辣椒疫病相關基因研究進展

赫 衛 張 慧

（1 貴州中醫藥大學藥學院，貴州貴陽 550025；2 黑龍江省農業科學院園藝分院，黑龍江哈爾濱 150069）

辣椒疫霉菌（Phytophthora capsiciL.）是辣椒生產中極具破壞力的病原體，發病嚴重時可導致辣椒減產50%以上，甚至絕收。辣椒疫病發病范圍廣，生理小種繁多，病原菌極易發生變異，從而導致耐藥菌株的產生（Pennisi &Agosteo，1998；羅赫榮 等，1999；謝丙炎和吳新平，2000；Oelke et al.，2003），而抗病育種是防治此病害的主要手段之一。但由于缺乏廣泛適用的抗疫病辣椒資源，且辣椒抗疫病遺傳規律復雜，抗病機制不清晰，導致當前育種成果進展緩慢。因此，辣椒疫病抗性機制已成為目前研究的重點。本文著重闡述了宿主和病原體的分子機制研究進展，為研究辣椒-疫霉菌病理提供理論指導。

1 辣椒疫病抗性基因

1.1 辣椒疫病抗性基因的定位

辣椒疫霉菌抗性來源的遺傳方式有：單基因遺傳、寡基因遺傳和多基因遺傳。有研究表明，單顯性基因或具有修飾基因的單顯性基因可調控辣椒對疫霉菌的抗性（Saini &Sharma，1978；Barksdale et al.，1984；Kim &Hur，1990）。在寡基因遺傳方面，前人研究表明，在辣椒材料CM334 中至少兩個基因共有抗性（Reifschneider et al.，1986，1992；Ortega et al.，1991，1992；Walker &Bosland，1999；Thabuis et al.，2003；Sy et al.，2005）。有研究認為，疫病的抗性是指具有基于多峰分布和更高階上位效應的多基因遺傳性（Bartual et al.，1991，1993；Pflieger et al.，2001；Lefebvre et al.，2002；Ogundiwin et al.，2005；Toru et al.，2006；Bonnet et al.，2007）。目前，已鑒定出一些與辣椒疫霉菌抗性相關的數量性狀基因座（QTL）（Thabuis et al.，2004a；Ogundiwin et al.，2005；安靜等，2007；Minamiyama et al.，2007；Kim et al.，2008；Truong et al.，2012；Naegele &Hausbeck，2014）。

辣椒第5 號染色體是疫病抗性的主要定位區間。Quirin 等（2005）在辣椒第5 號染色體上定位了1 個與Phyto.5.2緊密相連的基因座。Kim 等（2008）找到了2 個QTLs，位于辣椒第5 號染色體上的RFLP 標記CDI25 和第9 號染色體上的CT211A 標記附近。Lu 等（2012）檢測到LG5 的a035_1 和a170_1 之間的一段連續區間是主要效應位點，并且考慮到上位性效應，這些QTL 可以解釋高達98.25%的抗性表型變異。Mallard 等（2013）確定了1 個主要的QTL，Pc5.1，位于辣椒第5 號染色體上，與來自不同地理區域的12 種疫霉菌的分離株抗性相關。Liu 等（2014）使用基因芯片對辣椒第5 號染色體上的主效QTL 進行分析，發現Phyto5SAR 標記位于主效QTL 區間，Phyto5SAR標記的支架序列（scaffold194）包含2 個疫病抗性候選基因，推測為NBS-LRR基因和SAR8.2A基因。Wang 等（2016）將辣椒疫病抗性基因定位到第5 號染色體的區間上，僅3.3 cM，鑒定出2 個候選基因Capana05g000764和Capana05g000769。Siddique 等（2019）應用GWAS 在整個辣椒基因組中檢測到117 個與辣椒疫病抗性相關的重要SNP，并將對辣椒疫霉菌的分離株具有廣譜抗性的3 個主要影響基因座（5.1、5.2 和5.3）定位到辣椒第5 號染色體上。Kim 等（2019）分析了辣椒第5 號染色體上的主要QTL 區（6.2～139.2 Mb），鑒定出候選抗性基因類似物（RGA），包括14 個核苷酸結合位點富含亮氨酸的重復序列，3 個受體樣激酶和1 個受體樣蛋白。這些研究為辣椒疫病抗性的基因篩選和標記開發提供了良好的基礎。

