引進的香蕉種質資源對云南枯萎病菌株的抗性評價

劉立娜，楊寶明，王永芬，3，曾 莉，黃玉玲，李永平，尹可鎖，李迅東，彭學彬，徐勝濤，番華彩，白亭亭，張 晶，4，李 舒，鄭泗軍，5

(1 云南省農業科學院農業環境資源研究所/云南省農業跨境有害生物綠色防控重點實驗室，昆明，650205；2 云南農業大學/省部共建云南生物資源保護與利用國家重點實驗室，昆明，650201；3 云南省農業科學院熱帶亞熱帶經濟作物研究所，云南保山，678000；4 云南大學農學院/云南大學資源植物研究院，昆明，650500；5 國際生物多樣性中心，昆明，650205)

香蕉在熱帶和亞熱帶國家是非常重要的經濟作物和糧食作物之一[1]。然而，全球香蕉產業發展正受到枯萎病的嚴重威脅。云南作為我國香蕉重要產區之一，大面積栽培的優良品種巴西蕉是易感病品種，缺乏綜合農藝性狀良好的抗病種質資源[2]。因此，遴選和儲備抗病香蕉種質資源對云南有效防治香蕉枯萎病具有戰略性的意義。香蕉枯萎病是由尖孢鐮刀菌古巴?；虵usariumoxysporumf. sp.cubense侵染引起的維管束壞死的真菌病害，其分布廣、擴散快、毀滅性強、尚無有效的防控措施[3-4]。特別是4號生理小種熱帶型(TR4)為害尤為嚴重，大量香蕉種植園因TR4而被撂荒[5-7]。香蕉無性繁殖和遺傳基礎單一加大了傳統方法選育抗病種質資源的應用難度，在現有香蕉資源中遴選抗病種質資源對于防控TR4十分關鍵。傳統的抗病性評價通常在田間進行，對親本品系的選擇至關重要，但是該種評價方式耗時耗力，病原菌在大田分布不均勻且需要大量農田[8]。溫室枯萎病抗性的評價利用有限空間、可控生長條件和防止其他生物交叉感染等方面優勢，大多數種質資源的評價周期短且評估準確[9-10]。蒲金基等認為香蕉對枯萎病的抗性不僅與寄主本身的遺傳特性有關，還會受到病原菌種類、濃度以及環境因素的影響[11-12]。由于各個香蕉產區枯萎病菌的遺傳背景不同，在一地表現抗病的種質資源很可能在其他環境中表現為感病[10]。研究表明不同來源的菌株對寄主植株表現出不同的致病力[13]，香蕉對不同來源的TR4響應中也發現了差異，GCTCV-119在苗期接種TR4菌株VCG01213/16表現為抗病，對TR4菌株FOC35表現為中抗[9，14]。VCG01213/16分離于廣東省，而FOC35由中國熱帶農業科學院分離于海南省，因此分離于不同地區的TR4菌株致病力和致病寄主范圍都有可能存在差異?；谖覀円褟膰H生物多樣性研究中心引進百余份香蕉種質資源和在云南西雙版納分離到強致病力的TR4菌株[10，15]，本研究在溫室內測定不同濃度云南菌株TR4(15-1)侵染下香蕉種質資源球莖的病情指數，評估香蕉種質資源對云南菌株TR4(15-1)的抗性，確定具有抗性的種質資源；結合本文香蕉種質資源對其他來源TR4菌株侵染的響應，篩選具有廣譜抗病性的香蕉種質資源，為云南產區香蕉抗病資源的儲備、抗病種質資源的應用和抗病基因的篩選提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

從國際生物多樣性研究中心引進，保存于云南省農業科學院的11份香蕉種質資源，種質資源信息見表1。11份種質資源包含有AA基因型2份，AAA基因型8份，AAB基因型1份，其中Pahang為抗病種質，Baxi Jiao為感病種質。

