍵，二硫鍵含量一定程度的提高為獲得更高的凝膠強度、促進蛋白質分子交聯提供基礎[23]。二硫鍵的形成導致大分子聚集從而使一些暴露的巰基重新被掩埋，肌球蛋白尾部纏繞形成穩定的三維網絡結構。

圖2 肌球蛋白總巰基含量Fig. 2 Effect of different heating methods on total sulfhydryl group content of myosin

2.3 升溫方式對肌球蛋白表面疏水性的影響

肌球蛋白受熱變性導致空間結構發生改變，雙螺旋結構解開使更多的疏水性氨基酸殘基暴露出來，增加了蛋白質表面疏水性[24]。從圖3可以看出，低溫段與高溫段C處理組的表面疏水性顯著低于A與B處理組（A和B處理組之間無顯著差異），當樣品升溫時間長，整體受熱多時，促進肌球蛋白結構的展開導致更多的疏水基團暴露出來，暴露的疏水基團直接參與肌球蛋白凝膠網絡的形成[6]；也可能是肌球蛋白展開但交聯程度不同所致，微波加熱時二硫鍵不易形成與聚集，不易導致表面疏水性降低[25]，這與圖2結果相互印證。在90 ℃時MH和MWH樣品的肌球蛋白聚集時間不充分，肌球蛋白分子缺少有效的時間重新排列，參與凝膠網絡形成與加強的疏水基團少，也可能是MH和MWH樣品形成的肌球蛋白聚集體沒有造成大量疏水基團被包埋[6]。不排除表面疏水性檢測過程中實驗操作或者誤差導致C處理組數據顯著降低。加熱后，肌球蛋白分子運動增強，巰基轉化成二硫鍵導致肌球蛋白構象發生變化，肌球蛋白分子內外共價鍵等斷裂使分子伸長，疏水區域暴露，一些疏水基團暴露在表面，變性的肌球蛋白分子參與分子間或分子內的氫鍵和二硫鍵以及靜電和疏水相互作用，導致聚集[26-28]。

圖3 肌球蛋白表面疏水性Fig. 3 Effect of different heating methods on surface hydrophobicity of myosin

2.4 升溫方式對肌球蛋白濁度的影響

濁度反映了溶液中懸浮顆粒的數量和大小，可以用來表征蛋白質聚集的程度，蛋白質聚集后溶液中懸浮顆粒的直徑增加，聚集到一定程度時可能導致光散射，阻礙光的傳播[29]。低溫段3 種升溫方式的濁度差異顯著（P＜0.05），且C1處理組＞B1處理組＞A1處理組（圖4），表明不同升溫方式的肌球蛋白在低溫條件發生了不同程度的交聯。高溫段3 種升溫方式，C2處理組的濁度顯著高于A2和B2處理組（P＜0.05），但A2和B2處理組的濁度無顯著差異（P＞0.05），不同升溫速率導致肌球蛋白變性和聚集的相對速率不同，使得肌球蛋白分子展開和分子間聚集的程度不同[30]，WH樣品的濁度最大，表明肌球蛋白發生了一定的構象變化，形成的聚集體越大，變性程度越大，而MH降低了與肌球蛋白聚集相關的濁度[6]。肌球蛋白的變性和聚集過程實際上反映了魚糜凝膠的形成過程。在微波加熱過程中，交變電場會改變蛋白質分子內部的電荷場和電場分布，從而破壞蛋白質之間的靜電相互作用，肌球蛋白分子通過疏水相互作用和其他分子間作用力聚集[31]。

圖4 肌球蛋白濁度Fig. 4 Effect of different heating methods on turbidity of myosin

2.5 升溫方式對肌球蛋白溶解度的影響

溶解度是反映蛋白質變性程度的指標之一。從圖5可以看出，低溫段、高溫段3 種升溫方式的肌球蛋白溶解度均差異顯著（P＜0.05），A處理組＞B處理組＞C處理組。A1處理組溶解度高與Nguyen等[32]研究微波處理所得酶解水產副產物在pH值為7條件下水解比水浴處理具有較高的溶解性的結果一致，適當的微波處理有助于蛋白質的展開，在這種情況下內部的親水性氨基酸可能更多的接觸水分子[33]。溶解度變化與濁度變化呈負相關關系，尤其是低溫段，反映出肌球蛋白變性聚集過程，微波加熱除了有熱效應還有場效應，會引起肌球蛋白之間的相互作用減弱[34]。溶解度的降低表明蛋白分子間的靜電和疏水相互作用不平衡，肌動球蛋白快速變性和聚集；溶解度升高表明分子間的靜電排斥作用大于疏水相互作用[35]。

