定量有害結局路徑(qAOP)評估環境化學物質毒性的研究進展Ⅱ：類二噁英物質及AhR-qAOP

田明明，彭穎,2,*，張睿，張瀚心，張效偉,#

1. 污染控制與資源化研究國家重點實驗室，南京大學環境學院，南京 210023 2. 流域環境生態工程研發中心，北京師范大學自然科學高等研究院，珠海 519087 3. 濟南大學水利與環境學院，濟南 250022 4. 生態環境部固體廢物與化學品管理技術中心化學品部，北京 100029

二噁英及類二噁英物質(dioxin-like compounds, DLCs)通常具有高毒性，通過激活芳香烴受體(aryl hydrocarbon receptor, AhR)，進而引起生物體的生殖發育毒性、免疫毒性、肝毒性及致癌等生物毒性[1-3]。環境中不斷檢出具有二噁英結構并存在潛在生物毒性的新型類二噁英物質，評估其生態與健康風險對化學品風險防控具有重要意義。傳統的化學品毒性測試已不能滿足當前化學品風險評估的需求，針對環境中大量具有明顯類二噁英結構的新型污染物和未知污染物，其生態危害和風險具有很高的不確定性，缺乏系統的毒性評估，急需對現有的化學物質毒性評估方法和策略進行創新。

在對DLCs致毒機制的研究基礎上，基于芳香烴受體(aryl hydrocarbon receptor, AhR)的有害結局路徑(adverse outcome pathway, AOP)(AhR-AOP)的發展為準確評估潛在DLCs的生態與健康風險提供了新的策略，可指導預測新型類二噁英污染物的毒性及建立以生態物種保護為目標的環境基準[2]。但要實現該目的，首先要在發展成熟定性的AhR-AOP基礎上進一步發展定量AOP。定量AOP(quantitative AOP, qAOP)可在化學品風險評估中提供從描述性知識到預測有害結局的橋梁，它是有一個或多個基于生物學的計算模型組成，通過計算模型描述分子啟動事件(molecular initiative events, MIEs)、關鍵事件(key events, KEs)與有害結局(adverse outcomes, AOs)之間的關鍵事件的關聯(key events relationships, KERs)，并提供定量的劑量響應和時間信息，能為毒害污染物的健康和生態風險管控提供有效的決策依據[4]。構建的定量關系不僅包括分子水平，也包括個體、種群及以上水平。Perkins等[4]認為qAOP可用于解決2類主要問題：(1)理解和評估新的、未經測試的化學品對特定物種的風險；(2)了解和評估某一特定(組)化學物質對未經檢驗的新物種的風險。

本文在課題組前期研究的基礎上，綜述了AhR-AOP的最新研究進展，總結了DLCs及“AhR激活-胚胎毒性”定量AOP的最新進展，并探討了AhR-qAOP發展過程中的問題與潛在解決方案，對其在DLCs生態危害與生態風險評價的應用進行了展望。

1 DLCs的生態危害與風險評估(Ecological hazards and risk assessment of DLCs)

DLCs的致毒機理主要通過激活AhR受體通路進行調控。正常情況下存在于細胞質中的AhR處于不活躍狀態，當外源性配體如二噁英及DLCs進入細胞后，與AhR結合。接著進入細胞核，AhR從Hsp 90復合體上解離下來，再與AhR核轉位因子(aryl hydrocarbon receptor nuclear translocator, ARNT)形成異質二聚體結構。而由于Hsp 90復合體的解離使得AhR的DNA結合位點暴露出來，此DNA結合位點可特異性地識別結合DNA上的二噁英響應元件(dioxin response element, DRE)，從而AhR/ARNT異質二聚體結合在DRE上并啟動下游靶基因的表達，如編碼CYP1A1、醌還原酶的基因表達，由此誘導相應的生物毒性[5-6]。值得關注的是，AhR受體具有物種差異性，進而導致DLCs對生物體毒性效應的物種差異性。在無脊椎動物中并沒有結合二噁英及DLCs的能力，但在脊椎動物中，二噁英及DLCs可以作為配體結合并激活AhR受體。人類和哺乳動物體內只有AhR1，而其他脊椎動物有多種其他AhR受體[7-8]。例如，鳥類具有AhR1、AhR1 beta和AhR2，但只有AhR1行使主要功能[9]。魚類一般至少具有3種AhR受體，即AhR1、AhR2和AhR3，且由于進化過程中保守程度較低，魚類每種AhR受體均包含多種亞型[10-11]。

