坡柳皂苷對大菜粉蝶中腸組織的影響

于 航，李豐超，李金梁，秦小萍*，劉全俊

(1.云南農業大學 植物保護學院,云南 昆明 650201；2.云南農業大學 水利學院，云南 昆明 650201)

0 引言

大菜粉蝶(Pierisbrassicae)屬鱗翅目(Lepidoptera)粉蝶科(Pieridae)，又名歐洲粉蝶、甘藍粉蝶、大白蝶，其幼蟲俗稱甘藍毛蟲，寄主為油菜、白菜、蘿卜和甘藍等十字花科植物，危害特點為小齡幼蟲群集于葉背啃食葉肉，齡期大后則分散成小群暴食葉片，甚至連葉脈和葉柄都吃光，嚴重影響了油菜和蔬菜的質量和產量(吳祖銀等[1]，1982)。大菜粉蝶(Pierisbrassicae)是十字花科蔬菜上的主要害蟲之一，目前對其仍以化學農藥防治為主，不合理的施用方式以及大劑量、多次施藥，造成了害蟲抗性逐年升高、農藥殘留等問題。因此，開發防治大菜粉蝶的植物源農藥，了解植物源農藥作用機制，探究坡柳皂苷對大菜粉蝶中腸組織的影響具有重要的意義。坡柳皂苷是一種從坡柳種子中提取出來的齊墩果烷型三萜皂苷、萜烯類物質。學者們研究發現坡柳皂苷具有抗炎癥(Arun等[2]，2008；Bernays等[3]，2001)和抗潰瘍(Getie等[4]，2003；Khalil等[5]，2006)的活性，之后也有學者研究發現其具有抗蟲活性。在殺蟲作用研究中發現，坡柳皂苷對大菜粉蝶幼蟲具有較強的拒食作用(張余杰等[6]，2014)。秦小萍等[7](2007)研究發現：坡柳種子的乙醇提取物對小菜蛾具有非選擇性拒食作用，對菜青蟲的生長發育有影響。楊美林等[8](2003)研究得出：坡柳乙醇提取物對小菜粉蝶4齡幼蟲24 h選擇拒食作用的AFC50值為691.6 mg/L，完全拒食作用的AFC50值為398.0 mg/L。付立新[9](2010)、秦小萍[7]等(2015)從坡柳種子中分離鑒定了拒食活性成分坡柳皂苷A(圖1)，齊墩果烷三萜皂苷類物質含量為7.89%。代玉玲等[10](2012)通過正交設計優選出坡柳(總)皂苷提取方法。廉喜紅等[11](2005)發現苦皮藤素對粘蟲中腸腸壁細胞的內膜和質膜系統有一定影響，在苦皮藤素作用下，試蟲的柱狀細胞頂膜微絨毛出現擴張、線粒體膨大腫脹、粗面內質網囊泡化、杯狀細胞與柱狀細胞之間的間隙增大。周琳等[12](2009)發現雷公藤總堿對粘蟲的中腸細胞及細胞器有一定的影響，表現為微絨毛混亂脫落、線粒體腫脹、雙層膜不完整、內質網膨大囊泡化。本課題組在研究前期發現，坡柳皂苷對鱗翅目昆蟲具有拒食作用以及胃毒作用，對坡柳皂苷的殺蟲機制研究較少。研究發現，使用較高濃度處理大菜粉蝶幼蟲，會使部分試蟲在短期內出現死亡的現象，猜測在較高濃度下，坡柳皂苷對大菜粉蝶幼蟲有一定的胃毒活性，本文研究了坡柳皂苷對大菜粉蝶中腸的影響，以揭示其對胃毒作用的貢獻。

圖1 坡柳皂苷A結構圖

1 材料與方法

1.1 試蟲

大菜粉蝶幼蟲：人工累代飼養后挑選蛻皮后第一天的5齡幼蟲。

1.2 試劑

坡柳皂苷為本實驗室自行制備，其中齊墩果烷型皂苷含量為61%。

濃度為2.5%的戊二醛、pH值為7.2～7.4的PBS緩沖液、國產分析乙醇。

1.3 方法

1.3.1 試蟲處理 挑選蛻皮后第一天的5齡幼蟲，饑餓6 h，處理組試蟲以載毒葉碟法飼喂(吳文君[13]，1988)(用1 mg/mL坡柳皂苷水溶液浸漬直徑為1.2 cm的葉碟1 s，待溶劑揮發后，喂蟲，一蟲一葉)，分別于蟲取食完成24和48 h后，取幼蟲中腸制備樣品，對照組試蟲飼喂同樣大小浸泡過水溶液的葉碟。

1.3.2 標本制備 分別取處理組(24和48 h)及對照試蟲，在冰盤上快速解剖，取出中腸，4 ℃下將中腸組織投入戊二醛中進行48 h前固定，PBS溶液洗脫，鋨酸后固定，PBS溶液洗脫，梯度酒精(30%、50%、70%、90%、100%)脫水，包埋劑包埋，在常溫下和60 ℃烘箱中各聚合48 h，醋酸鈾和檸檬酸鉛進行雙重染色。

