低氧誘導大鼠垂體腺瘤GH3細胞增殖、侵襲和上皮-間質轉化的機制研究

張歡，石文健，劉永亮，李景武，張于，董桂蘭，董偉

垂體腺瘤是最常見的顱內腫瘤之一，占原發性中樞神經系統腫瘤的14%，約35%的垂體腺瘤呈侵襲性生長［1］，與非侵襲性垂體腺瘤相比，侵襲性垂體腺瘤不僅手術全切率低，而且術后復發率高。上皮-間質轉化（epithelial-mesenchymal transformation，EMT）是上皮細胞轉化為間質細胞的生物學過程，與腫瘤的發生發展、遠處轉移、轉移定植、癌癥干性和化學抗性有關［2-3］。缺氧是組織中氧分壓低的一種情況，已成為腫瘤病理生理學的一個關鍵因素。低氧會在多種腫瘤中誘導EMT［4-6］，但在垂體腺瘤中尚不清楚。低氧誘導因子（hypoxia-inducible factors，HIF）是一類介導細胞適應低氧應激反應的調控因子，是細胞適應缺氧的主要驅動力。研究顯示，HIF-1α與垂體腺瘤的侵襲性行為有關［7］。在生長激素腺瘤中，HIF-1α可通過促進蛋白激酶A活性增加而導致生長激素過度合成［8］。本研究旨在分析低氧誘導大鼠垂體腺瘤GH3細胞增殖、侵襲和EMT的機制，以期為垂體腺瘤的臨床診療提供新的理論支持。

1 材料與方法

1.1 實驗時間 本實驗時間為2020年9月至2021年6月。

1.2 主要儀器與試劑 HIF-1α干擾片段（HIF-1αsiRNA）購自北京傲銳東源生物科技有限公司，GH3細胞購自美國ATCC公司，［3-（4，5-二甲基噻唑-2-基）-5-（3-羧甲酯基）-2-（4-磺苯基）-2H-四唑（金翁），內鹽；MTS］購自北京澤平科技有限責任公司，RNA提取試劑盒購自天根生化科技（北京）有限公司，反轉錄試劑盒和實時熒光定量試劑盒購自美國Thermo公司，HIF-1α、N-鈣黏蛋白（N-cadherin，N-Cad）、波形蛋白（Vimentin，Vim）、GAPDH一抗購自英國Abcam公司，小室實驗用Transwell板購自美國Corning公司。

1.3 細胞分組 將GH3細胞分為常氧組（不轉染HIF-1α-siRNA，氧濃度為19.5%）、低氧組（不轉染HIF-1α-siRNA，氧濃度為2.5%）、常氧+siRNA組（轉染HIF-1α-siRNA，氧濃度為19.5%）、低氧+siRNA組（轉染HIF-1α-siRNA，氧濃度為2.5%）。將GH3細胞置于2.5%胎牛血清+15%馬血清中，在37 ℃、5% CO2培養箱中培養。將處于對數生長期的GH3細胞先接種于6孔板中，常規培養至融合度為80%，更換新鮮培養液；將3 μg HIF-1α-siRNA稀釋于5 μl Lipofectamine 3000TM中，加入含5 μl P3000TM的減血清培養基，補充總體系至250 μl，混勻后室溫孵育5 min；將DNA-脂質體復合物加入6孔板中，分別將細胞置于不同氧濃度（常氧：19.5% O2；低氧：2.5% O2）的恒溫恒濕培養箱中培養。

1.4 細胞增殖能力檢測 取各組對數生長期的GH3細胞置于96孔板中，每孔種1×104個細胞，待細胞貼壁后，瞬時干擾HIF-1α表達，繼續培養24、48、72 h后分別加入20 μl［3-（4，5-二甲基噻唑-2-基）-5-（3-羧甲酯基）-2-（4-磺苯基）-2H-四唑（金翁），內鹽；MTS］，繼續培養4 h，檢測490 nm波長處吸光度值，即細胞增殖能力。實驗獨立重復3次。

1.5 細胞侵襲能力檢測 取各組對數生長期的GH3細胞，干擾HIF-1α表達24 h后，吸棄培養基，采用4 ℃磷酸鹽緩沖液洗2次，胰酶消化后，4 ℃下1 000 r/min離心5 min（離心半徑60 mm），收集各組細胞，調整細胞密度為2×105/ml，在Transwell板小室內種200 μl細胞，繼續培養24 h后取出，采用4%甲醛固定，擦去小室內的細胞，蘇木素染色后隨機取5個高倍視野（×400），計算細胞數目，取均值，即細胞侵襲能力。實驗獨立重復3次。