二噁英及DLCs主要包括氯二苯并對二噁英(poly-o-chlorinated dibenzodioxin, PCDD)、多氯二苯并呋喃(polychlorinated dibenzofurans, PCDFs)、多氯聯苯(polychlorinated biphenyls, PCBs)和多環芳烴(polycyclic aromatic hydrocarbons, PAHs)等持久性有機污染物。雖然從20世紀70年代開始，全球范圍內開始禁止這些物質的生產和使用，但由于其環境持久性、親脂性及高度的生物蓄積性，在環境介質中，尤其是沉積物中，二噁英及DLCs物質的污染仍較為嚴重。已有報道表明，全球PCDD/Fs和PCBs在沉積物中的檢出濃度范圍為0.1～300 pg TEQ·g-1(toxic equivalent, TEQ)[12-13]。盡管已有大量針對此類物質的研究，環境中是否存在其他類似生物毒性的污染物仍然是廣受關注的問題。新型有機污染物的種類和數量每年不斷增長，隨著儀器檢測技術的發展，環境中越來越多的化學物質被發現具有類似二噁英的結構，如多氯代二苯硫醚(polychlorinated diphenyl sulfides, PCDPSs)、甲氧基化多溴聯苯醚(methoxylated polybrominated diphenyl ethers, MeO-PBDEs)、羥基化多溴聯苯醚(hydroxylated polybrominated diphenyl ethers, OH-PBDEs)等新型污染物，可隨食物鏈在生物體內富集，造成生態風險[14-16]。在全球水生環境中，PBDEs的檢出濃度范圍為0.01～69 300 ng·g-1干質量(沉積物)，0.03～1 380 ng·g-1濕質量(魚類)，0.06～17.4 ng·L-1(水)[14]。已有研究發現PCDPSs、MeO-PBDEs和OH-PBDEs對大鼠、小鼠、鳥類和魚類具有AhR活性，能在分子水平上激活AhR，被認為是潛在的DLCs[17-18]。Zhang等[17]發現這3類物質中的部分化學品對于鳥類表現出顯著的物種敏感性差異。PCDPSs對雞、環頸雉和日本鵪鶉的毒性效力均隨著氯代水平的提高呈現上升趨勢。部分PCDPSs和MeO-/OH-PBDEs的AhR活性的鳥類種間敏感性排序與典型二噁英的情況不同。

針對環境中大量具有明顯類二噁英結構的新型污染物和未知污染物，其生態危害和風險具有很高的不確定性，對這類污染物開展毒性測試與生態風險評價具有重大研究意義。傳統毒性評估方法和策略(動物實驗)已經不能滿足不斷增加的未知毒性化學物質的風險評估，亟待對現有的化學物質毒性評估方法和策略進行創新。AOP基于化學品的性質，從系統生物學的角度概括了化學品從所誘導的分子水平反應，細胞、組織、器官的響應和毒性效應，進而到個體、種群上的有害結局之間的時間先后和因果邏輯關系。近10年來，AOP框架逐漸發展成熟，被認為是將生物信息組織成一種可用于人類健康和生態環境的化學品安全評估的強大方法，其開發的最終目的是用于化學品的評估和監管工作，從化學品的優先級評估到危害性預測，最終實現風險評估并應用于管理決策[4,19-20]。

2 基于AhR的定量有害結局路徑研究進展(Research advance of quantitative adverse outcome pathway based on AhR)

隨著對AhR分子毒理學機制和二噁英及DLCs的致毒模式的深入研究，逐漸形成了二噁英及DLCs通過激活AhR受體誘導生物毒性的AOP，可為預測新型類二噁英物質的毒性及建立以生物物種保護為目標的環境基準提供指導[2]。已有的AhR-AOP框架把二噁英及DLCs通過激活AhR受體介導下游分子事件和在細胞、組織、器官和個體乃至群體水平上的有害結局聯系起來，即二噁英及DLCs首先激活AhR受體，這是這類AOPs的共同MIE，通過形成AhR/ARNT異源二聚體，誘導相關I相和II相代謝酶的表達，進而引起一系列分子級聯響應，最終對器官和個體乃至整個種群產生毒害效應[2, 21]。定性AOP系統地構建了分子事件級聯的知識，但不能實現準確的風險評估。因此僅僅有定性AOP是不夠的，還需要發展定量AOP，在明確的毒性機制信息和已有的AhR-AOP的基礎上，通過構建分子啟動事件、關鍵事件與有害結局之間的定量關系，才能實現通過體外測試新型類二噁英物質與受體的結合效力，預測其對生物個體、種群和群落水平的有害結局，為建立以生物物種保護為目標的環境基準提供指導。

2.1 AhR-AOPs的發展現狀及定量關聯

近期，研究者達成共識，認為在短期內開發較多的qAOP是不合理的，未來qAOP的開發工作應該將目標聚焦在已經具有完整信息的定性AOP[22]。完整的qAOP模型從數學上描述了關鍵事件之間的聯系，將MIE激活的劑量-反應與KERs的反應-反應動力學以及有害結局的表現聯系起來。qAOP模型的原始結構(MIE、KE和KER等)可以基于科學證據從頭構建，也可以從AOP數據庫中的定性AOP中獲得。目前在AOP wiki[23](https://aopwiki.org/)中展示的與AhR相關的有害結局通路共有7條，每條AOP的狀態、MIE、KE和AO等信息匯總于表1中。AhR-AOP框架總結了二噁英及DLCs通過AhR介導的分子效應以及在細胞、器官、個體或種群水平上觀察到的有害結局。7條AOP中已通過經濟合作與發展組織(OECD)專家評審、開放引用與評論的有3條，可用于化學物質的篩選與生態風險評估，其AOP ID號分別為21、150和131。

