HPLC法同時測定不同基原崖桑皮和桑白皮中7種活性成分含量

黎海靈 黃艷萍 陳旭冰 谷文超 周游 張德全 周濃

摘 要 目的：建立同時測定重慶地區不同基原崖桑皮和桑白皮中7種活性成分含量的方法，為完善崖桑皮和桑白皮的質量控制標準以及比較兩者質量等同性提供參考。方法：采用高效液相色譜（HPLC）法測定58批崖桑皮和桑白皮藥材中新綠原酸、桑皮苷A、綠原酸、紫云英苷、山柰酚、桑辛素和異槲皮素的含量，色譜柱為Diamonsil C18，流動相為0.1%甲酸溶液-乙腈（梯度洗脫），流速為1.0 mL/min，檢測波長為280 nm，柱溫為30 ℃，進樣量為10 μL。利用SPSS 22.0軟件，采用獨立樣本t檢驗、主成分分析和聚類分析方法分析58批崖桑皮和桑白皮藥材中上述7種活性成分的含量差異。結果：上述7種活性成分在各自質量濃度范圍內與峰面積的線性關系良好（r≥0.999 0），精密度、穩定性（24 h）、重復性、耐用性和加樣回收率試驗的RSD均小于3%。崖桑皮中新綠原酸、桑皮苷A、綠原酸、紫云英苷、山柰酚、桑辛素和異槲皮素的平均含量分別為0.304、22.462、1.730、1.308、1.593、2.842、0.657 mg/g，而桑白皮中上述7種活性成分的平均含量分別為0.305、22.995、2.486、2.438、2.916、4.158、1.264 mg/g。獨立樣本t檢驗結果顯示，崖桑皮和桑白皮的上述7種活性成分中只有山柰酚的含量差異具有統計學意義（P<0.05）;主成分分析和聚類分析結果均顯示崖桑皮中上述7種活性成分的含量與桑白皮無明顯差別。結論：所建HPLC法簡便、靈敏、準確度高，可為完善崖桑皮和桑白皮的質量控制標準提供參考。崖桑皮和桑白皮在主要活性成分上具有一定的質量等同性，以華桑和雞桑為來源的崖桑皮可作為桑白皮的代替品使用。

關鍵詞 崖桑皮;桑白皮;新綠原酸;桑皮苷A;綠原酸;紫云英苷;山柰酚;桑辛素;異槲皮素;含量;基原

ABSTRACT OBJECTIVE： To establish a method for the simultaneous determination of 7 active components in Mori Australis Cortex and Mori Cortex from different sources in Chongqing area， so as to provide reference for improving the quality control standards of Mori Australis Cortex and Mori Cortex and comparing the equivalence of their quality. METHODS： HPLC method was used to determine the contents of neochlorogenic acid， mulberroside A， chlorogenic acid， astragalin， kaempferol， morusin and isoquercetin in 58 batches of Mori Australis Cortex and Mori Cortex. The chromatographic column was Diamonsil C18 with mobile phase consisted of 0.1% formic acid solution-acetonitrile （gradient elution） at the flow rate of 1.0 mL/min. The detection wavelength was 280 nm， column temperature was 30 ℃， and the injection volume was 10 μL. Using SPSS 22.0 software， independent sample t-test， principal component analysis and cluster analysis were used to analyze the content difference of the above-mentioned 7 active components in Mori Australis Cortex and Mori Cortex. RESULTS： There was a good linear relationship between the peak area and the concentration of the above 7 active components （r≥0.999 0）. The RSDs of precision， stability （24 h）， repeatability， durability and recovery were less than 3%. The average contents of neochlorogenic acid， mulberroside A， chlorogenic acid， astragalin， kaempferol， morusin and isoquercetin in Mori Australis Cortex were 0.304， 22.462， 1.730， 1.308， 1.593， 2.842 and 0.657 mg/g， respectively. Those of Mori Cortex were 0.305， 22.995， 2.486， 2.438， 2.916， 4.158 and 1.264 mg/g， respectively. The results of independent sample t-test showed that only the content of kaempferol in the above 7 active components of Mori Australis Cortex and Mori Cortex had significant difference （P<0.05）. The results of principal component analysis and cluster analysis showed that there was no significant difference in the contents of above 7 active components between Mori Australis Cortex and Mori Cortex. CONCLUSIONS： The established HPLC method is simple， sensitive and accurate， which can provide a reference for improving the quality control standard of Mori Australis Cortex and Mori Cortex. Mori Australis Cortex and Mori Cortex have certain quality equivalence in main active components， and the Mori Australis Cortex from M. australis and M. cathayana can be used as a substitute for the Mori Cortex.

