Box-Behnken設計響應面法優化啤酒花中α-酸及β-酸超聲提取工藝

段海濤 姚 婷 黃安群 郭誠諾 張景峰 李 俊 耿啟泉 張愛玲

(1.河南牧業經濟學院動物科技學院，鄭州 450046；2.北京市飼料監察所，北京 100107；3.中國農業科學院飼料研究所，北京 100081；4.衛輝市農業農村局，衛輝 453100；5.山東魯莘飼料集團有限公司，聊城 252000)

啤酒花(HumuluslupulusL.)，也可稱為酒花、酵母花、蛇麻花等[1]，是傳統的中藥之一，有健胃、安神[2-3]、抗氧化[4]、化痰止咳、抗菌消炎[5-6]等功效。2019年1月25日，歐盟批準啤酒花抽提物(HumuluslupulusL.flos)作為飼料添加劑用于斷奶仔豬、育肥豬等。

目前，國內外啤酒花提取工藝具有一定的研究進展。艾娜絲等[7]對啤酒花精油超臨界CO2萃取工藝進行了優化。Latif等[8]研究了酶解輔助提取啤酒花精油。白璐[9]利用響應面法優化微波提取啤酒花α-酸的工藝，提取溶劑為有機溶劑。目前，啤酒花的有機溶劑提取研究較多[10-12]，但有機溶劑的揮發及后續處理問題較為復雜，不利于行業健康可持續發展。

提取條件如溶劑類型、超聲功率及溫度等均對提取率產生顯著影響[13-14]，超聲提取中關于料液比、提取時間及提取溫度這3個因素對α-酸和β-酸提取率的影響研究較少。常規單因素試驗優化提取條件不僅耗時，且需要大量試驗，同時無法考慮變量之間的交互作用。Box-Behnken設計響應面法是一種用于多變量建模和優化的數學統計方法，能夠綜合評價一組變量與響應值(因變量)的關系，可用于優化提取條件。本試驗采用乙醇作為提取溶劑，利用超聲空化作用、熱作用、機械攪拌、擴散、乳化和機械粉碎等優勢，采用Box-Behnken設計，以提取得到的α-酸和β-酸的含量為評價指標，探究超聲提取工藝的最佳條件，為啤酒花提取加工企業提供技術支持。

1 材料與方法

1.1 試驗原料

顆粒狀啤酒花樣品由新疆某啤酒花有限公司提供。

1.2 主要試劑

甲醇(分析純，天津康科德科技有限公司)、乙醇(分析純、濰坊銘陽實驗分析儀器有限公司)、氫氧化鈉飽和溶液、蒸餾水等。

1.3 主要儀器

Multiskan Go分光光度計(金業德祥生物科技有限公司)、METVX200-T振蕩器(施銳貿易有限公司)、FRQ-1004T超聲波清洗機(蘇州力翰威自動化設備有限公司)、ZN-02型粉碎機(興時立和科技發展有限公司)等。

1.4 α-酸和β-酸含量檢測方法

啤酒花中的活性成分主要為α-酸(葎草酮類)和β-酸(蛇麻酮類)，其中α-酸主要為葎草酮、合葎草酮和加葎草酮，β-酸主要為蛇麻酮、合蛇麻酮和加蛇麻酮[5]。

啤酒花α-酸、β-酸含量的檢測方法參照GB/T 20639—2006。準確稱取混合均勻的啤酒花樣品1.000 0 g，放入燒杯中，加入20.0 mL乙醇，放入超聲波清洗機中進行超聲提取，精確移取0.5 mL上清液放入10 mL的容量瓶中，用甲醇定容，此為A液。再移取A液0.6 mL放入10 mL的容量瓶中，用堿性甲醇(100 mL的甲醇中加入6 mol/L的NaOH 0.2 mL)定容，此為B液。分別在波長275、325及355 nm下測定B液的吸光度值，α-酸和β-酸含量的計算公式為：

α-酸含量(%)=0.666 7×[-(51.56×A355)+(73.79×A325)-(19.07×A275)];β-酸含量(%)=0.666 7×[-(55.57×A355)-(47.59×A325)+(5.10×A275)]。