1.6 GH3細胞中 HIF-1α、N-Cad、Vim mRNA表達水平檢測 取各組對數生長期的GH3細胞，胰酶消化后利用一步法提取細胞總RNA，反轉錄合成cDNA。以cDNA為模板進行實時熒光定量PCR。PCR擴增條件為：50 ℃ 20 min，95 ℃ 10 min，95 ℃ 10 s，60 ℃ 1 min，共 40個循環。HIF-1α的正向引物為5'-TGCTCATCAGTTGCCACTTC-3'，反向引物為5'-CCATCCAGGGCTTTCAGATA-3'；N-Cad的正向引物為5'-ACGGGCAGATCACCACTATC-3'，反向引物為5'-TTTCACAAGTCTCGGCCTCT-3'；Vim的正向引物為5'-CCCAGATTCAGGAACAGCAT-3'，反向引物為5'-CACCTGTCTCCGGTATTCGT-3'；內參基因GAPDH的正向引物為5'-AACGACCCCTTCATTGACCT-3'，反向引物為5'-CCCCATTTGATGTTAGCGGG-3'。采用 2-ΔΔCt法計算 GH3細胞中 HIF-1α、N-Cad、Vim mRNA表達水平。實驗獨立重復3次。

1.7 GH3細胞中HIF-1α、N-Cad、Vim蛋白表達水平檢測 取各組對數生長期的GH3細胞，4 ℃下1 000 r/min離心5 min（離心半徑60 mm），收集各組細胞，采用磷酸鹽緩沖液洗3次，加入非變性裂解液，冰上孵育2 h，4 ℃下12 000 r/min離心15 min（離心半徑60 mm），取上清液，采用BCA法檢測樣品總蛋白濃度。電泳，采用濕轉法將蛋白轉移至聚偏氟乙烯膜，采用5%脫脂牛奶封閉1 h，分別加入HIF-1α一抗（1∶2 000）、E-Cad一抗（1∶1 000）、Vim一抗（1∶2 000）、GAPDH一抗（1∶10 000），4 ℃下過夜。采用TBST洗膜3次，加入相應的二抗孵育1 h，采用等滲Tris-HCl-Tween緩沖鹽溶液洗膜3次。加入ECL化學發光液，分析條帶灰度值，即HIF-1α、N-Cad、Vim蛋白表達水平。實驗獨立重復3次。

1.8 統計學方法 采用SPSS 22.0統計學軟件進行數據分析。服從正態分布的計量資料以（±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗。以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 各組細胞增殖能力比較 常氧組、低氧組、常氧+siRNA組、低氧+siRNA組干擾后24、48、72 h細胞增殖能力比較，差異有統計學意義（P＜0.05）。低氧組干擾后24、48、72 h細胞增殖能力高于常氧組，差異有統計學意義（P＜0.05）；常氧+siRNA組干擾后72 h細胞增殖能力低于常氧組，干擾后24、48、72 h細胞增殖能力低于低氧組，差異有統計學意義（P＜0.05）；低氧+siRNA組干擾后24 h細胞增殖能力高于常氧組，干擾后24、48、72 h細胞增殖能力低于低氧組、高于常氧+siRNA組，差異有統計學意義（P＜0.05）。常氧組、低氧組、常氧+siRNA組、低氧+siRNA組干擾后48、72 h細胞增殖能力分別高于本組干擾后24 h，差異有統計學意義（P＜0.05）；常氧組、低氧組、常氧+siRNA組、低氧+siRNA組干擾后72 h細胞增殖能力分別高于本組干擾后48 h，差異有統計學意義（P＜0.05），見表1。

表1 各組細胞增殖能力比較（±s，%，n=3）Table 1 Comparison of cell proliferation in each group

表1 各組細胞增殖能力比較（±s，%，n=3）Table 1 Comparison of cell proliferation in each group

注：a表示與常氧組比較，P＜0.05；b表示與低氧組比較，P＜0.05；c表示與常氧+siRNA組比較，P＜0.05；d表示與本組干擾后24 h比較，P＜0.05；e表示與本組干擾后48 h比較，P＜0.05