目前，已有大量研究報道了辣椒中的QTL可轉化為分子標記，從而進行更快速的育種選擇（Quirin et al.，2005；Kim et al.，2008；Truong et al.，2012；Chomkaeo et al.，2014；Wang et al.，2016；Xu et al.，2016）。辣椒第5 號染色體因被多次確定為QTL 位點而備受重視，并開發了分子標記。例如，標記Phyto5NBS1可解釋高達90%的遺傳變異（Liu et al.，2014），標記CaNB-5480 最高分離率為86.9%（Kim et al.，2019）。然而，迄今為止，這些公開獲得的分子標記通常不能被廣泛應用，且已經觀察到一些分子標記在應用于多種種質中會出現一定程度的表型和基因型不匹配，這種不匹配限制了標記輔助選擇育種的發展。此外，多標記結合使用可以提高標記的利用效率。例如CaNB-5480、CaRP-5130 和CaNB-5330 3 個標記結合，可提高61 個辣椒品種的基因分型準確性（Kim et al.，2019）。

1.2 辣椒疫病抗性相關基因的鑒定

目前已通過多種方法獲得辣椒疫病抗性基因，但檢測到的基因仍然是有限的。有研究者通過標記定位鑒定了可能的抗性基因（Silvar et al.，2008；Zhang et al.，2013；Rehrig et al.，2014；Xu et al.，2016），一些抗性基因在QTL 位點Pc5.1內，且非常接近Pc5.1，包括CaPhyto（Wang et al.，2016）、CaDMR1（Rehrig et al.，2014）以及其他可能的基因（Liu et al.，2014）；通過DDRT-PCR 和cDNAAFLP 等技術篩選出疫霉菌誘導處理后差異表達的基因，包括β-1，3-葡萄糖聚糖酶基因（Catalina et al.，1999）、磷脂酰肌醇/磷脂酰甘油轉化蛋白基因（王永成 等，2008）、辣椒葉綠素a/b 結合蛋白基因（林明 等，2007）等。Zhang 等（2013）利用同源克隆方法獲得辣椒CaRGA2基因，辣椒接種疫霉菌24 h 時，該基因在抗病品種CM334 中的表達量是感病品種的5 倍，被病毒誘導沉默后，抗病品種對疫病的抗性也受到了抑制。

有些基因家族已參與到辣椒對疫霉菌的防御反應中。例如，SBP-box（Squamosa-promoter 結合蛋白）是一種植物特異性轉錄因子，利用病毒誘導的基因沉默技術篩選出與疫霉菌防御反應相關的基因CaSBP08、CaSBP11、CaSBP12和CaSBP13。其中，CaSBP08的功能在對疫霉菌的感染防御反應中得到了確認（Zhang et al.，2020）；CaSBP12過表達的煙草植株更容易受到疫霉菌感染，而CaSBP12沉默增強了對疫霉菌感染的防御反應（Zhang et al.，2018），防御相關基因（NbPR1a、NbPR1b、CaPO1、CaSAR8.2、CaBPR1和CaDEF1）的 表達受到不同程度的抑制或誘導，這些結果表明CaSBP12基因負調節了對疫霉菌感染的防御反應。CBL-CIPK 網絡參與了脅迫反應，在辣椒基因組中鑒定出9 個CaCBL（鈣調神經磷酸酶B 樣蛋白）和26 個CaCIPK（蛋白激酶）基因，當植物受到疫霉菌脅迫時，大多數CaCBL 和CaCIPK 基因的表達發生了改變（Ma et al.，2019）。此外，幾丁質酶家族的許多成員參與了植物免疫，其中CaChiIV1和ChiIV3的表達受辣椒疫霉菌感染的調節，CaChiIV1沉默的辣椒植株顯示出對疫霉菌感染敏感性的增加，因此顯示其在特定條件下的共調節作用（Ali et al.，2019）。ChiIV3是植物細胞死亡的正向調節劑，可觸發針對辣椒疫霉菌的防御信號和致病相關基因的上調（Liu et al.，2017）。

辣椒中似乎有幾種不同類型的R基因，其中大多數R基因是核苷酸結合和富含亮氨酸的重復蛋白（NLR）。辣椒中NLR 基因的大規模擴增，很大程度上是由于長末端重復逆轉座子介導的逆轉錄重復的結果（Kim et al.，2017）。乙烯響應因子在植物對生物脅迫的響應中起著至關重要的作用，如CaPTI1通過病毒誘導基因沉默降低了防御相關基因CaPR1、CaDEF1和CaSAR82的表達以及根系活性來顯著削弱防御反應（Jin et al.，2015），CaAP2/ERF064可以通過調節植物中PR 基因的轉錄來積極調節辣椒的抗性反應（Jin et al.，2019）。多聚半乳糖醛酸酶抑制蛋白（PGIP）是具有對真菌產生的許多多聚半乳糖醛酸酶的識別能力的細胞外植物蛋白（de Lorenzo et al.，2001），研究表明金黃色葡萄球菌多半乳糖醛酸酶抑制蛋白1 基因（CaPGIP1）可降低轉基因煙草植物的敏感性（Wang et al.，2013）。Jones 等（2015）對XEGIP 基因進行建模以抑制辣椒疫霉菌產生的木葡聚糖特異性內切β-1，4 葡聚糖酶，并攻擊植物細胞壁中的木葡聚糖鍵（Yoshizawa et al.，2012）。一些非典型的廣譜基因參與到對辣椒疫霉菌感染的防御反應中，包括CaPIP1-1（Yin et al.，2015）、VpRPW8s（Lai et al.，2018）等。這些基因在辣椒抵抗疫霉菌感染的防御機制中起著重要作用，為辣椒疫病抗性的分子解剖奠定了基礎。