式中：A355、A325、A275分別為B液在波長355、325、275 nm下的吸光度值，其余數據均為公式中的經驗值。

1.5 試驗單因素設定范圍

本試驗以乙醇為溶劑，超聲清洗機頻率為49 Hz，經前期摸索，料液比分別設為1∶10、1∶15、1∶20、1∶25、1∶30 (g∶mL)；提取溫度分別設為20、30、40、50、60 ℃；提取時間分別設為10、20、30、40、50 min。單因素試驗每個試驗點重復4次。

1.6 Box-Behnken響應面試驗

根據單因素試驗結果，利用Design Expert軟件，以料液比、提取時間、提取溫度3個因素為自變量，提取液中α-酸和β-酸含量為響應值，按照3因素3水平進行Box-Behnken響應面試驗，確定啤酒花超聲提取的最佳工藝條件。

1.7 數據處理與分析

采用SPSS 18.0對試驗結果進行均值差異顯著性檢驗，顯著標準為P<0.05。采用Design-Expert 10.0.4對試驗結果進行分析，建立以α-酸和β-酸含量為響應值的復合評價體系，設計3因素3水平的二次回歸方程，擬合自變量與響應值的函數關系。將得到的2個回歸方程聯立共解，以獲得同時滿足α-酸、β-酸提取的最佳條件。

2 結果與分析

2.1 單因素試驗

2.1.1 料液比對超聲提取啤酒花中α-酸和β-酸含量的影響

不同料液比對α-酸和β-酸含量的影響見圖1。提取液中α-酸和β-酸含量隨料液比的增加呈先升高后降低趨勢。料液比為1∶25時α-酸和β-酸含量顯著高于料液比為1∶10、1∶15及1∶30時(P<0.05)，與料液比為1∶20時差異不顯著(P>0.05)。根據上述結果，選擇料液比1∶25作為響應面的中心點。

數據點標注不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)。下圖同。Data points with different small letters mean significant difference (P<0.05).The same as below.圖1 料液比對α-酸和β-酸含量的影響Fig.1 Effects of solid-liquid ratio on α-acid and β-acid contents

2.1.2 提取溫度對超聲提取啤酒花中α-酸和β-酸含量的影響

不同提取溫度對α-酸和β-酸含量的影響見圖2。提取液中α-酸和β-酸含量隨提取溫度的升高先升高后降低。提取溫度為20 ℃時α-酸含量顯著低于其余4個提取溫度(P<0.05)；提取溫度為40 ℃時β-酸含量顯著高于20 ℃時(P<0.05)。根據上述結果可知，α-酸和β-酸的提取率隨提取溫度的升高呈先升高后降低趨勢，30～60 ℃時雖差異不顯著(P>0.05)，但以40 ℃為中點，因此選擇提取溫度40 ℃作為響應面的中心點。

圖2 提取溫度對α-酸和β-酸含量的影響Fig.2 Effects of extraction temperature on α-acid and β-acid contents

2.1.3 提取時間對超聲提取啤酒花中α-酸和β-酸含量的影響

不同提取時間對α-酸和β-酸含量的影響見圖3。提取液中α-酸和β-酸含量隨提取時間的延長呈升高趨勢。提取時間為40 min時α-酸含量顯著高于提取時間為10和20 min時(P<0.05)，與提取時間為30、50 min時無顯著差異(P>0.05)；提取時間為40 min時β-酸含量顯著高于提取時間為10 min時(P<0.05)，與其余提取時間無顯著差異(P>0.05)。α-酸和β-酸的提取率隨提取時間的延長呈先升高后穩定的趨勢，30～50 min時雖差異不顯著，但以40 min為中點，因此選擇提取時間40 min作為響應面的中心點。

2.2 Box-Behnken響應面試驗

根據單因素試驗結果，設定Box-Behnken響應面試驗的因素和水平，詳見表1。Box-Behnken響應面試驗結果見表2。

表1 響應面試驗因素與水平Table 1 Factors and their levels used in response surface test

表2 響應面試驗結果Table 2 Experimental results of response surface test

利用Design Expert10.0.4軟件進行回歸模型方差分析和顯著性檢驗，分別得到α-酸(Y1)和β-酸含量(Y2)與3個因素料液比(A)、提取時間(B)、提取溫度(C)的三元二次多項式回歸方程：