KEYWORDS Mori Australis Cortex; Mori Cortex; Neochlorogenic acid; Mulberroside A; Chlorogenic acid; Astragalin; Kaempferol; Morusin; Isoquercitrin; Content; Source

桑白皮為?？浦参锷orus alba L.的干燥根皮，始載于《神農本草經》，用藥歷史悠久。據2020年版《中國藥典》（一部）記載，桑白皮性味甘、寒，歸肺經，入藥可用于治療肺熱喘咳、水腫脹滿、尿少、面目肌膚浮腫等疾病[1-2]。崖桑皮為?？浦参镫u桑M.australis Poir.或華桑M.cathayana Hemsl.的干燥根皮，入藥具有與桑白皮相似的功效，主要在重慶、四川、貴州、廣西等地作為地方習用品使用，收載于2010年版《四川省中藥材標準》[3]。隨著中藥材產業的發展和市場對中藥材需求的日益擴大，中藥材多基原利用在一定時期內對擴大藥源、保障臨床用藥需求具有重要意義。但不同基原的藥材往往成分不同、品質參差不齊，難以用統一的標準來控制其質量和保證臨床療效，嚴重影響了中藥材的安全性、有效性和可控性。

桑屬植物的根皮主要含有黃酮類、芪類、生物堿類和香豆素類等化學成分[4-6]。其中，黃酮類化合物是桑白皮的藥效物質基礎，芪類化合物被認為是植物抗毒素物質[7-9]。在2020年版《中國藥典》和2010年版《四川省中藥材標準》中，僅以外觀性狀、顯微鑒別和薄層鑒別作為桑白皮和崖桑皮的質量控制標準，未對其有效成分含量測定項進行相關規定。陳志永等[10]對桑白皮有效成分新綠原酸、桑皮苷A、綠原酸、紫云英苷、桑根酮C和桑辛素進行了含量測定;魏敏等[11]測定了桑白皮中桑皮苷A、氧化白藜蘆醇、桑色素、桑根酮D、桑黃酮G、桑皮酮H和桑辛素的含量;袁婷等[12]利用高效液相色譜法（HPLC）測定了桑白皮中綠原酸、二氫桑色素、氧化白藜蘆醇、桑辛素O、桑根酮C的含量。本研究在前人研究基礎上，采用HPLC法同時測定重慶地區不同基原桑白皮和崖桑皮中新綠原酸、桑皮苷A、綠原酸、紫云英苷、山柰酚、桑辛素和異槲皮素等7種活性成分的含量（其中崖桑皮中活性成分的含量測定是首次報道）;同時，采用獨立樣本t檢驗、主成分分析和聚類分析方法對桑白皮和崖桑皮中7種活性成分的含量進行評價，比較其含量差異性，以期為完善桑白皮和崖桑皮的質量控制標準及討論其入藥質量等同性提供參考。

1 材料

1.1 主要儀器

本研究所用的主要儀器有LC-20AT型HPLC儀（日本Shimadzu公司）、SB-5200DTN型超聲波清洗機（寧波新芝生物科技股份有限公司）、TDZ5-WS型多管架自動平衡離心機（湖南賽特湘儀離心機儀器有限公司）、ML204型電子分析天平[梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司，精度0.000 1 g]、CP225D型電子天平（德國Sartorius公司，精度0.000 01 g）、DZF-6050MBE型電熱恒溫真空干燥箱（上海博訊實業有限公司）。

