miR-3619-5p靶向PFKFB3抑制結腸癌細胞的增殖、遷移和侵襲

郭銀謀，王玉梅，陳貢斌，岳培茹，周威

(商丘市第一人民醫院 腫瘤一科，商丘 476100)

結腸癌是常見的消化道惡性腫瘤，轉移和侵襲性較強，患者確診時多為晚期，且目前年輕人結腸癌的死亡率有升高趨勢[1]?，F階段，結腸癌的分子靶向治療給中晚期結腸癌患者的治療提供了新的選擇。結腸癌中差異表達的miRNA可能是結腸癌的診斷標志物或治療靶點[2]。研究表明，miR-3619-5p可抑制惡性腫瘤進展，在前列腺癌[3]、乳腺癌[4]、膀胱癌[5]中表達下調。本研究通過StarBase預測發現，6磷酸果糖2激酶/果糖-2，6-二磷酸酶3(6-phosphofructo-2-kinase/fructose-2，6-biphosphatase 3，PFKFB3)可能是miR-3619-5p的靶基因。PFKFB3已被證明在結腸癌組織中表達上調，其miRNA水平的高表達與患者惡性表型及不良預后相關[6]。但miR-3619-5p在結腸癌組織中的表達、作用及其與PFKFB3的關系目前尚未可知。因此，本研究假設miR-3619-5p通過靶向PFKFB3影響結腸癌細胞的增殖、遷移和侵襲，并對此進行驗證。

1 材料與方法

1.1 材料選取2018年3月—2019年3月于河南省商丘市第一人民醫院病理檢查確診為結腸癌的患者手術切除的結腸癌組織及癌旁組織(距離結腸癌組織邊緣>1.5 cm)各35例，患者男性16例、女性19例，年齡(49.2±16.9)歲。所有患者術前未接受放療和化療，并對研究知情同意。

人結腸癌細胞株HCT116購自北京北納創聯生物技術研究院；胰蛋白酶購自Sigma-Aldrich公司；RPMI 1640培養液、FBS購自Gibco公司；Lipofectamine 2000轉染試劑、RNA提取試劑TRIzol、Real-time PCR 試劑盒、反轉錄試劑盒購自寶生物工程(大連)有限公司；CCK-8檢測試劑盒購自上海碧云天生物技術有限公司；PFKFB3過表達載體(pcDNA-PFKFB3)、PFKFB3抑制物(si-PFKFB3)、miR-3619-5p模擬物(miR-3619-5p)、miR-3619-5p抑制劑(anti-miR-3619-5p)、陰性對照(pcDNA、si-NC、miR-NC和anti-miR-NC)、PFKFB3野生型(WT-PFKFB3)和突變型(MUT-PFKFB3)雙熒光素酶報告載體均購自上海吉瑪制藥有限公司；PFKFB3、細胞周期蛋白D1(Cyclin D1)、p21、基質金屬蛋白酶2(matrix metalloprotease 2，MMP-2)、基質金屬蛋白酶9(matrix metalloprotease 9，MMP-9)和GAPDH抗體購自Abcam公司；Transwell板購自Corning公司；雙熒光素酶報告系統(Dual-Luciferase Reporter Assay System)購自Promega公司；qRT-PCR儀購自Bio-Rad公司。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養 將結腸癌細胞HCT116常規復蘇，培養于含10 % FBS的RPMI 1640培養液中，在培養液中添加100 U/mL青霉素和100 μg/mL鏈霉素，置于飽和、濕潤、37 ℃、5% CO2培養箱中培養。待細胞生長至對數生長期，進行消化傳代。

1.2.2 miR-3619-5p和PFKFB3 mRNA表達的qRT-PCR檢測 用TRIzol試劑提取結腸癌組織樣本、癌旁組織和HCT116細胞的總RNA，反轉錄合成cDNA，再以得到的cDNA為模板，按照qRT-PCR的說明書進行反應，檢測miR-3619-5p和PFKFB3 mRNA水平。運用2-ΔΔ Ct方法進行數據分析。qRT-PCR引物詳見表1。