Y1=54.46-10.97×A+5.77×B+6.62×C-0.51×AB-8.44×AC+2.83×BC-16.47×A2-20.44×B2-10.61×C2；Y2=48.74-7.68×A+3.59×B+3.56×C-0.72×AB-4.59×AC+1.12×BC-14.59×A2-16.78×B2-11.93×C2。

由表3和表4可以看出，2個回歸模型都達到了極顯著水平(P<0.01)，決定系數(R2)分別為0.945 9和0.964 2，同時失擬檢驗不顯著(P>0.05)，說明模型與實際結果擬合良好。

表3 α-酸含量作為響應值的回歸模型方差分析Table 3 ANOVA for regression model with α-acid content as response value

表4 β-酸含量作為響應值的回歸模型方差分析Table 4 ANOVA for regression model with β-acid content as response value

2.3 響應面試驗中各個因素的交互作用分析

利用Design Expert 10.0.4軟件，根據得到的回歸方程，對表3和表4的數據進行多元回歸擬合，繪制不同的影響因素對響應值的三維曲線圖，響應面的陡峭程度表明各個自變量對于α-酸和β-酸含量的影響情況。等高線的密集程度可表示因素的變化對α-酸和β-酸含量的影響程度[15-16]。

由圖4及表3可知，在等高線的中心區域，α-酸含量最高，由中心向邊緣逐漸降低。在3個因素中，料液比對α-酸含量的影響極顯著(P<0.01)，提取時間對α-酸含量的影響顯著(P<0.05)，提取溫度對α-酸含量的影響顯著(P<0.05)，料液比和溫度的交互作用對α-酸含量的影響顯著(P<0.05)。等高線密集程度及響應面的陡峭程度表明，料液比對α-酸含量的影響最大，其次是提取溫度及提取時間。

圖4 各因素對α-酸含量影響的響應面圖Fig.4 Response surface graphs for effects of various factors on α-acid content

由圖5及表4可知，在等高線的中心區域，β-酸含量最高，由中心向邊緣逐漸降低。3個因素中，料液比對β-酸含量的影響極顯著(P<0.01)，提取時間及提取溫度對β-酸含量的影響呈弱顯著性(P=0.058 2、P=0.059 8)，提取溫度和提取時間的交互作用顯著影響β-酸含量(P<0.05)。等高線密集程度及響應面的陡峭程度表明，對β-酸含量影響最大的是料液比，其次是提取時間及提取溫度。

圖5 各因素對β-酸含量影響的響應面圖Fig.5 Response surface graphs for effects of various factors on β-acid content

將2個回歸方程聯立求解，對各自變量求導，得到α-酸和β-酸的最佳提取條件：即料液比1∶10，提取時間50 min，提取溫度54 ℃，此時回歸模型預測α-酸含量為51.16%，β-酸含量為43.16%。

為驗證試驗結果的可靠性，用試驗得到的最佳提取條件對啤酒花中的α-酸和β-酸進行超聲提取，共重復3次作為平行試驗，測定α-酸和β-酸含量，取平均值，最終得到的實測結果α-酸含量為50.89%，β-酸含量為42.93%。實測值與預測值接近，吻合良好，模型準確可靠，能較好地預測啤酒花實際提取中α-酸和β-酸的提取情況。

3 討 論

3.1 料液比對超聲提取啤酒花中α-酸和β-酸含量的影響

料液比是直接影響物質與溶劑間擴散效率的重要因素之一，在料液比較小或處于某一范圍內時，提取率隨料液比的增大而增大，溶劑析出效應占主導[17]，但當物質與溶劑間的擴散達到了平衡狀態時，料液比增大將會出現提取率下降趨勢[15,18]。連文綺[14]研究微波提取啤酒花中α-酸和β-酸時發現，料液比過小，萃取不完全，料液比過大，造成萃取溶劑浪費及后期加工費用提升等問題。此外，料液比與溶液黏稠度相關，料液比較低時，溶液黏稠，有效成分溶解不夠充分，不利于超聲提取，當料液比增加時，多糖分子易于溶出，提取率增大[19]。在本試驗中，改變料液比，α-酸和β-酸含量隨料液比增加而呈現出先上升后下降的趨勢。在料液比由1∶10增加至1∶25時，α-酸和β-酸含量逐漸上升，原因可能是料液比較小時，溶液的黏度較大，分子擴散速度低，提取率小，隨著料液比的繼續增加，溶液中α-酸和β-酸的含量降低，使更多的α-酸和β-酸從啤酒花中釋放出來，提高提取率。當料液比進一步提升時，α-酸和β-酸從啤酒花中釋放出來的增加量小于溶劑添加量，溶質被進一步稀釋，因此α-酸和β-酸的含量又呈現出下降的趨勢。