1.2 主要試劑

本研究所用的主要試劑有新綠原酸、桑皮苷A、綠原酸、紫云英苷、山柰酚、桑辛素、異槲皮素對照品（成都德斯特生物技術有限公司，批號分別為DST190124- 015、DST190408-068、DST180504-21、DST190312-001、DST160928-056、DST180729-069、DST180108-006，純度均大于98%），乙腈（色譜純，德國Merck公司）;其他試劑均為分析純，水為娃哈哈牌純凈水。

1.3 藥材

1.3.1 樣品藥材 53批崖桑皮和桑白皮樣品藥材于2018年10月采集于重慶市部分區縣（表1中編號Y1～Y44、S2～S10，其中Y代表崖桑皮樣品、S代表桑白皮樣品），經重慶三峽學院生物與食品工程學院周濃教授鑒定分別為?？浦参镫u桑M. australis Poir.、華桑M. cathayana Hemsl.或桑M. alba L.的干燥根皮。另有3批崖桑皮樣品藥材（編號Y45～Y47）于2018年10月購于成都、重慶的藥材市場，經周濃教授鑒定為?？浦参镫u桑M. australis Poir.或華桑M. cathayana Hemsl.的干燥根皮。將上述藥材于45 ℃烘干至恒質量，粉碎，過80目篩，密封儲存于4 ℃環境中，待用。

1.3.2 對照藥材 桑白皮對照藥材（編號S1，批號DST181226-004）、崖桑皮對照藥材（編號Y48，批號DST190115-135）均購自成都德斯特生物技術有限公司。

2 方法與結果

2.1 溶液的制備

2.1.1 混合對照品溶液 精密稱取新綠原酸、桑皮苷A、綠原酸、紫云英苷、山柰酚、桑辛素和異槲皮素對照品各適量，置于同一量瓶中，用70%甲醇溶液溶解并配制成上述成分質量濃度分別為0.287、0.466、0.148、0.118、0.058、0.328、0.185 mg/mL的混合對照品溶液，用0.22 ?m微孔濾膜濾過，備用。

2.1.2 供試品溶液 精密稱取藥材粉末0.5 g，置于具塞錐形瓶中，精密加入70%甲醇溶液25 mL，混勻，稱定質量，在室溫條件下超聲（功率300 W，頻率40 kHz，下同）提取30 min，冷卻至室溫，用70%甲醇溶液補足減失的質量，以4 000 r/min離心10 min，取上清液，用0.22 ?m微孔濾膜濾過，即得供試品溶液。

2.1.3 陰性樣品溶液 精密量取70%甲醇溶液25 mL，置于具塞錐形瓶中，按“2.1.2”項下“稱定質量……用0.22 ?m微孔濾膜濾過”步驟操作，制得陰性樣品溶液。

2.2 色譜條件

色譜柱為Diamonsil C18（250 mm×4.6 mm，5 μm），流動相為0.1%甲酸溶液（A）-乙腈（B），梯度洗脫（洗脫程序如表2所示），流速為1.0 mL/min，檢測波長為280 nm，柱溫為30 ℃，進樣量為10 μL。

2.3 方法學考察

2.3.1 系統適用性試驗 分別精密吸取“2.1”項下混合對照品溶液、供試品溶液（編號Y41）和陰性樣品溶液適量，按“2.2”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積，所得色譜圖如圖1所示。結果，理論板數按桑辛素峰計算大于8 000，各待測成分峰與相鄰峰之間的分離度均大于1.5;陰性樣品溶液對測定無干擾。

2.3.2 線性關系考察 分別精密吸取“2.1.1”項下混合對照品溶液適量，用70%甲醇溶液稀釋得到系列對照品溶液，按“2.2”項下色譜條件依次進樣測定，記錄峰面積。以各對照品峰面積（y）與其相應的質量濃度（x）進行線性回歸，結果如表3所示。由表3可知，7種活性成分的r均不小于0.999 0，表明線性關系良好。