供試病原菌為在云南西雙版納分離的強致病性野生型菌株TR4(15-1)[10，15]。

表1 11份保存于云南省農業科學院的香蕉種質

1.2 香蕉幼苗培養

供試11份香蕉種質資源組織培養幼苗在椰糠基質中培養約6周，生長至高10 cm后接種菌株TR4(15-1)，每份種質每批接種20株以上，2019年7月和2019年8月分別接種2批。

1.3 菌株TR4(15-1)孢子的培養

將-80 ℃保存的菌株TR4(15-1)接種于PDA平板上，28 ℃黑暗培養7 d產孢，用無菌水洗脫PDA平板上的分生孢子，注入裝有300 mL PDA液體培養基的錐形瓶中，25 ℃下150 rpm搖瓶培養3 d；兩層紗布過濾去除菌絲，采用血球計數板在顯微鏡下將孢子液濃度調整至1×106個孢子/mL和1×108個孢子/mL。

PDA培養基配置方法：去皮馬鈴薯200 g，切成小塊，用1 000 mL水煮沸15 min，四層紗布過濾去馬鈴薯殘渣，加入葡萄糖20 g，瓊脂粉20 g，加水定容至1 000 mL，121 ℃高壓滅菌20 min。PDA液體培養基為不加瓊脂粉的PDA培養基。

1.4 接種方法

采用傷根浸菌法接種[16]，略作修改。取出椰糠中培養的香蕉苗，把待接種的香蕉苗按照種質資源編號有序取出擺好，用剪刀將香蕉苗根系修剪至長5 cm左右，將根浸沒于孢子懸浮液中(濃度分別為1×106個孢子/mL和1×108個孢子/mL)，間隔5 min攪拌1次懸浮液；30 min后取出浸泡香蕉苗移栽于混合基質土(質量250 g)的盆缽中，再分別以接種量1×106個孢子/mL和1×108個孢子/mL灌根。

1.5 病情指數調查

分別在接種14 d和20 d解剖球莖調查發病情況，枯萎病情況按照0～4級分級[17]，計算病情指數。病情指數=Σ(各級病株數×相應級數)/(調查總株數×最高級數)×100。采用SPSS 16.0軟件對數據進行統計分析，TTEST進行差異顯著性檢驗。

1.6 抗病性評估

不同種質資源的抗病性評估參考文獻[9]，根據接種后20 d病情指數將香蕉種質資源對TR4的抗性分為6個等級，分別為植株免疫(I)，病情指數=0；高抗(HR)，0<病情指數<20；抗病(R)，20≤病情指數<40；中抗(MR)，40≤病情指數<60；感病(S)，60≤病情指數<80；高感(HS)，80≤病情指數≤100。

2 結果與分析

2.1 香蕉種質對云南菌株TR4(15-1)侵染的響應

試驗結果看出，不同種質資源接種菌株TR4(15-1) 1×106個孢子/mL后14 d和20 d，抗病種質Pahang病情指數分別為10.42和28.57，感病種質資源Baxi Jiao病情指數分別為43.75和79.43，表明接種數據可靠，可用于進一步分析。接種后14 d，Baxi Jiao的病情指數顯著高于其他種質，其他種質之間病情指數無顯著性差異；接種20 d，Baxi Jiao、Banksii、Ibwi的病情指數顯著高于Kazirakwe、Igitsiri、Mbwazirume、Inkira以及抗病種質Pahang?？共》N質Pahang與Kazirakwe、Igitsiri、Mbwazirume、Inkira接種14 d的病情指數范圍為3.12～18.75，接種20 d的病情指數范圍為20.31～29.27，劃分等級為抗病R。香蕉種質資源Akpakpak病情指數高于Pahang，分別為28.75和40.42，顯著低于感病種質資源Baxi Jiao，抗性等級為中抗MR。說明接種TR4(15-1) 1×106個孢子/mL條件下，Kazirakwe、Igitsiri、Mbwazirume、Inkira、Pahang是云南菌株TR4(15-1)的抗病種質資源。