組別 干擾后24 h 干擾后48 h 干擾后72 h常氧組 0.42±0.01 0.57±0.03d 0.82±0.02de低氧組 0.59±0.02a 0.89±0.03ad 1.54±0.07ade常氧+siRNA組 0.38±0.01b 0.47±0.03bd 0.60±0.06abde低氧+siRNA組 0.48±0.02abc 0.61±0.02bcd 0.91±0.04bcde F值 37.71 41.26 68.56 P值 ＜0.001 ＜0.001 ＜0.001

2.2 各組細胞侵襲能力比較 常氧組、低氧組、常氧+siRNA組、低氧+siRNA組細胞侵襲能力分別為（301.3±6.4）%、（477.3±20.2）%、（188.7±19.4）%、（321.0±17.9）%。常氧組、低氧組、常氧+siRNA組、低氧+siRNA組細胞侵襲能力比較，差異有統計學意義（F=49.30，P＜0.001）。低氧組細胞侵襲能力高于常氧組，差異有統計學意義（P＜0.05）；常氧+siRNA組細胞侵襲能力低于常氧組、低氧組，差異有統計學意義（P＜0.05）；低氧+siRNA組細胞侵襲能力低于低氧組，高于常氧+siRNA組，差異有統計學意義（P＜0.05）。

2.3 各組GH3細胞中 HIF-1α、N-Cad、Vim mRNA表達水平比較 常氧組、低氧組、常氧+siRNA組、低氧+siRNA組 GH3細胞中HIF-1α、N-Cad、Vim mRNA表達水平比較，差異有統計學意義（P＜0.05）。低氧組GH3細胞中HIF-1α、N-Cad、Vim mRNA表達水平高于常氧組，差異有統計學意義（P＜0.05）；常氧+siRNA組GH3細胞中HIF-1α、Vim mRNA表達水平低于常氧組，HIF-1α、N-Cad、Vim mRNA表達水平低于低氧組，差異有統計學意義（P＜0.05）；低氧+siRNA組GH3細胞中HIF-1α、N-Cad、Vim mRNA表達水平低于低氧組，HIF-1α、Vim mRNA表達水平高于常氧+siRNA組，差異有統計學意義（P＜0.05），見表2。

表2 各組GH3細胞中HIF-1α、N-Cad、Vim mRNA表達水平比較（±s，n=3）Table 2 Comparison of HIF-1α，N-Cad and Vim mRNA expression levels in GH3 cells of each group

表2 各組GH3細胞中HIF-1α、N-Cad、Vim mRNA表達水平比較（±s，n=3）Table 2 Comparison of HIF-1α，N-Cad and Vim mRNA expression levels in GH3 cells of each group

注：HIF=低氧誘導因子，N-Cad=N-鈣黏蛋白，Vim=波形蛋白；a表示與常氧組比較，P＜0.05；b表示與低氧組比較，P＜0.05；c表示與常氧+siRNA組比較，P＜0.05

組別 HIF-1α mRNA N-Cad mRNA Vim mRNA常氧組 0.012±0.002 0.029±0.003 0.004 0±0.001 0低氧組 0.091±0.018a 0.166±0.013a 0.012 0±0.001 0a常氧+siRNA組 0.003±0.001ab 0.006±0.006b 0.001 0±0.000 1ab低氧+siRNA組 0.011±0.001bc 0.046±0.007b 0.002 0±0.000 2bc F值 20.66 68.65 37.75 P值 ＜0.001 ＜0.001 ＜0.001

2.4 各組GH3細胞中HIF-1α、N-Cad、Vim蛋白表達水平比較 常氧組、低氧組、常氧+siRNA組、低氧+siRNA組GH3細胞中HIF-1α、N-Cad、Vim蛋白表達水平比較，差異有統計學意義（P＜0.05）。低氧組GH3細胞中HIF-1α、N-Cad、Vim蛋白表達水平高于常氧組，差異有統計學意義（P＜0.05）；常氧+siRNA組GH3細胞中HIF-1α、N-Cad、Vim蛋白表達水平低于常氧組、低氧組，差異有統計學意義（P＜0.05）；低氧+siRNA組GH3細胞中Vim蛋白表達水平高于常氧組，HIF-1α、N-Cad、Vim蛋白表達水平低于低氧組、高于常氧+siRNA組，差異有統計學意義（P＜0.05），見表3、圖1。