2.3.3 精密度試驗 取同一混合對照品溶液適量，按“2.2”項下色譜條件連續進樣測定6次，記錄峰面積。結果，新綠原酸、桑皮苷A、綠原酸、紫云英苷、山柰酚、桑辛素和異槲皮素峰面積的RSD分別為2.81%、2.78%、2.33%、2.50%、2.79%、2.52%和0.77%（n=6），表明儀器精密度良好。

2.3.4 穩定性試驗 取同一供試品溶液（編號Y41）適量，分別在室溫下放置0、2、4、8、12、16、24 h時按“2.2”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積。結果，新綠原酸、桑皮苷A、綠原酸、紫云英苷、山柰酚、桑辛素和異槲皮素峰面積的RSD分別為1.61%、1.89%、2.80%、2.14%、2.39%、0.74%和1.01%（n=7），表明供試品溶液在室溫下放置24 h內的穩定性良好。

2.3.5 重復性試驗 精密稱取樣品（編號Y41）粉末0.5 g，平行6份，分別按“2.1.2”項下方法制備供試品溶液，再按“2.2”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積并按外標法計算樣品中7種活性成分的含量。結果，新綠原酸、桑皮苷A、綠原酸、紫云英苷、山柰酚、桑辛素和異槲皮素含量的RSD分別為2.92%、1.82%、2.62%、2.73%、1.06%、2.18%和2.69%（n=6），表明該方法重復性良好。

2.3.6 加樣回收率試驗 取“2.3.5”項下已知含量的樣品（編號Y41）粉末0.25 g，精密稱定，加入混合對照品溶液1 mL，平行6份，分別按“2.1.2”項下方法制備供試品溶液，再按“2.2”項下色譜條件進樣測定，計算加樣回收率。結果，新綠原酸、桑皮苷A、綠原酸、紫云英苷、山柰酚、桑辛素和異槲皮素的平均加樣回收率分別為100.56%、101.36%、101.31%、103.85%、104.38%、104.43%和101.46%，RSD分別為2.13%、2.79%、2.34%、2.80%、1.86%、2.90%和2.23%（n=6），表明該方法準確度良好。

2.3.7 耐用性試驗 精密稱取樣品（編號Y41）粉末適量，按“2.1.2”項下方法制備供試品溶液，再按“2.2”項下色譜條件分別以不同色譜儀（Shimadzu LC-20AT、Agilent 1260）、不同色譜柱（Diamonsil C18、Venusil ASB C18、Inertsustain C18）、不同流速（0.8、1.0、1.2 mL/min）、不同柱溫（25、30、35 ℃）進行測定，各條件平行操作3次，記錄峰面積并按外標法計算樣品中7種活性成分的含量，結果如表4所示。由表4可知，7種活性成分含量的RSD均小于3.0%，表明該方法耐用性良好。

2.4 樣品測定

取58批崖桑皮和桑白皮藥材粉末各適量，分別按“2.1.2”項下方法制備供試品溶液，再按“2.2”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積并按外標法計算藥材中7種活性成分的含量，每批藥材平行測定3次。采用SPSS 20.0軟件對含量結果進行單因素方差分析，比較不同基原崖桑皮和桑白皮藥材中7種活性成分的含量差異性，結果如表5、表6所示。

由表5、表6可知：（1）不同批次崖桑皮或不同批次桑白皮中7種活性成分的含量差異有統計學意義（P<0.05）。（2）崖桑皮中新綠原酸、桑皮苷A、綠原酸、紫云英苷、山柰酚、桑辛素和異槲皮素的平均含量分別為0.304、22.462、1.730、1.308、1.593、2.842、0.657 mg/g，平均總含量為30.896 mg/g;桑白皮中上述7種活性成分的平均含量分別為0.305、22.995、2.486、2.438、2.916、4.158、1.264 mg/g，平均總含量為36.562 mg/g。無論是單一成分含量還是總含量，桑白皮均高于崖桑皮。編號為S5的桑白皮的總含量最高（達到64.144 mg/g），編號為Y45的崖桑皮的總含量最低（僅為2.272 mg/g）。（3）從總體上看，大部分崖桑皮樣品藥材中新綠原酸、桑皮苷A、綠原酸和桑辛素的含量高于其對照藥材，而紫云英苷（編號Y36樣品除外）、山柰酚、異槲皮素的含量均低于其對照藥材。桑白皮樣品藥材中新綠原酸、綠原酸和桑辛素（編號S2樣品除外）的含量高于其對照藥材，而桑皮苷A（編號S5樣品除外）、紫云英苷（編號S2樣品除外）、山柰酚（編號S4樣品除外）和異槲皮素的含量低于其對照藥材。