表1 qRT-PCR引物

1.2.3 細胞轉染 將細胞稀釋至1×l06個/mL，取100 μL接種于6孔板中，待細胞培養至融合度達70%時，根據Lipofectamine 2000轉染試劑說明書轉染HCT116細胞。將載體miR-NC、miR-3619-5p、si-NC、si-PFKFB3、anti-miR-NC、anti-miR-3619-5p、miR-3619-5p+pcDNA、miR-3619-5p+pcDNA-PFKFB3分別轉染至HCT116細胞，分別記為miR-NC組、miR-3619-5p組、si-NC組、si-PFKFB3組、anti-miR-NC組、anti-miR-3619-5p組、miR-3619-5p+pcDNA組、miR-3619-5p+pcDNA-PFKFB3組。轉染48 h收集細胞，檢測miR-3619-5p和PFKFB3的表達以進行轉染驗證，驗證成功后進行后續試驗。

1.2.4 細胞增殖的CCK-8試驗檢測 將miR-NC組、miR-3619-5p組、si-NC組、si-PFKFB3組、miR-3619-5p+pcDNA組、miR-3619-5p+pcDNA-PFKFB3組HCT116細胞以100 μL/孔(1×104個/mL)接種于96孔板中，在37 ℃、5% CO2培養箱中培養，在培養至24、48和72 h時每孔加入10 μL CCK-8溶液，繼續培養2 h，用酶標儀測定光密度[D(450 nm)]值。

1.2.5 PFKFB3、Cyclin D1、p21、MMP-2和MMP-9蛋白的Western blotting檢測 收集上述“1.2.3”項分組的處于對數生長期的HCT116細胞，裂解細胞，提取細胞總蛋白。用SDS-PAGE分離蛋白樣本，轉PVDF膜，然后將膜置于脫脂牛奶溶液中室溫封閉2 h，洗膜后分別加入稀釋的一抗：PFKFB3抗體(1∶1 000)、Cyclin D1抗體(1∶2 000)、p21抗體(1∶1 500)、MMP-2抗體(1∶2 000)、MMP-9抗體(1∶1 000)和GAPDH抗體(1∶5 000)，4 ℃孵育過夜。洗膜2次，加入酶標二抗，室溫孵育2 h，顯影，拍照。以GAPDH為內參分析蛋白的表達水平。

1.2.6 細胞遷移和侵襲的Transwell試驗檢測 (1)遷移試驗：收集轉染后的HCT116細胞，在無血清培養液中饑餓培養過夜，用無血清RPMI 1640培養液將細胞稀釋至1×106個/mL，然后取100 μL加入Transwell上層小室，下層培養孔加入500 μL含10%FBS的RPMI 1640培養液。置培養箱中培養24 h，隨后用棉簽拭去上層小室內層未遷移的細胞，采用多聚甲醛固定遷移細胞，結晶紫染色，顯微鏡下取5個視野計數遷移細胞，取平均數即為遷移細胞數。(2)侵襲試驗：將液化的Matrigel用低溫RPMI 1640 培養液以1∶3比例稀釋，取50 μL平鋪入Transwell上層小室，在37 ℃固化3 h，之后的步驟同遷移試驗。

1.2.7 雙熒光素酶報告試驗 根據上述“1.2.3”項的方法進行細胞轉染，將構建好的PFKFB3野生型(WT-PFKFB3)和突變型(MUT-PFKFB3)雙熒光素酶報告載體分別與miR-NC或miR-3619-5p共轉染HCT116細胞，轉染48 h后收集細胞，根據試劑盒說明書檢測熒光素酶活性。

2 結果

2.1 miR-3619-5p和PFKFB3在結腸癌組織中的表達與癌旁組織比較，結腸癌組織中miR-3619-5p水平顯著降低(P<0.05，圖1A)，PFKFB3 mRNA和蛋白水平顯著升高(P<0.05，圖1B、C)。

注：A. miR-3619-5p的表達分析；B. PFKFB3 mRNA的表達分析；C.PFKFB3蛋白的表達分析, N1、N2、N3為癌旁組織， T1、T2、T3為結腸癌組織。與癌旁組織比較，*P<0.05。圖1 結腸癌組織和癌旁組織中miR-3619-5p和PFKFB3的表達