3.2 提取溫度對超聲提取啤酒花中α-酸和β-酸含量的影響

溫度升高能夠加快分子運動速度和分子滲透擴散能力，加快物質溶出率，提高提取率[20]。冷進松等[21]研究啤酒花精油超聲輔助水酶法提取工藝，研究發現最適提取溫度為50 ℃。王亞南[22]提取啤酒花中總黃酮，最適提取溫度為52 ℃，超聲負壓連續提取有效減少提取過程中活性成分損失。在本試驗中，α-酸和β-酸含量隨提取溫度的升高而呈現出先上升后下降的趨勢，提取溫度升高，啤酒花內部的分子熱運動加劇，更有利于α-酸和β-酸的析出，提取液中α-酸和β-酸的含量升高，提取率增加，但是提取溫度繼續升高，超過40 ℃后會對啤酒花分子造成一定程度的破壞，從而導致提取率降低。夏娜[23]研究發現，溫度越高，啤酒花中α-酸和β-酸提取率變化幅度變大，損失率升高，與本試驗研究結果一致。

3.3 提取時間對超聲提取啤酒花中α-酸和β-酸含量的影響

超聲具有空化作用、熱作用、機械攪拌、擴散、乳化和機械粉碎等優勢，一定范圍內，延長提取時間可提升提取率[24-25]。孫世琨[26]探究啤酒花中黃酮類物質的提取，發現超聲最佳提取條件為：乙醇溶液濃度60%，提取時間15 min，料液比1∶30(g∶mL)。在本試驗中，提取液中α-酸和β-酸含量均隨提取時間的延長而呈現出上升的趨勢，但到40 min后α-酸和β-酸含量會逐漸變得平穩，無明顯下降，超聲時間的延長對其提取率的改變已無明顯作用。與前人研究結果不同的原因在于，本試驗采用超聲提取，以乙醇作為提取溶劑，從提取率來看，本試驗采用超聲提取的提取率優于微波提取[23,26]。

3.4 本試驗α-酸和β-酸提取率與前人結果對比分析

提取方式不同，啤酒花中α-酸和β-酸的提取率有所差異。艾娜絲等[7]探究超臨界CO2萃取“青島大花”啤酒花精油的最適工藝參數，以干制啤酒花為原料，以萃取壓力、萃取溫度、萃取時間為試驗因子，采用正交試驗設計篩選最佳工藝參數，啤酒花精油的得油率為5.3%，主要成分為月桂烯(40.37%)、α-律草烯(9.12%)、反式石竹烯(4.67%)。白璐[9]采用響應面法建立乙醇濃度、料液比、微波時間3個因素與α-酸含量之間的數學模型，確定啤酒花的最優提取工藝條件為：乙醇濃度70.74%，料液比1∶20.93，微波時間79.62 s。在此條件下，α-酸含量可達14.02%。連文綺[14]通過單因素試驗和正交試驗優化微波輔助萃取α-酸、β-酸的最佳工藝參數，最佳條件下α-酸含量(質量分數)為43.65%，β-酸含量(質量分數)為35.03%。本試驗采用超聲提取，最佳提取條件下，α-酸含量為50.89%，β-酸含量為42.93%。與前人研究結果不同的原因在于，超聲提取與微波提取方式不同，但α-酸含量均呈現高于β-酸含量的趨勢。

4 結 論

利用響應面法優化超聲提取條件后可有效提高啤酒花中α-酸和β-酸的提取率，與本文中單因素試驗結果相比，α-酸提取率提高約20%，β-酸提取率提高約16%。優化后啤酒花中α-酸和β-酸的最佳提取條件為：料液比1∶10、提取溫度54 ℃、提取時間50 min。