2.5 獨立樣本t檢驗

采用SPSS 22.0軟件對崖桑皮和桑白皮藥材中7種活性成分的含量數據進行獨立樣本t檢驗，分析崖桑皮與桑白皮之間7種活性成分含量的差異性。結果表明，崖桑皮與桑白皮中山柰酚的含量差異具有統計學意義（P<0.05），而其他6種活性成分的含量差異無統計學意義（P>0.05），如表7所示。

2.6 主成分分析

采用SPSS 22.0軟件對崖桑皮和桑白皮藥材中7種活性成分進行主成分分析，結果提取到了3個特征值>1的主成分。其中，主成分1的特征值為2.443，特征貢獻率為34.906%;主成分2的特征值為1.499，特征貢獻率為21.416%;主成分3的特征值為1.004，特征貢獻率為14.349%;3個主成分的累計貢獻率為70.671%。主成分1主要反映了紫云英苷、山柰酚、桑辛素、異槲皮素的信息;主成分2主要反映了新綠原酸、桑皮苷A、綠原酸的信息;主成分3主要反映了桑辛素的信息。

對提取的主成分1、2、3分別計算得分和排序，計算公式為：

F1=0.104X1-0.041X2+0.136X3+0.337X4+0.357X5+0.035X6+0.369X7

F2=0.422X1+0.418X2+0.434X3-0.950X4-0.640X5+0.316X6-0.114X7

F3=-0.375X1+0.349X2-0.440X3+0.135X4+0.610X5+0.717X6+0.570X7

上式中，F1、F2、F3分別表示第1、2、3個主成分得分，X1～X7分別表示7種活性成分的標準化數據。再以3個主成分所對應的特征貢獻率和累計貢獻率的比值為權重，進行綜合得分計算和排序，計算公式為F綜=0.494F1+0.303F2+0.203F3，可得出：編號Y48藥材的主成分1得分最高，為2.908;編號S5藥材的主成分2得分最高，為3.309;編號S4藥材的主成分3得分最高，為3.754。此外，編號S4藥材的綜合得分最高，為1.555，表明該藥材樣品的品質較其他藥材樣品的品質更高[13]。

根據3個主成分的得分繪制散點圖，可將58批藥材分成5組（圖2），其中編號Y48藥材為第1組，編號S5藥材為第2組，編號Y14藥材為第3組，編號Y41藥材為第4組，其余54組藥材聚在一起歸為一大組，即第5組。此結果說明主成分分析未能將崖桑皮與桑白皮藥材區分開來。

2.7 聚類分析

以崖桑皮和桑白皮藥材中7種活性成分的含量為依據，采用SPSS 22.0軟件以歐氏距離法進行聚類分析，結果如圖3所示。由圖3可知，當歐氏距離小于15時，58批藥材可分為5大類——第Ⅰ類：Y48、S1;第Ⅱ類：S5;第Ⅲ類：S4;第Ⅳ類：Y12、Y14;第Ⅴ類：剩余批次藥材。同時，7種活性成分含量相近或相同的崖桑皮和桑白皮的距離大多比較接近，因此不能將崖桑皮和桑白皮進行區分。此結果與主成分分析結果大體一致。崖桑皮中7種活性成分的含量與桑白皮無明顯差別，這一結論為崖桑皮代替桑白皮使用提供了理論支持。