1.3 辣椒疫病抗性基因網絡

盡管賦予辣椒疫病抗性的基因大部分定位在辣椒第5 號染色體上（Mallard et al.，2013；Kim et al.，2017），但尚未鑒定出在廣泛地理區域或不同遺傳背景下均具有抗性的基因座。辣椒對疫霉菌的抗性是高度復雜的性狀，可能有大量變異導致抗性（Kim et al.，2017）。常見的SNP 分布在整個基因組中，其影響低于可檢測的顯著性水平，但占復雜性狀遺傳力的很大一部分（Yang et al.，2010）。而且，復雜的性狀在很大程度上受非編碼變體（如啟動子或增強子）的影響（Boyle et al.，2017），許多重要的基因座通常作用較小。因此，Boyle 等（2017）提出了一種全能模型，該模型假設大多數遺傳力可以通過對核心疾病相關途徑之外的基因的影響來解釋。他們認為，至少在一個組織中具有致病性的任何具有調節變異的基因，基本上都可能對抗病性產生重要影響。因此，疫病抗性基因很可能是一個互相影響的基因網絡。

通過全基因組關聯研究，對復雜性狀遺傳基礎的理解已大大擴展。Richins 等（2010）確定了在接種辣椒疫霉菌條件下的168 個相關差異表達的基因。以2014 年測序完成的辣椒全基因組作為參考基因組，為辣椒疫霉菌抗性基因表達研究提供了重要借鑒。Wang 等（2015）采用了RNA-seq 技術對辣椒疫病侵染前后的根部差異基因進行分析，遺憾的是只對侵染后的單一時間點進行了分析。Li 等（2020）同樣采用RNA-Seq 方法闡明了在感染辣椒疫霉菌后多時間點的根部差異基因，推斷苯丙烷類生物合成途徑，尤其是其分支衍生的肉桂醛和木質素，在辣椒根部對疫霉菌的抗性中起重要作用。但是，這些基因識別病原相關分子模式（PAMPs）的能力尚不清楚。

2 疫霉菌致病機制

2.1 疫霉菌的致病基因

疫霉菌病原體代表了一種獨特的進化譜系，其中致病性已獨立獲得，因此，迫切需要了解并破壞驅動感染的進程。目前很少受到關注的一個領域是感染期間疫霉菌基因表達的調節?；虮磉_不僅調節疫霉菌的外觀形態，更影響著疫霉菌的毒力。Safdar 等（2017）構建了含有辣椒疫霉菌LRR 功能域的一種酶PcLRR-RK1 的沉默轉化子，轉化子改變了疫霉菌的孢子囊形狀、大小，降低了孢子囊與游動孢子的產量，同時影響了孢子囊萌發及穿透寄主組織細胞的能力，從而導致辣椒疫霉菌毒力降低。疫霉菌中編碼壞死和乙烯誘導肽1 類似蛋白（NLPs）的基因家族，又稱NPP，是一組疫霉菌分泌的毒素，代表了一類壞死激發子，能夠引發許多雙子葉植物防御反應和細胞死亡（Fellbrich et al.，2002；Qutob et al.，2002；Bailey et al.，2005）。Ottmann 等（2009）觀察到NLP 的晶體結構與海洋生物產生的細胞溶解毒素表現出結構相似性，表明該蛋白通過質膜破壞和細胞溶解作用促進了宿主感染。Feng 等（2011）發現從中國分離出的高毒力辣椒疫霉菌SD33 中存在NLP，進一步研究發現NLP 在辣椒的病癥發展中起重要作用（Feng &Li，2013；Feng et al.，2014）。有研究表明，8 個選定的NLP 基因在辣椒疫霉菌的發育和植物感染階段差異表達，對10 個克隆的NLP 的功能分析表明，Pc11951、Pc107869、Pc109174和Pc118548能夠誘導辣椒中的細胞死亡（Chen et al.，2018）。Fu等（2015）確定了疫霉菌中的果膠酸裂解酶基因家族的幾個誘導細胞死亡的成員，這些成員在感染過程中被高度誘導，與疫霉菌的毒力相關，并且可能是效應子。病原體甚至與宿主植物構成蛋白復合體以致病，辣椒疫霉菌的抑素PcINF1 與辣椒SRC2-1構成膜靶向PcINF1-SRC2-1 復合物，觸發了辣椒植株的細胞死亡，是PcINF1 誘導的辣椒免疫所必需的（Liu et al.，2015）。上述研究概述了辣椒疫霉菌的致病基因，為進一步闡明這種破壞性病原體的致病機理奠定了基礎。