圖1 BCA法檢測各組GH3細胞中HIF-1α、N-Cad、Vim蛋白表達水平的電泳圖Figure 1 The electrophoretic patterns of HIF-1α，N-Cad and Vim protein expression levels in GH3 cells of each group detected by BCA method

表3 各組GH3細胞中HIF-1α、N-Cad、Vim蛋白表達水平比較（±s，n=3）Table 3 Comparison of HIF-1α，N-Cad and Vim protein expression levels in GH3 cells of each group

表3 各組GH3細胞中HIF-1α、N-Cad、Vim蛋白表達水平比較（±s，n=3）Table 3 Comparison of HIF-1α，N-Cad and Vim protein expression levels in GH3 cells of each group

注：a表示與常氧組比較，P＜0.05；b表示與低氧組比較，P＜0.05；c表示與常氧+siRNA組比較，P＜0.05

組別 HIF-1α蛋白 N-Cad蛋白 Vim蛋白常氧組 0.323±0.052 0.430±0.021 0.660±0.032低氧組 0.910±0.035a 1.110±0.055a 1.260±0.095a常氧+siRNA組 0.140±0.026ab 0.203±0.024ab 0.340±0.052ab低氧+siRNA組 0.283±0.038bc 0.493±0.012bc 0.983±0.044abc F值 76.27 143.60 42.94 P值 ＜0.001 ＜0.001 ＜0.001

3 討論

腫瘤微環境是由腫瘤細胞和腫瘤周圍浸潤的免疫細胞、新生血管及其內皮細胞、腫瘤相關成纖維細胞和細胞外基質共同構成的［9］，在實體腫瘤的發生發展及轉移中起重要作用。作為腫瘤微環境的特征之一，低氧與多種腫瘤侵襲性和預后不良相關［10-11］。HIF-1α是細胞對缺氧做出反應的關鍵轉錄因子之一，與腫瘤EMT［7］、血管生成［12］、藥物抗性［13］密切相關。本研究旨在分析低氧誘導大鼠垂體腺瘤GH3細胞增殖和EMT的機制。

國際癌癥基因組聯盟發起的“全基因組泛癌分析”計劃顯示，在27類1 188種癌癥中腫瘤組織內低氧程度與基因突變頻率增加有關，低氧在基因組重構和腫瘤惡性進展中起關鍵作用［11］。腫瘤組織內低氧環境有助于腫瘤的可塑性和異質性［14］。國內有報道稱，低氧促進小鼠垂體腺瘤GT1-1細胞增殖，在12 h達到峰值，隨后呈下降趨勢［15］。本研究結果顯示，低氧組干擾后24、48、72 h細胞增殖能力高于常氧組；常氧+siRNA組干擾后72 h細胞增殖能力低于常氧組，干擾后24、48、72 h細胞增殖能力低于低氧組；低氧+siRNA組干擾后24 h細胞增殖能力高于常氧組，干擾后24、48、72 h細胞增殖能力低于低氧組、高于常氧+siRNA組；常氧組、低氧組、常氧+siRNA組、低氧+siRNA組干擾后48、72 h細胞增殖能力分別高于本組干擾后24 h；常氧組、低氧組、常氧+siRNA組、低氧+siRNA組干擾后72 h細胞增殖能力分別高于本組干擾后48 h；提示低氧可促進垂體腺瘤細胞增殖，而干擾HIF-1α未能完全阻斷低氧的促腫瘤細胞增殖作用。低氧組細胞侵襲能力高于常氧組；常氧+siRNA組細胞侵襲能力低于常氧組、低氧組；低氧+siRNA組細胞侵襲能力低于低氧組，高于常氧+siRNA組；提示低氧可促進垂體腺瘤細胞侵襲，而干擾HIF-1α未能完全阻斷低氧的促腫瘤細胞侵襲作用。推測在垂體腺瘤中除了HIF-1α外，還有其他的調控機制，如2-酮戊二酸依賴性［16］、低氧誘導的內質網應激反應［17］，但這需要進一步研究驗證。