11份香蕉種質資源接種菌株TR4(15-1)1×108個孢子/mL后14 d和20 d，Pahang的病情指數分別為21.25和31.25，為抗病種質資源；Baxi Jiao為感病種質資源，病情指數分別為71.25和70.31，表明接種條件可靠。接種14 d，Baxi Jiao和Banksii的病情指數顯著高于其他種質。接種20 d，Baxi Jiao、Banksii、Ibwi、GCTCV-19、Gros Michel的病情指數顯著高于Kazirakwe、Igitsiri、Mbwazirume、Inkira、Akpakpak以及Pahang?？共》N質資源Pahang與Kazirakwe、Igitsiri、Mbwazirume、Inkira、Akpakpak接種20 d的病情指數范圍是21.87～39.06，抗病等級為抗病R(見表2、圖1和圖2)。說明病菌高濃度條件下，Kazirakwe、Igitsiri、Mbwazirume、Inkira、Pahang仍然是云南菌株TR4(15-1)的抗病種質。

表2 11份香蕉種質接種枯萎病菌TR4(15-1)不同濃度孢子懸浮液后病情指數比較

圖1 11份香蕉種質接種香蕉枯萎病菌TR4(15-1)1×106 個孢子/mL后解剖球莖變化

圖2 11份香蕉種質接種香蕉枯萎病菌TR4(15-1)1×108 個孢子/mL后解剖球莖變化

2.2 香蕉種質對菌株TR4(15-1)不同濃度菌液的響應差異

試驗結果看出，Pahang、Igitsiri、Mbwazirume和Inkira病情指數在接種常規濃度(1×106個孢子/mL)條件下小于接種高濃度(1×108個孢子/mL)，但數據無顯著性變化，均為抗病R；Baxi Jiao、Banksii、Ibwi 3份種質在接種低濃度和高濃度條件下均劃分為感病種質；Gros Michel和GCTCV-119在不同濃度條件下病情指數變化較大，等級由中抗MR到感病S(見圖3)。說明對接種不同濃度菌株響應相同的香蕉種質資源占81.82%，相關系數R2>0.78；香蕉種質資源接種常規濃度即可明確其對菌株TR4的抗病等級。

注：線圈代表病情指數。

2.3 香蕉種質對不同來源菌株TR4的響應差異

試驗結果看出，9份種質對不同來源菌株TR4的抗病性基本一致，占比為81.83%。差異較大的種質資源是Banksii和Ibwi，它們對廣東菌株TR4(VCG01213/16)表現為抗病，對云南菌株TR4(15-1)表現為感病。

篩選的6份抗病種質，即Kazirakwe、Igitsiri、Mbwazirume、Inkira、Akpakpak、Pahang在不同來源菌株TR4侵染下，均表現為抗病，具有廣譜抗病性(見表3)。

表3 11份香蕉種質資源對不同地區香蕉枯萎病菌4號生理小種的抗性評估

3 結論與討論

香蕉枯萎病已成為全球香蕉產業和糧食安全的主要威脅[19-20]，抗枯萎病種質資源篩選是有效利用抗病材料或抗病基因的前提[21]。田間抗病性評價耗時耗力，需要大量農田，且評估可重復性較差[8]。溫室枯萎病抗性評價可以在有限的空間、可控的條件下進行，可防止其他生物的交叉感染，且周期短，評估準確性高[10，18]。因此，我們選擇在溫室對引進的11份香蕉種質資源進行抗病性評估。試驗篩選出6份抗病種質資源，即Kazirakwe、Igitsiri、Mbwazirume、Inkira、Akpakpak、Pahang，下一步將在西雙版納枯萎病重病基地進行這些種質農藝性狀和大田抗性的進一步評估。