(1)AOP 21，受AhR調控的環氧化酶-2(cyclooxygenase 2, COX-2)表達上調，導致心血管發育和功能的改變，從而導致心臟泵血效率降低、血流減少，最終導致心臟衰竭和死亡。用于構建該AOP的大部分生物學證據是使用COX-2的選擇性激動劑和拮抗劑，利用斑馬魚(Daniorerio)的AhR、ARNT或COX-2靶向敲除進行的機制研究獲得的。有重要證據表明，至少16種不同魚類和8種不同鳥類在多氯聯苯、平面多氯聯苯和多環芳烴暴露下，其心血管發育和功能改變的發生率、嚴重程度及隨后的死亡率的劑量響應是一致的[24]，但是關于二噁英(TCDD)暴露與COX-2轉錄水平的劑量-反應關系的一致性尚不清楚。目前除了心血管發育和功能改變的共同表型外，沒有可用的機制信息來推斷跨物種的外推。

對于AOP21，AhR激活與早期死亡之間表現出較強的定量關系。PCDDs、PCDFs和平面PCBs與AhR結合親和力之間的定量構效關系與這些物質的毒性效力之間有著很強的定量關系。具有更大結合親和力的同源物一般具有更大的毒性效力。這在一定程度上促進了毒性當量因子方法在風險評估中的成功開發。不同物種的AhR受體與DLCs之間的結合親和力具有顯著差異，這決定了DLCs的物種敏感性差異。攜帶不同AhR受體的鳥類對于TCDD的物種敏感性差異高達40倍。另一方面，COX-2的上調表達與TCDD暴露導致青鳉心臟畸形發生率和嚴重程度之間具有定量關聯。COX-2的表達和心臟面積之間有較強的線性關系(r2=0.88)，但仍然缺乏多化學品和多物種的相關信息。

(2)AOP 150，通過AhR激活，與ARNT二聚間接抑制血管內皮生長因子(vascular endothelial growth factor, VEGF)的表達，從而減少心肌細胞和內皮細胞的增殖，改變心血管形態學和減少心輸出量，因此影響了正常血管的生成，最終導致充血性心力衰竭和早期生命死亡[25]。

對于AOP 150，每個關鍵事件之間的關聯(KERs)的定量關系仍不清楚。但是，對于鳥類來說，AhR激活(MIE)和胚胎死亡(AO)之間有很強的相關性。鳥類AhR1配體結合域(ligand-binding domain, LBD)序列可用于預測DLCs誘導的胚胎致死率。LBD中2個關鍵位置的氨基酸(Ile324和Ser380)決定了DLCs的結合親和力，進而決定了AhR激活的程度。

(3)AOP131描述了化學物質通過激活AhR受體導致的嚙齒動物肝臟尿卟啉癥。AhR的激活誘導了下游基因Ⅰ相代謝酶-細胞色素P450 1A2的表達，導致尿卟啉原的過度氧化，產生一種抑制劑尿卟啉原脫羧酶(uroporphyrinogen decarboxylase, UROD)阻止尿卟啉原轉化為共混卟啉原，并在正反饋回路中增加UROD抑制劑的合成；導致尿卟啉原積累，進而導致其優先氧化以及高羧酸化卟啉(highly carboxylated porphyrins, HCPs)在各器官的積累(尿卟啉癥)[26]。

AOP131的定量關系只適用于哺乳動物，不適用于其他物種。目前已有定量模型可以預測各種化合物的AhR活性，但產生卟啉癥所需的AhR激活程度尚不清楚。在哺乳動物中，UROD活性至少要降低70%才能導致明顯的尿卟啉癥。此外，大量的體外測試方法已經開發出來，可以同時研究卟啉的積累和UROD的抑制，UROD抑制與卟啉的積累之間具有強關聯性。

另外正在接受審查的2條AOP分別是AOP 41與AOP 57。AOP 41描述的是DLCs作為AhR配體與之綁定形成二聚體，持續的暴露(數周或數月)會導致AhR持續激活，導致嚙齒動物肝臟腫瘤。AOP 57則描述了通過AhR激活，引起一系列基因表達發生變化，如CD36上調、PCK1下降、低密度脂蛋白受體(low density lipoprotein receptor, LDLR)上調導致的低密度脂蛋白增加等早期關鍵事件，進而導致了脂肪酸的累積，SCD-1表達上調導致肝臟中甘油三脂增加，然后引起脂肪酸、甘油三脂的增加與線粒體脂肪酸β氧化受到抑制等生物學變化，最終導致最后的危害結局，形成脂肪肝。但該AOP正在進一步開發過程中，可接受評價與建議。最新開發的2條目前只是處于提交后的狀態，尚不接受引用與評價。AOP 310描述的是AhR的激活導致DNA甲基轉移酶、促性腺激素釋放激素受體(gonadotropin releasing hormone receptor, GnRHR)啟動子區高甲基化等關鍵事件的變化，因此導致一系列表觀遺傳變化，最終導致繁殖受損如累積繁殖力和產卵量減少導致種群數量下降等有害結局；AOP 51是關于AhR信號傳導和胎盤血管破裂之間的一系列事件。