圖5 肌球蛋白溶解度Fig. 5 Effect of different heating methods on solubility of myosin

2.6 不同升溫方式的肌球蛋白色氨酸熒光光譜

肌球蛋白的球狀頭部和棒狀尾部含有大量的色氨酸殘基，色氨酸殘基的暴露情況可以反映蛋白質的三級結構變化，可以通過檢測肌球蛋白的色氨酸熒光強度來反映構象變化[36]。從圖6可以看出，鰱魚肌球蛋白的熒光峰在340 nm波長處左右。3 種升溫方式色氨酸熒光強度A處理組＞B處理組＞C處理組，熒光強度越高說明肌球蛋白越容易變性展開，對三級結構的影響越大，MH樣品暴露的色氨酸殘基多，MH樣品的光譜藍移程度高于MWH樣品，表明發射基團位于更為疏水的微環境。升溫至相同溫度，MH和MWH樣品的肌球蛋白的變性程度小于WH樣品，說明微波有效地抑制了加熱過程中蛋白質結構的變化，這表明可能存在由微波輻射產生非熱效應[37]，有待進一步實驗驗證。

圖6 不同升溫方式的肌球蛋白色氨酸熒光光譜Fig. 6 Tryptophan fluorescence spectra of myosin subjected to different heating methods

2.7 不同升溫方式肌球蛋白紫外吸收光譜的變化

色氨酸（tryptophane，Trp）或酪氨酸（tyrosine，Tyr）等殘基的微環境的變化在一定程度上能夠反映蛋白質的三級結構變化。當所處的微環境疏水時，特征譜峰會發生藍移，芳香族殘基暴露于肌球蛋白分子表面。從圖7可以看出，不同升溫方式的肌球蛋白的紫外吸收光譜的峰位置基本一致，在波長280 nm左右出現吸收峰，波長未發生遷移，這一現象表明肌球蛋白中酪氨酸和色氨酸的微環境變化不明顯。低溫段和高溫段3 種升溫方式的紫外吸收峰強度MH和MWH均高于WH，表明微波導致色氨酸和酪氨酸的吸收較強，這種升溫方式可能改變了蛋白質的結構，促進色氨酸和酪氨酸轉移到表面，導致紫外吸收更強。

圖7 肌球蛋白在不同升溫方式紫外吸收光譜Fig. 7 UV absorption spectra of myosin subjected to different heating methods

為了進一步研究不同升溫方式的肌球蛋白構象的細微差異，得到的紫外吸收二階導數光譜在289 nm和296 nm波長處附近有兩個正吸收峰，在285 nm和291 nm波長處附近有兩個負吸收峰。r取決于Trp和Tyr的相對含量和暴露于水相的量，即r＝a/b（a和b分別為第一次和第二次正吸收峰與負吸收峰的差值），r越高，表明Tyr殘基的表面暴露量越大[38]。C1和C2處理組在289 nm波長處的吸收峰紅移程度較其他升溫方式大，表明極性環境減弱，會導致表面疏水性降低，與圖3表面疏水性結果一致。如表2所示，低溫段3 種升溫方式r由大到小依次為C1處理組＞B1處理組＞A1處理組，表明WH暴露的Tyr殘基更多，MH和MWH對三級結構的影響更小。高溫段3 種升溫方式r由大到小依次為B2處理組＞A2處理組＞C2處理組，表明升溫到高溫段的肌球蛋白三級結構對微波更敏感，在90 ℃時更有利于肌球蛋白分子展開，肌球蛋白分子內的疏水殘基更容易暴露[6]，與酪氨酸熒光光譜高溫段分析結果一致。

表2 285 nm/289 nm和291 nm/296 nm正吸收峰與負吸收峰的峰谷值比Table 2 Peak-to-trough ratios of positive and negative absorption peaks at 285 nm/289 nm and 291 nm/296 nm