2.2 疫霉菌的效應子

疫霉菌可以分泌大量不同毒性或無毒因子到植物中，從而操控植物的生理生化過程，這些因子即效應子。效應子編碼被抗病宿主識別的病原體相關分子模式/微生物相關分子模式（PAMPs/MAMPs），并觸發模式觸發免疫（PTI）。辣椒疫霉菌已經進化出多種多樣的分泌效應子，可以抑制PTI 并引發效應觸發易感性（ETS）（Jones &Dangl，2006；Hein et al.，2009；Gill et al.，2015）。這些效應子操縱宿主的過程可以創造有利于病原菌定殖的環境。在感病植物中，效應子通過多種機制抑制植物的防衛反應從而增加感病植物的感病性；抗病植物中的抗病基因產物識別效應子，引發抗病植物的過敏性細胞壞死和有效的防衛反應（Kamoun，2003）。

Stam 等（2013）利用辣椒疫霉菌參考基因組，確定了病原體效應子。辣椒疫霉菌產生的幾種效應子，例如RXLR、CRN 類的效應子，被認為在辣椒的感病過程中起重要作用。在辣椒疫霉菌基因組中已經鑒定出超過400種候選RXLP效應子（Lamour et al.，2012；Stamet al.，2013）。如辣椒疫霉菌RXLR 效應子PcAvr3a12，通過靶向和抑制新型內質網定位的肽基脯氨酰順反異構酶FKBP15-2 來促進感染（Fan et al.，2018）。CRN 效應子是卵菌中除RxLR 效應子外的一種重要的胞質效應子，通過保守基序LxLFLAK 檢索辣椒疫霉菌全基因組，鑒定CRN 效應子84 個（Stam et al.，2013）。保守的CRN 效應子家族具有引發寄主植物產生防御反應，誘導植物葉片皺縮和壞死的能力（Schornack et al.，2010）。這種誘導宿主細胞死亡的能力可以和毒力功能分開（Amaro et al.，2018）。瞬時表達PcCRN4增強了煙草上的致病疫霉菌毒力；沉默基因PcCRN4顯著降低該基因毒力，煙草的病程相關基因PR1b被顯著誘導，有大量的胼胝質沉積，表明CRN 具有引發植物防御反應的能力（Mafurah et al.，2015）。PcNMRAL1 是一種轉錄調節因子，調節辣椒疫霉菌中大量效應子的表達，可介導生物體向壞死體的轉化，可能會驅動植物疫病周期（Pham et al.，2018）。疫霉菌基因組包含5 個推定的脯氨酰4-羥基酶（P4Hs），在菌絲體中，所有P4Hs 均響應缺氧而下調，但PcP4H1的表達受影響最大，感染植株時Pc4H1被上調了110 倍以上，Pc4H5被上調了7 倍，而其他P4H 的表達則保持不變（Song et al.，2019）。

Reeves 等（2013）從新墨西哥辣椒品種NMCA10399 中鑒定了辣椒疫霉菌含有抗性基因抑制劑（Ipcr）基因，表明1 個單顯性基因抑制了多基因宿主對疫霉菌多個分離株的抗性，并且這個單顯性基因對所有病癥的抗性都有抑制。辣椒種群中Ipcr基因的作用方式尚不清楚。Ipcr基因的宿主始終是完全易感的，因而增加了鑒定效應子靶標的難度。

3 展望

前人相關研究表明，很難將辣椒疫病抗性引入適應性強的易感品種中，回交時抗性低于供體親本，這很可能是由于微效抗性基因的缺失（Palloix et al.，1990）。輪回選擇已被用于將多基因抗性轉移到優良材料中（Thabuis et al.，2004b）。然而，抗性基因與低產量、小果實及較弱的植株等相關基因連鎖，是廣泛采用抗性品種的主要限制。以分子生物學為基礎，應用于疫病抗性相關基因的研究，已成為解決常規育種問題的有效手段。發掘新基因無論是對于深入了解抗病的分子機制還是為基因研究做準備，都具有較大的研究價值。目前對辣椒疫病抗性相關基因表達、分子標記、遺傳圖譜、QTL定位、同源克隆等研究均取得了重要進展（Kim et al.，2008；Liu et al.，2014）。但對涉及疫病相關基因網絡缺乏研究，且其抗性分子機理也不清楚。隨著生物學技術手段的不斷發展，辣椒疫病抗性分子機理的研究將更加深入。