表1 AOP Wiki中由AhR介導的有害結局通路(AOPs)匯總表Table 1 The adverse outcome pathways (AOPs) mediated by AhR in AOP Wiki

在上述AOP中，研究較多且毒性機制信息最豐富的是AOP 21、151和131，為后續qAOP模型開發提供基本信息與重要數據。

2.2 定量AhR-AOPs的研究進展

2.2.1 基于“AhR-胚胎毒性”定量AOP的開發

定量AOP的構建需要分子啟動事件、關鍵事件和有害結局之間的定量響應數據對關鍵事件關系進行建模和參數化，且精確的KERs的模型開發需要詳細的濃度-響應和響應-響應關系，以此建立數學統計模型。根據已有數據的可用性以及對KERs的了解程度，數學統計模型可以是簡單的線性回歸模型，也可以是一系列連續的非線性模型描述生物組織在不同水平的響應[27]。在上述3條受到廣泛認可的AhR-AOPs中，胚胎死亡或生命早期階段的死亡是最受關注的末端終點(或有害結局)，對物種的種群健康發展至關重要，這也是生態風險評估中的研究重點。而且，3條AOPs的分子啟動事件均為AhR激活(ID：18)，與關鍵事件或有害結局之間具有較強相關性的KERs包括AhR激活與胚胎死亡、UROD活性水平與肝臟尿卟啉癥的發生。在前期的研究中已在淡水、海洋硬骨魚、非硬骨魚以及鳥類中發現AhR激活與生命早期階段死亡率之間存在直接或間接的關系[28-29]。另外，UROD的抑制與卟啉積累之間也存在定量關系，有研究證實在哺乳動物中UROD活性至少降低70%才能導致明顯的尿卟啉積累[30]，該定量關系只適用于哺乳動物，且定量模型僅限于UROD的活性與卟啉積累之間的關聯[31]，而分子啟動事件與最終有害結局之間的定量關系還有待進一步研究。這些KERs內部之間的強相關性為后期qAOP的構建提供重要支撐。

在上述研究基礎上，針對典型的二噁英及DLCs(TCDD、四氯二苯并呋喃(TCDF)和共面PCBs)以及AhR激活-胚胎毒性間的關聯，Doering等[10, 27, 32]收集文獻報道中這些物質在胚胎暴露實驗和體外AhR活性測試中的濃度-響應數據，構建了用來描述AhR激活與間接導致鳥類和魚類生命早期階段死亡率的定量AOP。并根據已發表文獻中DLCs暴露濃度和死亡率的實際劑量響應曲線，對生命早期階段死亡率的預測響應值進行了驗證，定量AOP的預測結果與實驗結果的平均比值為2.2基于“AhR-胚胎毒性”定量AOP，實現了通過測試典型DLCs與受體的結合效力來預測鳥類或魚類模式物種個體水平的有害結局的目的，但能夠用于新型DLCs與非模式物種還需要進一步的研究。

2.2.2 AhR活性的體外測試方法

與此同時，可測量分子啟動事件(AhR激活程度)的高通量檢測方法也相應開發，如細胞色素P450亞酶CYP1A1(ethoxyresorufin-O-deethylase, EROD)誘導法和AhR受體報告基因法。高通量體外測試技術的發展為快速發現新型DLCs提供重要的技術支撐。

EROD檢測的原理是基于DLCs與AhR結合活化后，經過下游分子信號傳遞，誘導EROD酶表達。通過測定EROD酶的活性，來了解受試化學品激活AhR的能力。因為EROD酶不能由肝細胞內源表達，故其酶活性與二噁英的暴露量存在定量關系[33]。