HIF-1是由HIF-1α和HIF-1β組成的異源二聚體，其中HIF-1α可反映機體缺氧程度，通過代謝、增殖和血管生成等多個生理過程參與癌癥的發生發展［8］。HIF-1α能增強內皮細胞向低氧組織的遷移，即促進EMT，進而促進新生血管形成［18］。垂體腺瘤中EMT與腺瘤的侵襲性密切相關，誘導EMT可促進GH3細胞的侵襲和增殖，相反則抑制GH3細胞的侵襲和增殖，并引起GH3細胞阻滯于G1期［19］。大部分垂體腺瘤均有HIF-1α表達并且其水平與垂體腺瘤的侵襲性密切相關［20］。與血管豐富的正常腦垂體相比，垂體腺瘤具有較低的血管密度，但腫瘤內的缺氧條件仍可激活一些誘導途徑，導致血管密度增加或形成更有序的微血管幾何形狀以維持腫瘤生長［21］。本研究結果顯示，低氧組GH3細胞中HIF-1α mRNA及其蛋白表達水平高于常氧組；常氧+siRNA組GH3細胞中HIF-1α mRNA及其蛋白表達水平低于常氧組、低氧組；低氧+siRNA組GH3細胞中HIF-1α mRNA及其蛋白表達水平低于低氧組、高于常氧+siRNA組；提示低氧狀態下GH3細胞的HIF-1α表達水平明顯升高，本研究采用的siRNA技術未能完全阻斷HIF-1α的表達。E-鈣黏蛋白（E-cadherin，E-Cad）通常在上皮細胞中表達，其表達下調破壞細胞內連接使上皮細胞獲得遷移能力。當E-Cad轉變為N-Cad時，導致腫瘤細胞侵襲和擴散［22-23］。本研究結果顯示，低氧組GH3細胞中N-Cad mRNA表達水平高于常氧組；常氧+siRNA組GH3細胞中N-Cad mRNA表達水平低于低氧組；低氧+siRNA組GH3細胞中N-Cad mRNA表達水平低于低氧組；低氧組GH3細胞中N-Cad蛋白表達水平高于常氧組；常氧+siRNA組GH3細胞中N-Cad蛋白表達水平低于常氧組、低氧組；低氧+siRNA組GH3細胞中N-Cad蛋白表達水平低于低氧組、高于常氧+siRNA組；提示E-Cad轉化為N-Cad是低氧誘導GH3細胞發生EMT的主要機制。這一表現和既往應用細胞周期抑制劑帕博西尼影響GH3細胞侵襲的機制相同［24］，即影響E-Cad向N-Cad的轉化。Vim作為EMT的正調節因子，其上調被認為是EMT的先決條件［25］。本研究結果顯示，低氧組GH3細胞中Vim mRNA表達水平高于常氧組；常氧+siRNA組GH3細胞中Vim mRNA表達水平低于常氧組、低氧組；低氧+siRNA組GH3細胞中Vim mRNA表達水平低于低氧組、高于常氧+siRNA組；低氧組GH3細胞中Vim蛋白表達水平高于常氧組；常氧+siRNA組GH3細胞中Vim蛋白表達水平低于常氧組、低氧組；低氧+siRNA組GH3細胞中Vim蛋白表達水平高于常氧組、常氧+siRNA組，低于低氧組；提示在低氧促進GH3細胞發生EMT的過程中，Vim也發揮重要作用。

綜上所述，低氧通過上調HIF-1α表達而促進GH3細胞增殖和細胞侵襲，低氧通過上調N-Cad、Vim表達而促進EMT的發生，干擾HIF-1α表達可部分阻斷這些作用。深入了解HIF-1α通路參與垂體腺瘤發生發展的分子調控機制可為垂體腺瘤的藥物治療提供新思路和理論依據。然而，本研究并未構建過表達HIF-1α模型，從過表達HIF-1α和干擾HIF-1α表達兩方面證實HIF-1α與EMT的關系。在未來的研究中，本研究組計劃構建穩定高表達HIF-1α和干擾HIF-1α表達的動物模型，比較兩者的動物表型，為垂體腺瘤中靶向HIF-1α治療提供新的證據。

作者貢獻：張歡撰寫論文，進行結果分析與解釋；石文健、劉永亮、李景武進行數據收集；張于、董桂蘭進行數據整理、分析；董偉進行文章的構思與設計，負責文章的質量控制及審校，并對文章整體負責、監督管理。

本文無利益沖突。