高接種量可用于鑒定高抗性種質資源[10]。一般當接種濃度達到103個孢子/mL，感病種質即可發病。試驗中，接種TR4(15-1)高濃度1×108個孢子/mL時，Kazirakwe、Igitsiri、Mbwazirume、Inkira、Akpakpak、Pahang仍然表現為抗病，接種20 d的病情指數范圍是21.87～39.06，接近抗病種質Pahang的病情指數31.25，抗病等級為抗病R。因此，對于云南菌株TR4(15-1)，這6個種質是抗病種質。

香蕉種質資源對枯萎病的抗性主要取決于寄主本身的遺傳特性[9，14]，雖然受到病原菌接種劑量的影響，但大多數香蕉種質資源抗病等級一般不會變化?？共∠憬斗N質接種高濃度的云南菌株TR4(15-1)后病情指數大于常規濃度接種，這主要由于接種劑量影響感染速度[8]。在植物組織中檢測到孢子數量與一些物種的抗性水平顯著相關，如苜蓿，鷹嘴豆等[22-23]，除GCTCV-119和Gros Michel外，本研究未發現同一種質在不同濃度間的抗性存在顯著性差異。

各香蕉產區枯萎病菌的遺傳背景不同，表現抗病的種質資源很可能在另一地就表現為感病[24]。本研究收集了11份香蕉種質對廣東菌株TR4(VCG01213/16)侵染的影響，在云南菌株1×106個孢子/mL接種濃度下，除Banksii和Ibwi兩份種質由抗病變為感病，其余種質抗病情況基本一致，占比達81.82%。因此，香蕉種質資源對TR4的抗病性受TR4菌株來源、菌株濃度的影響，但具有決定性的因素仍然是香蕉種質資源本身的遺傳特性。

GCTCV-119在苗期接種廣東菌株TR4(VCG 01213/16)表現為抗病[18]，對海南菌株TR4(FOC 35)表現為中抗[14]，云南菌株TR4(15-1)常規濃度侵染下表現為中抗，高濃度下表現為感病。GCTCV-119是目前認可的抗病種質資源，而不同研究中其抗病性不一致。一方面可能由于接種菌株及接種量的差異[11，22-23]，我們選擇的TR4菌株為強致病力菌株15-1[10]，且接種量極高。Banksii和Ibwi兩份種質對TR4(VCG 01213/16)和TR4(15-1)的抗性由抗病變為感病，也表明我們使用的菌株具有較強致病性。另一方面可能與植物的生長發育時期相關，植物對多種病害的抗性可能受其生長時期的影響[25-26]。成熟植株的抗性明顯強于幼苗[27]，成熟植株的免疫反應和細胞保護結構均增強(如細胞壁加厚)，有助于其抵抗病原菌侵害。香蕉種質資源的組成型抗性和誘導抗性是其對病原菌抗性的共同原因[28]。研究顯示GCTCV-119雖然在苗期表現為感病，但是在田間表現為抗病[11]，我們在西雙版納枯萎病重病基地的田間初步調查結果也支持GCTCV-119為抗病種質資源。

植物對病原菌侵染的響應取決于植物、病原菌和環境等因素，研究結果表明香蕉種質資源對枯萎病菌的抗性主要決定于寄主本身的遺傳特性。因此，篩選云南菌株TR4(15-1)抗性香蕉種質資源，應用抗病種質資源和抗病基因科學防控云南香蕉枯萎病至關重要。我們評估了11份香蕉種質資源對云南菌株TR4(15-1)及其不同濃度的抗病性，篩選了6份高抗病種質資源，且這些資源對不同來源TR4菌株均表現為抗病，對TR4的抗性具廣譜性；而Banksii、Ibwi、GCTCV-119、Gros Michel這4份種質資源對不同來源菌株和不同菌株濃度的響應變化較大。本試驗結果為云南香蕉種質資源的多樣性利用，抗枯萎病種質資源的應用奠定了基礎。