受體報告基因法是近年來根據AhR受體激活機制發展起來的體外細胞測試法，其原理是利用基因重組技術，從體外把合成的報告基因(哺乳動物細胞色素P450基因和螢火蟲熒光酶)重組到真核細胞內。受體報告基因法可包括不同來源的AhR受體，如在大鼠肝癌細胞(H4IIE-luc)穩定轉染報告基因的H4IIE-luc細胞受體報告基因法、在COS-7細胞瞬時轉染AhR質粒的鳥類AhR-熒光素酶報告基因法(luciferase reporter gene, LRG)和魚類AhR2-LRG法，其中，鳥類AhR-LRG法的技術原理和檢測流程如圖1所示。在非洲綠猴腎成纖維細胞(COS-7細胞)中瞬時轉染鳥類AhR1、鸕鶿ARNT、鸕鶿CYP1A5報告基因質粒和Renilla熒光素酶報告基因質粒[9, 33]。轉染完成后，COS-7細胞可以表達相應的AhR1受體和ARNT。當對細胞進行DLCs暴露時，DLCs與細胞質內的AhR受體結合，并轉移至細胞核內，AhR與ARNT形成異源二聚體，與熒光素酶報告基因上的二噁英響應元件(DRE)結合，啟動熒光素酶基因的表達，熒光素酶的表達量與AhR激活的程度正相關[33-34]。加入熒光素底物后，熒光素酶可以催化底物反應，產生化學發光。使用微孔板酶標儀可檢測其發光強度，進而實現對具有AhR活性的DLCs物質的高通量體外測試。

圖1 鳥類AhR1-熒光素酶報告基因法(AhR1-LRG)檢測類二噁英(DLCs)物質芳香烴受體(AhR) 活性的技術原理(a)和流程(b)注：ARNT表示AhR核轉位因子。Fig. 1 The mechanism (a) and workflow (b) of potency test of arly hydrocarbon receptor (AhR) activation of dioxin-like compounds (DLCs) using avian AhR1-luciferase reporter gene (AhR1-LRG) Note: ARNT stands for aryl hydrocarbon receptor nuclear translocator.

與EROD法相比，受體報告基因法具有以下優勢：(1)更直接地檢測DLCs物質對AhR的激活效應，因為報告基因法使用外源表達的AhR受體或者CYP1A報告基因，其檢測的指標來源的分子效應比誘導EROD表達更早出現[33]。因此，報告基因法靈敏度更高，檢測限更低。(2)因為EROD法需要使用鳥類肝臟原代細胞，而報告基因法使用細胞系進行檢測，因此，報告基因法檢測周期更短，更適合高通量的化學品篩查。(3)因為LRG基于外源表達的AhR受體，因此可以預測不同物種的敏感性差異，為制定保護敏感物種的DLCs的生態安全閾值提供方法。近幾年，LRG法在環境介質如飛灰、沉積物和油砂污染區等的危害評估中已得到廣泛應用，為AhR激活-胚胎致死qAOP應用于未來真實環境的化學物質危害識別與篩查提供技術基礎。魏鳳華等[35]采用鳥類AhR-LRG和大鼠H4IIE報告基因法評估了垃圾焚燒飛灰樣品有機提取物的類二噁英生物活性，垃圾焚燒飛灰樣品的有機提取物能誘導顯著的類二噁英活性，研究表明，利用化學檢測儀器對17種DLCs進行的暴露分析不能全面反映環境介質中有毒有害化學物質的類二噁英毒性情況；而鳥類AhR-LRG法不僅能反映樣品的總類二噁英活性，還可通過多種物種實現對樣品較全面的生態風險評估。夏潔[36]使用大鼠H4IIE-luc報告基因法檢測了長江和太湖水樣、沉積物和生物樣品提取物的AhR活性，并且結合化學分析方法，推斷出沉積物中PCDDs的AhR活性貢獻率達到50%。Mundy等[37]將鳥類原代肝細胞暴露于油砂污染區環境樣品中，通過測定EROD酶活性和Cyp1A4 mRNA的表達來評估AhR活性，發現環境樣品中的多環芳烴提取物能夠顯著誘導AhR活性增強，且可以根據體外測試結果對不同采樣位點的環境樣品的AhR活性進行排序。

研究者利用鳥類AhR1-LRG法開展了針對典型的DLCs(TCDD、TCDF、五氯二苯并對二噁英(PeCDF)和PCBs)和新型DLCs(OH-PBDEs)的相關研究，發現這些DLCs激活AhR的效應濃度(PC20和EC50)與雞胚胎早期生命階段致死LD50間具有強相關性(r2>0.84，P<0.01)[27, 38-39](圖2)。以上結果說明了AhR-LRG體外檢測方法在預測DLCs毒害效應的有效性，為構建以生物個體發育早期階段死亡為有害結局終點的AhR-qAOP提供了可靠的體外檢測方法。

圖2 AhR活性與野生型雞胚胎致死LD50的線性回歸分析注：EC50表示引起50%最大效應的濃度，PC20表示引起20%的陽性對照效應的濃度，LD50表示半數致死濃度；TCDD表示二噁英， TCDF表示四氯二苯并呋喃，PeCDF表示五氯二苯并對二噁英，PCB表示多氯聯苯，5-Cl-6-HO-BDE-47表示5-氯-6-羥基-溴代聯 苯醚-47，6-HO-BDE-47表示6-羥基-溴代聯苯醚-47；PC20和EC50值來自LRG法測定的濃度-響應曲線。Fig. 2 The linear relationship between AhR activity and LD50 of wide-type chicken embryoNote: EC50 means the concentration for 50% of maximal effect; PC20 means the concentration for 20% of positive control effect; LD50 means median lethal dose; TCDD means dioxin; TCDF means tetrachlorodibenzofuran; PeCDF means pentachlorodibenzo p-dioxin; PCB means polychlorinated biphenyls; 5-Cl-6-HO-BDE-47 means 5-chloro-6-hydroxy-bromodiphenyl ether -47; 6-HO-BDE-47 means 6-hydroxy-bromodiphenyl ethers -47; the value of PC20 and EC50 were retrieved from dose-response curves of LRG tests.