3 討論

3.1 所測指標成分的選擇

桑屬植物中主要活性成分為黃酮類和芪類物質，本研究結合崖桑皮和桑白皮的臨床藥效以及前人研究內容，最終選擇了黃酮類化合物異槲皮素、紫云英苷、山柰酚、桑辛素，苯丙素類化合物綠原酸、新綠原酸和芪類化合物桑皮苷A作為桑白皮和崖桑皮的有效成分含量測定指標。其中，綠原酸和新綠原酸具有抗病毒、抗腫瘤、抗菌、解熱、抗血栓等功效[12，14-16];桑皮苷A在體內可以轉化為氧化白藜蘆醇，發揮降糖作用[17-18];紫云英苷和異槲皮素具有消炎、鎮痛、抗菌、抗過敏、抗肝毒等藥理作用[19-21];桑辛素具有抑制血小板聚集、抗超氧化自由基形成、降血糖等作用[22-23];山柰酚對腦缺血、中風、腫瘤等有明顯的治療作用[24-25]。

3.2 提取方法的選擇

在供試品溶液的制備過程中，本研究分別考察了不同提取方式（超聲、回流）、提取溶劑（體積分數分別為30%、50%、70%、80%、100%的甲醇和乙醇溶液）、提取時間（15、30、45、60 min）、料液比[1 ∶ 30、1 ∶ 50、1 ∶ 70、1 ∶ 200 （g/mL）]和提取次數（1、2、3次）對崖桑皮和桑白皮中7種活性成分含量的影響。結果顯示，提取方式為超聲提取、提取溶劑為70%甲醇溶液、提取時間為30 min、料液比為1 ∶ 50（g/mL）、提取1次的提取效果最佳。

3.3 活性成分測定結果分析

雖然從整體上看，上述7種活性成分無論是單一成分含量還是總含量，桑白皮均高于崖桑皮，但獨立樣本t檢驗結果顯示，7種活性成分中只有山柰酚的含量差異具有統計學意義（P<0.05）;主成分分析和聚類分析結果也表明，崖桑皮與桑白皮中7種活性成分的含量無明顯差別。以上結果顯示，除山柰酚外，崖桑皮和桑白皮在主要活性成分上具有一定的質量等同性，因此在抗病毒、抗菌、解熱等藥理活性方面，以華桑和雞桑為來源的崖桑皮可作為桑白皮的代替品使用。

對照藥材是一種中藥標準物質，具有高度均勻性、量值準確性以及良好的穩定性[26]。本研究以崖桑皮和桑白皮對照藥材的含量為參考標準，發現大部分崖桑皮樣品中新綠原酸、桑皮苷A、綠原酸和桑辛素的含量均高于其對照藥材，但紫云英苷（編號Y36樣品除外）、山柰酚、異槲皮素的含量均低于其對照藥材;而桑白皮樣品中僅有新綠原酸、綠原酸和桑辛素（編號S2樣品除外）的含量高于其對照藥材。這表明所采集的重慶地區不同來源崖桑皮和桑白皮的藥材樣品低于對照藥材的含量標準，入藥需結合各有效成分的藥效學做進一步深入研究。

綜上所述，本研究采用HPLC法對重慶地區不同基原崖桑皮和桑白皮中7種活性成分的含量進行了測定，測定指標涵蓋了上述2種藥材的主要有效成分。該方法簡便、靈敏、準確度高，可為完善上述2種藥材的質量控制標準提供參考。測定結果顯示，崖桑皮和桑白皮在主要活性成分上具有一定的質量等同性，以華桑和雞桑為來源的崖桑皮可作為桑白皮的代替品使用。此外，本研究存在一些不足，首先是藥材的采集產地比較單一，僅能反映重慶地區崖桑皮和桑白皮中7種有效成分的質量等同性;其次是測定的芪類成分較少。因此，為了全面評價崖桑皮和桑白皮的質量，下一步將采集其他地區的樣品，測定包括黃酮類、芪類、核苷類、三萜酸類、多糖類等多種活性成分的含量，以期進一步對不同基原崖桑皮和桑白皮的藥材品質進行綜合評價。

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（收稿日期：2020-12-23 修回日期：2021-06-10）

（編輯：胡曉霖）