2.8 不同升溫方式肌球蛋白傅里葉變換紅外光譜

傅里葉變換紅外光譜可以用來研究肌球蛋白的二級結構，酰胺I帶（1 600～1 700 cm-1）是蛋白質二級結構較為主要的研究內容，1 664 cm-1處的特征吸收峰歸屬于酰胺I帶C＝O的伸縮振動。從圖8中可以看出，不同升溫方式的鰱魚肌球蛋白的傅里葉變換紅外光譜峰型基本一致，峰位置也基本一致。低溫段3 種升溫方式下，α-螺旋相對含量C1處理組＞A1處理組＞B1處理組，β-折疊相對含量B1處理組＞C1處理組＞A1處理組，MH的-β折疊相對含量比MWH的低。Liu Ru等[39]發現α-螺旋的展開和β-折疊含量的增加有利于豬肌球蛋白的凝膠化，在熱誘導肌球蛋白凝膠形成過程中普遍存在α-螺旋含量減少、β-折疊片段含量增多的現象，其中α-螺旋含量的減少與肌球蛋白的展開有緊密的關系[29]，說明WH樣品的肌球蛋白變性程度高，MWH促進肌球蛋白展開。α-螺旋結構的穩定性主要來源于羰基（C＝O）和氨基（—NH2）之間的氫鍵，當溫度超過35 ℃時，氫鍵逐漸被破壞，導致α-螺旋結構含量減少[40]。高溫段3 種升溫方式下，α-螺旋相對含量A2處理組＞B2處理組＞C2處理組，β-折疊相對含量C2處理組＞B2處理組＞A2處理組，在加熱條件下α-螺旋含量降低代表蛋白質分子展開程度增加，而β-折疊含量增加代表蛋白質分子間聚集程度增加[41]，與圖4高溫段濁度結果一致。不論低溫段還是高溫段升溫，MH樣品的β-折疊相對含量低于MWH樣品，MH樣品的α-螺旋相對含量高于MWH，說明MH樣品的肌球蛋白變性程度高，肌球蛋白展開程度低，β-折疊相對含量結果也與表3中β-折疊/（α-螺旋+β-折疊）比值增加的結果一致。微波加熱和微波輔助加熱升溫方式在較低溫度更容易破壞肌球蛋白分子內的α-螺旋結構，導致結構逐漸消失，但在較高溫度時比傳統水浴加熱升溫方式，更多地保留了α-螺旋結構。

圖8 不同升溫方式肌球蛋白傅里葉變換紅外光譜Fig. 8 FTIR spectra of sliver carp myosin subjected to different heating methods

表3 不同升溫方式下肌球蛋白α-螺旋和β-折疊的比例Table 3 Percentages of α-helix and β-sheet structures in silver carp myosin subjected to different heating methods

2.9 不同升溫方式下肌球蛋白熱穩定性

DSC能夠直觀地反映肌球蛋白在變性時吸收的熱量值，根據峰值和峰面積可以分別確定肌球蛋白的熱轉變溫度Td和熱焓值ΔH，不同升溫方式的肌球蛋白DSC圖譜如圖9所示，熱轉變溫度和熱焓值結果如表4所示。肌球蛋白受溫度改變而發生變性，不同升溫方式的鰱魚肌球蛋白變性溫度為46.56～54.78 ℃，結果與Rahbari等[42]的報道差異不大，不同升溫方式的肌球蛋白吸收峰未完全消失，表明肌球蛋白的三級結構未完全變性。低溫段3 種升溫方式下，A1和C1處理組表現出非常小的熱焓值，然而，B1處理組的肌球蛋白熱焓值較高，同時B1處理組的熱轉變溫度高，表明肌球蛋白越不容易變性或部分肌球蛋白沒有變性，MWH能夠改變肌球蛋白的熱穩定性，C1處理組的肌球蛋白熱轉變溫度最低，說明該方式的肌球蛋白熱穩定性低，變性程度大，抗變性能力弱。高溫段3 種升溫方式下，A2處理組的肌球蛋白熱焓值明顯高于其他升溫方式，熱轉變溫度較低，而B2處理組的熱轉變溫度高，表明MWH的肌球蛋白的空間結構是穩定的，因此在加熱時不易聚集，與圖3高溫段濁度加熱結果一致。

表4 不同升溫方式肌球蛋白熱穩定性Table 4 Thermal stability of myosin under different heating methods

圖9 不同升溫方式肌球蛋白DSC圖譜Fig. 9 DSC spectra of sliver carp myosin subjected to different heating methods

3 結 論

升溫方式不同導致鰱魚肌球蛋白結構和性質出現差異。MH和MWH與WH相比明顯縮短了升溫時間，大大提高了效率。低溫段MH和MWH促進肌球蛋白交聯，MWH促進肌球蛋白展開，有利于肌球蛋白的凝膠化。高溫段WH樣品的肌球蛋白聚集程度高于MH和MWH樣品，MH對肌球蛋白三級結構影響較大，暴露出更多的氨基酸殘基。在生產加工過程中不能忽略升溫過程，MWH促進蛋白凝膠化效果優于MH，在實際生產中生產效率明顯高于WH。推測可能存在一定的非熱效應，后續實驗需采取能精準控溫的計算機模擬方法對實驗結果進一步驗證。