2.2.3 基于“AhR-胚胎毒性”定量AOP對DLCs的風險評估

現有AhR-qAOP在對單一化學品暴露導致早期胚胎死亡的預測研究中，涵蓋了典型的DLCs(TCDD、PeCDF、TCDF和共面PCBs)和一些新型DLCs(PBDEs、PCDPSs)。其中，低于四氯取代的PCDD/Fs和PCBs均不會激活AhR，PCDPSs誘導AhR活性的規律與PCDD/Fs和PCBs相似。此外，目前已發現羥基和甲氧基取代的PBDEs表現出顯著的AhR活性，且5-C1-6-HO-BDE-47的相對毒性效力(relative potency, ReP)最大，與八氯代二苯并二噁英(OCDD)和八氯代二苯并呋喃(OCDF)的毒性當量因子(toxic equivalency factor, TEF)相當；并且發現羥基官能團和甲氧基官能團相比，可以誘導更大的AhR活性[15, 17, 36]。

Doering等[38]和Manning等[39-40]發現典型DLCs的鳥類AhR1/魚類AhR2-LRG活性效應值與早期胚胎致死劑量之間具有強相關性。Manning等[39-40]在COS-7細胞中轉染了雞、環頸雉和日本鵪鶉AhR1質粒，通過檢測TCDD、PeCDF、PCBs 126, 77, 105和118的LRG響應，發現在AhR1 LBD區域的氨基酸殘基324和380是決定不同鳥類對PCBs敏感性差異的因素。此外，AhR1-LRG響應(EC50、ECthreshold和PC20)與文獻報道的PCBs對9種鳥類早期胚胎死亡的毒性數據(LD50)顯著相關(r2≥0.87,P<0.0001)[39-40]。

近幾年，本課題組針對前期研究中篩選出來的高AhR活性的新型DLCs，基于AhR激活-胚胎致死的qAOP模型對其開展危害預測研究。利用體外高通量測試-鳥類AhR1-LRG法得到測試物質的AhR活性效應值，根據qAOP模型預測6-HO-BDE-47[41]、5-Cl-6-HO-BDE(未發表數據)等高活性物質的胚胎致死效應，并通過胚胎注射測試驗證了新型DLCs對鳥類胚胎的致死毒性，與轉錄水平上的分子響應如CYP1A4的表達上調，具有顯著的劑量效應關系。以上這些研究結果拓展了利用AhR激活-胚胎致死的qAOP模型在新型毒害污染物的毒性評估方面的應用，從大量毒性未知的環境污染物中篩選出有毒物質，為PBDEs、PCDPSs等新型污染物的生態風險管理與控制提供了方法和數據支持。

2.2.4 基于“AhR-胚胎毒性”定量AOP對不同物種的適用性研究

不同物種的AhR受體對AhR受體激動劑的敏感性和效力有很大差異，以鳥類為例，其AhR配體結合域被分為低、中、高敏感性，分別為AhR 1(Ile324_Ser380)、AhR 2(Ile324_Ala380)和AhR 3(Val324_Ala380)，其代表物種分別為雞、環形雉和日本鵪鶉[39, 42-43]，具有對DLCs親和力較高的AhRs的鳥類比具有對DLCs親和力較低AhRs的鳥類具有更高的敏感性[44]。AhR在鳥類、魚類的不同物種間的結合親和力的差異和早期生命階段死亡率對DLCs的敏感性差異也存在定量關系[27, 39, 42-44]，如TCDD對雞或者其他鳥類的毒性至少相差一個數量級，TCDD對湖紅點鮭和斑馬魚早期生命階段的致死毒性效應相差40倍[45]。因此，在利用AhR激活導致生物早期死亡的qAOP模型時需要考慮物種間差異性的定量關系[32]。