2.2 miR-3619-5p過表達對結腸癌細胞HCT116增殖、遷移和侵襲的影響過表達miR-3619-5p組的結腸癌細胞HCT116中miR-3619-5p的水平升高(P<0.05)，細胞在24、48和72 h的D值均顯著降低(P<0.05)，遷移和侵襲細胞數減少(P<0.05)，Cyclin D1、MMP-2和MMP-9蛋白表達量降低(P<0.05)，p21蛋白表達量升高(P<0.05)。這說明過表達miR-3619-5p可以抑制HCT116細胞增殖、遷移和侵襲。詳見圖2。

2.3 抑制PFKFB3表達對結腸癌細胞HCT116增殖、遷移和侵襲的影響轉染si-PFKFB3組的結腸癌細胞HCT116中PFKFB3的水平降低(P<0.05)，Cyclin D1、MMP-2和MMP-9蛋白表達量降低(P<0.05)，p21表達量升高(P<0.05)，細胞在24、48和72 h的D值均顯著降低(P<0.05)，遷移、侵襲細胞數減少(P<0.05)。這說明抑制PFKFB3可以抑制HCT116細胞增殖、遷移和侵襲。詳見圖3。

注：A.抑制PFKFB3表達對結腸癌細胞HCT116 PFKFB3、Cyclin D1、p21、MMP-2和MMP-9蛋白表達的影響；B.抑制PFKFB3表達對結腸癌細胞HCT116增殖的影響；C.抑制PFKFB3表達對結腸癌細胞HCT116遷移和侵襲的影響(結晶紫染色，×200)。與si-NC組比較，*P<0.05。圖3 抑制PFKFB3表達對結腸癌細胞HCT116增殖、遷移和侵襲的影響

2.4 miR-3619-5p靶向調控PFKFB3的表達StarBase預測結果顯示，miR-3619-5p與PFKFB3序列中含有互補的位點(圖4A)。雙熒光素酶報告試驗結果顯示，與miR-NC組比較，miR-3619-5p組WT-PFKFB3的螢火蟲熒光素酶相對活性顯著下降(P<0.05)，而MUT-PFKFB3的螢火蟲熒光素酶相對活性沒有明顯變化(圖4B)。Western blotting結果顯示，上調miR-3619-5p可降低PFKFB3水平，下調miR-3619-5p可顯著提高PFKFB3水平(圖4C)。這說明miR-3619-5p可靶向負調控PFKFB3的表達。

注：A. PFKFB3的3＇-UTR中含有與miR-3619-5p互補的核苷酸序列；B. 雙熒光素酶報告試驗；C. miR-3619-5p調控PFKFB3蛋白的表達。與miR-NC組比較，*P<0.05；與anti-miR-NC組比較，#P<0.05。圖4 miR-3619-5p靶向調控PFKFB3的表達

2.5 PFKFB3過表達逆轉miR-3619-5p過表達對結腸癌細胞HCT116增殖、遷移和侵襲的作用為確認miR-3619-5p是否通過調控PFKFB3影響結腸癌細胞HCT116的惡性生物學行為，在上調miR-3619-5p的同時過表達PFKFB3。結果顯示，與miR-3619-5p+pcDNA組比較，miR-3619-5p+pcDNA-PFKFB3組的HCT116細胞中PFKFB3的水平增加，細胞D值在24、48和72 h均升高，侵襲和遷移細胞數增加，Cyclin D1、MMP-2和MMP-9蛋白水平升高，p21蛋白水平降低(P<0.05)。這說明過表達PFKFB3可逆轉miR-3619-5p過表達對HCT116細胞增殖、侵襲和遷移的影響。詳見圖5。

注：A.PFKFB3和細胞增殖、遷移、侵襲相關蛋白的表達；B. PFKFB3過表達逆轉了miR-3619-5p過表達對結腸癌細胞HCT116增殖的作用；C.PFKFB3過表達逆轉了miR-3619-5p過表達對結腸癌細胞HCT116遷移和侵襲的作用 (結晶紫染色，×200)。與miR-NC組比較，*P<0.05；與miR-3619-5p+pcDNA組比較，#P<0.05。圖5 PFKFB3過表達逆轉miR-3619-5p過表達對結腸癌細胞HCT116增殖、遷移和侵襲的作用