1.3.3 生物顯微鏡觀察 將樣品切成半薄切片，在生物顯微鏡下觀察并拍照。

1.3.4 透射電鏡觀察 將樣品切成超薄切片，在透射電子顯微鏡下觀察并拍照。

2 結果與分析

2.1 坡柳皂苷對大菜粉蝶幼蟲顯微結構觀察

由圖2可知，，取食正常飼料的大菜粉蝶幼蟲腸中沒有滯留食物殘渣，圍食膜依然存在，中腸細胞除只表現出稍有皺縮、分泌液滴增多外，并無其他明顯的病變(圖2-a-1、圖2-a-2)。取食1 mg/mL坡柳皂苷24 h后，中腸組織開始發生變化，處理試蟲的圍食膜消失，腸內壁微絨毛消失(圖2-b、圖2-c)，48 h后的病變更為明顯。食物和中腸組織接觸甚至可穿透中腸細胞層。中腸細胞病變的表現為先稍加厚，變得無明顯細胞層次，繼而脫落(圖2-b)，直至最后腸細胞組織全部脫落、消融而僅剩下環肌層(圖2-c)。解剖時，幼蟲的中腸組織極易斷裂，也證明了縱肌受到了破壞。

a-1.對照24 h×200,a-2.對照48 h×200,b.處理24 h×200,c.處理48 h×200,Vc.中腸細胞,lm.縱肌,cm.環肌,f.微絨毛,fa.脂肪體

2.2 坡柳皂苷對大菜粉蝶幼蟲環肌與底膜的影響

由圖3可知，取食正常葉碟的大菜粉蝶幼蟲的環肌與底膜緊密的聯系在一起，通過圖3-A1取食1 mg/mL坡柳皂苷24 h后，環肌與底膜開始分離(圖3-B1)，取食1 mg/mL坡柳皂苷48 h后，底膜脫落、消融，試蟲僅剩下環肌層。

A1.環肌(cm)與底膜(b)×10000,B1.環肌(cm)與底膜(b)×10000

2.3 坡柳皂苷對大菜粉蝶幼蟲微絨毛的影響

由圖4可知，取食正常葉碟的大菜粉蝶幼蟲中腸杯狀細胞微絨毛數量眾多，排列緊密整齊(圖4-A4)，取食1 mg/mL坡柳皂苷24 h后，大菜粉蝶幼蟲中腸細胞微絨毛腫脹變形，斷裂脫落(圖4-B3)。

A4.整齊排列的微絨毛(m)×10000,B3.微絨毛(m)脫落×10000

2.4 坡柳皂苷對大菜粉蝶幼蟲細胞器的影響

由圖5可知，取食正常葉碟的大菜粉蝶幼蟲中腸內細胞器發達排列整齊有序(圖5-A2)，取食1 mg/mL坡柳皂苷48 h后，中腸內各種細胞器均變形，并被溶酶體包圍而溶解(圖5-C1、圖5-C2)。

A2.細胞內豐富的細胞器×10000,C1.被溶酶體(ly)包圍的細胞器×15000,C2.同C1×30000

2.5 坡柳皂苷對大菜粉蝶幼蟲光面內質網的影響

由圖6可知，取食正常葉碟的大菜粉蝶幼蟲光面內質網發達且排列整齊有序(圖6-A3)，而取食1 mg/mL坡柳皂苷24 h后，大菜粉蝶幼蟲的光面內質網膨脹(圖6-B2)，取食1 mg/mL坡柳皂苷48 h后，大菜粉蝶幼蟲的光面內質網相比較于取食坡柳皂苷24 h后更加膨大(圖6-C3)。

A3.光面內質網(ser)×30000,B2.光面內質網(ser)×30000,C3.膨大的光面內質網(ser)×30000

3 討論

本研究通過透射電鏡觀察了大菜粉蝶取食坡柳皂苷后中腸細胞內部的變化，發現1 mg/mL坡柳皂苷對大菜粉蝶幼蟲的腸壁細胞及其細胞器均產生了影響。在1 mg/mL坡柳皂苷的作用下，大菜粉蝶幼蟲圍食膜和微絨毛消失，腸細胞與底膜分離，腔內出現大量空泡，溶酶體活動劇增，細胞器及細胞體出現自溶，光面內質網極度膨大。與已報道的川楝素對菜青蟲的中腸系統影響基本一致(張興等[14]，1991)。

本研究發現，1 mg/mL坡柳皂苷所導致的中腸組織病變與拒食作用無關，通過生物顯微鏡觀察后發現，48 h對照組的大菜粉蝶幼蟲中腸組織完好，并沒有表現出任何病變的情況，證明取食了1 mg/mL坡柳皂苷的幼蟲中腸的病變并不是由于拒食作用的影響。中腸組織的自溶是引起病變的主要原因。電鏡觀察結果表明，試蟲取食了1 mg/mL坡柳皂苷24 h后，中腸開始發生變化，微絨毛消失，溶酶體活動劇增，細胞器及細胞體發生自溶現象，這可能是后來引起中腸細胞溶解脫落的原因，但還需要對某些引起自溶的酶進行分析，以便進一步確認。

光面內質網形態上的病變與多功能氧化酶有關。昆蟲中腸內的微粒體多功能氧化酶是分解外源毒物的主要酶系，而光面內質網是微粒體的主要組成部分。光面內質網的病變可能標志著分解外源毒物功能的降低，但還需要進行MFO活性測定，以便進一步確認。

總之，通過對中腸組織較系統的觀察，證明了取食1 mg/mL坡柳皂苷后，大菜粉蝶幼蟲消化系統的正常功能受到了干擾，中腸組織受到嚴重破壞而發生脫落、自溶。坡柳皂苷對中腸這一消化系統主要器官的影響是引起昆蟲死亡的一個重要原因。

4 結論

大菜粉蝶4齡幼蟲取食坡柳皂苷24和48 h后，中腸組織發生了明顯的病變，說明這是坡柳皂苷對大菜粉蝶產生胃毒作用的靶點之一。