導致AhR活性物種敏感性差異的原因，目前主要認為是不同AhR亞型的蛋白序列和構象差異使得同樣的DLCs與AhR受體結合能力不同，進而產生不同程度的下游分子事件[42-44, 46]。對于鳥類來說，AhR1的配體LBD區域的氨基酸序列差異是引起二噁英及DLCs效應產生鳥類種間敏感性差異的原因。研究發現，氨基酸位點Ile324和Ser380能夠影響86種鳥的AhR1受體對DLCs的敏感性[39, 42-43]。對于哺乳動物，研究人員發現人類的AhR受體LBD區的苯丙氨酸318(Phe318)位點和纈氨酸381(Val381)位點在對TCDD的敏感性差異上起著關鍵作用[47-49]。相較于人類和鳥類，魚類的情況較為復雜，目前還沒有針對魚類物種敏感性的機制解釋。一般來說，魚至少有3種AhR受體(AhR1、AhR2和AhR3)，并且每個AhR均包括多個亞型。魚類AhR受體在進化上的保守性較低，這也導致了魚類較大的物種敏感性差異[50]。Zhang等[51]提出了PCDPSs會通過激活斑馬魚AhR2導致其致死毒性的假設。該研究通過體外測試-魚類AhR2-LRG法、野生型和CYP1A轉基因型斑馬魚胚胎暴露實驗驗證了PCDPSs誘導的致死效應是通過激活斑馬魚AhR2的表達導致的，并結合分子動力學模擬提供了幾種PCDPSs在原子水平上激活AhR2的差異機制信息。綜合來說，以上因素均會導致同樣的DLCs與不同物種的AhR受體親和力不同，導致分子啟動事件的激活程度的差異，進而產生下游關鍵事件和最終有害結局的差異。因此，物種敏感性差異是AhR-qAOP后續發展及應用中一個亟待解決的重要問題。魏鳳華等[2]總結了DLCs在不同物種間存在顯著的敏感性差異，建議加強對我國本土物種的研究，獲取本土物種的DLCs毒性數據以支持風險評價與基準研究，并進一步開展新型DLCs的毒性篩查工作等。

為了研究AhR-qAOP在不同物種間適用性，在AhR激活導致鳥類生命早期階段死亡的qAOP的基礎上，研究了TCDD對其他脊椎動物如9種魚類的AhR受體敏感性差異[27, 52]。研究者在COS-7細胞中分別轉染了鳥類AhR1和魚類AhR2質粒，通過分析TCDD、TCDF、PeCDF和PCBs 126, 77的LRG響應和對應DLCs導致鳥類或魚類早期胚胎死亡的數據，發現顯著的線性相關僅存在于魚類AHR2/鳥類AHR1-LRG活性效應值(EC50)與導致早期胚胎死亡的DLCs劑量(LD0、LD10、LD50和LD100)，而不存在于魚類AhR1[27, 32]。此外，研究者通過修正AhR-qAOP模型，將TCDD、PCBs 126, 77, 105的LRG效應濃度(ECthreshold)作為輸入值，預測對應DLCs導致早期胚胎死亡的DLCs劑量(LD0、LD10、LD50和LD100)，獲得了較好的線性相關性(r2≥0.92，P<0.0001)。該研究發現AhR-qAOP可適用于不同生態物種，甚至拓展至10 000種鳥類和34 000種魚類[38]。但是除PCDDs、PCDFs和共面PCBs之外，目前還沒有研究表明這種跨物種qAOP是否適用于其他的AhR激動劑[27, 38]。

3 總結與展望(Conclusion and perspectives)

3.1 當前AhR-qAOP的不足

盡管AhR-AOP已經獲得了較多的關注，促進了從機制上理解AhR在跨化學物質、跨物種和跨類群方面的危害，但是與其他大部分AOP一樣，對MIE與KE、AO之間的關聯、下游的關鍵事件仍然缺乏足夠的了解。然而AhR的激活能夠導致多重響應，包括與多個潛在靶基因如CYP1A、Sox9b和HIF1a/VEGF的相互作用，這些AOPs可能與COX-2的表達增加同時發生，導致心血管發育和功能改變和導致早期生命階段死亡[53]。AOP 150是在AOP 21的基礎上開發出來，AhR激活后通過HIF1a/VEGF信號通路最終導致早期生命階段死亡[54]。因此，闡明AhR激活與早期生命階段死亡率之間的一系列關鍵事件是一個挑戰。此外，目前對已有KERs的定量關系理解在很大程度上只局限于AhR激活和早期生命階段死亡率之間的間接關系，這限制了其在化學品風險管控中的應用范圍。

此外，由于生物體內AhR受體的變異和多樣性，二噁英及DLCs在不同的物種間存在顯著的敏感性差異。這同樣給AhR-qAOP的應用提出了挑戰。尤其是對于野生魚類，魚類往往同時具有3種AhR受體，且每種具有不同亞型。目前，AhR受體已經被識別定型的魚類只占所有魚類的極少部分，大部分魚類體內的AhR亞型情況尚不清楚[55]。因此，對野生物種的AhR受體的識別與定型是決定AhR-qAOP應用有效性的基礎。

本文綜述了AhR-胚胎毒性qAOP在預測典型DLCs和新型DLCs(PBDEs和PCDPSs)對鳥類和魚類毒害效應的應用。但環境中仍有大量未知毒性化學污染物以及混合污染物。這些未知毒性污染物的AhR活性以及對生態物種的胚胎毒性很可能具有顯著差異，因此AhR-qAOP的計算模型需要不斷修正，以滿足不同AhR活性的污染物的檢測要求。