3 討論

miRNA在多種惡性腫瘤中表達上調或下調。研究發現，在結腸癌患者血清或腫瘤組織中有多種miRNA表達異常，這可能有助于結腸癌的診斷、治療、臨床療效評估和發現新的治療靶點[7-8]。研究發現，miR-3619-5p在非小細胞肺癌患者血清[9]、順鉑耐藥的皮膚鱗狀細胞癌(cutaneous squamous-cell carcinoma，CSCC)細胞[10]中表達下調，發揮抑癌的作用，其過表達可抑制肺癌細胞的生長和侵襲，還可抑制CSCC細胞的增殖和順鉑抵抗。在甲狀腺癌(thyroid carcinoma，TC)中，miR-3619-5p是LINC01410的作用靶點，LINC01410/miR-3619-5p/FOXM1正反饋環可調節TC細胞增殖和凋亡[11]。以上研究結果均說明，miR-3619-5p與惡性腫瘤的進展密切相關，但其在結腸癌中的表達和作用尚不清楚。本研究分別檢測了35例結腸癌組織和癌旁組織，結果顯示miR-3619-5p在結腸癌組織中低表達。并且，過表達miR-3619-5p可提高p21蛋白表達，抑制Cyclin D1、MMP-2和MMP-9蛋白表達，抑制結腸癌細胞HCT116增殖、遷移和侵襲，這說明過表達miR-3619-5p可抑制結腸癌進展。

此外，本研究通過StarBase預測發現，PFKFB3序列中含有與miR-3619-5p互補的位點，提示miR-3619-5p與PFKFB3之間可能是靶向結合關系。PFKFB3是糖酵解的重要調節因子，也是DNA雙鏈斷裂同源重組修復的關鍵因子。PFKFB3在癌細胞中廣泛高表達，具有致癌性，與癌細胞增殖、血管侵襲、耐藥和腫瘤微環境有關[12]，已成為一種新的抗癌靶點[13]。研究發現，在腫瘤異種移植模型中，抑制PFKFB3可增強癌細胞對順鉑的敏感性[14]。PFKFB3在肝細胞癌[15]、肺腺癌[16]、乳腺癌[17]等惡性腫瘤中高表達，調控癌細胞的增殖、遷移、侵襲、血管生成及耐藥性等。PFKFB3在結腸癌組織及結直腸腺癌組織中同樣高表達，其高表達與腫瘤大小、分化程度、侵襲、轉移及患者生存期有關[6，18]。本研究發現，PFKFB3在結腸癌組織中表達上調，且抑制PFKFB3可抑制結腸癌細胞HCT116增殖、遷移和侵襲。PFKFB3可以被多種miRNA調控，如miR-449c通過靶向PFKFB3抑制胃癌細胞的遷移和侵襲[19]，miR-488通過靶向PFKFB3抑制前列腺癌細胞的增殖和糖酵解[20]，miR-26b通過下調PFKFB3表達抑制骨肉瘤細胞的遷移和侵襲[21]。本研究雙熒光素酶報告試驗和Western blotting結果顯示，miR-3619-5p可靶向負調控PFKFB3的表達；通過同時過表達miR-3619-5p和PFKFB3的試驗發現，過表達PFKFB3可逆轉miR-3619-5p過表達抑制HCT116細胞增殖、侵襲和遷移的作用，間接驗證了在結腸癌細胞HCT116中miR-3619-5p對PFKFB3有負調控關系。本研究中，患者樣本PFKFB3 mRNA與蛋白變化倍數一致，提示體內PFKFB3的表達調控主要是以轉錄調控為主。miRNA主要通過轉錄后水平調控蛋白表達，但是患者樣本中PFKFB3在轉錄水平已經變化，并與蛋白變化倍數一致，這無法排除miRNA主要通過轉錄調控PFKFB3。因此，miR-3619-5p對PFKFB3的具體調控機制仍值得進一步探索。

綜上所述，本研究顯示在結腸癌組織中miR-3619-5p下調，PFKFB3上調，miR-3619-5p可靶向PFKFB3抑制HCT116細胞的增殖、遷移和侵襲。這表明miR-3619-5p和PFKFB3可能是結腸癌治療的潛在分子靶點。