3.2 基于AhR-qAOP的DLCs生態風險研究展望

為識別DLCs的危害并評價其生態風險，進一步構建與完善AhR-胚胎毒性qAOP，后續可重點關注以下幾方面：

(1)目前構建的qAOP已經適合于在TCDD、TCDF和PCBs等典型的DLCs，其對大量新型的和潛在未知的DLCs的適用性尚不可知，建議開展對其他新型類二噁英化學物質的研究，驗證該qAOP的化學適用性。

(2)繼續開發與完善qAOP，尤其是構建下游KE與AO間的定量關系，提高預測信心與能力，能在更高階的實際管理工作中得到應用。使用AOP進行危害識別和風險評估需要評估預測模型在AOP中的每個關鍵事件和關鍵事件關系上的性能。一般來說，關鍵事件越往有害結局的下游發展，利用相關關鍵事件的定量關系來預測有害結局的可信度就越強。生物個體與種群水平及以上的危害是化學物質監管和決策的最終目標，同時考慮結合合適的種群模型，通過對個體生存和繁殖的影響去評估對種群動態和結構的影響，將AO拓展至種群及以上水平上的危害。

(3)開展該qAOP對不同物種的適用性研究，將其應用拓展至敏感物種、本土物種和瀕危物種等管理上關心的目標物種，進而確定敏感物種以及制定保護本地敏感物種的環境安全閾值(圖3)[52, 56]。已知鳥類和魚類之間AhR的目標氨基酸的差異導致與DLCs結合親和力的不同，由此造成AhR激活(MIE)的劑量-效應關系物種差異。通過修改qAOP模型中AhR激活的劑量-反應參數，可以推斷該模型在不同物種的適用性，從而解釋物種對DLCs的敏感性[10]。物種間蛋白質序列的保守性可以用來推斷物種之間的親和力如何不同，或者感興趣的物種與模型物種之間的敏感性如何不同[57]。有研究者利用序列比對等方法分析幾個或多個物種之間的目標基因和蛋白質的相似性，從而預測物種之間的易感性(sequence alignment to predict across species susceptibility, SeqAPass)[58]，只需要提供所選目標物種的MIE和KERs的物種特異性信息，利用qAOP模型就能得到感興趣的化學物質的物種敏感性分布，支撐毒害化學物質的生態毒性基準與標準的制定研究。

圖3 利用AhR-qAOP對DLCs進行鳥類胚胎毒性評估以提供風險管控依據Fig. 3 Avian embryo toxicity of DLCs was assessed using AhR-qAOP to provide evidence of risk management

(4)針對一些低AhR活性的新型DLCs和未知毒性的化學品，可以比較不同的活性效應濃度(PC20、EC50、EC20或ECthreshold等)作為計算模型輸入值的計算結果，以獲取優化的線性相關性。Zhang等[59]在檢測PBDEs的AhR活性時，使用PC20作為輸入值，PC20為產生TCDD的最大LRG響應的20%時對應的DLCs的濃度，以此來計算低AhR活性的DLCs的相對效力。Doering等[38]在構建針對鳥類和魚類AhR-胚胎毒性qAOP過程中，對計算模型進行修正，采用ECthreshold代替EC50，對具有低AhR活性的PCBs的毒害效應進行預測，發現采用ECthreshold作為輸入值，可以獲得較好的線性相關性。

(5)在上述研究基礎上，考慮構建基于AhR激活的AOP網絡，將AO從個體水平上拓展至種群及以上水平，進一步探究其對DLCs混合物、環境中DLCs混合物等暴露危害的預測能力，促進其最終應用于DLCs的風險管控工作。已有研究提出AhR-AOP可為風險評估提供有用信息，如環境中可結合AhR的TCDD結構類似物一般以混合存在，可用混合物濃度加和的方式對這類混合的復合毒性進行評估[60]。Wei等[61]利用基于鳥類AhR的熒光報告基因法測試TCDD、2,3,7,8-TCDF和2,3,4,7,8-PeCDF這3種典型DLCs兩兩混合后的AhR活性，發現混合物誘導的鳥類AhR活性效力的聯合效應是加和作用，進一步說明了利用該報告基因法在混合暴露危害評估中的應用潛力。但是否可利用該AhR活性結果去預測混合物暴露的胚胎致死效應尚不可知。因此未來可進一步研究該qAOP和AOP網絡在多種DLCs混合物、環境中DLCs混合物暴露中的應用。

(6)可參考Patlewicz等[62]提出的支持AOP管控的科學框架，探索利用現有的AhR相關的qAOP分層級地支持對DLCs風險管控工作中不同層次的應用。例如利用該qAOP進行化學品初級階段的毒性篩查與優先評估，累積數據的同時優化該qAOP；將qAOP的數學模型輸出的結果與實驗數據集(如人類臨床數據集、合適的生態物種)進行基準測試，為未來AOP的實際應用提供科學依據和經驗。