植物黃酮調控JNK通路干預氧化應激相關疾病的研究進展

宋欣豫，李大鵬

（山東農業大學食品科學與工程學院, 山東泰安 271018）

c-Jun氨基末端激酶（c-Jun N-terminal kinase，JNK）是由絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶組成的絲裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）家族的成員，是一類進化保守的激酶。MAPK在細胞增殖、分化、凋亡、神經元功能和應激反應中起主導作用。MAPK家族的成員還有ERKs和p38，每種激酶都存在多種亞型。

研究發現，JNK可被生長因子、細胞因子、應激等因素激活[1]，磷酸化JNK（p-JNK）通過磷酸化下游靶點c-Jun、ATF-2、ELK1、NEAT等，導致基因表達程序的改變，在細胞調控中起關鍵作用[2]。JNK通路功能紊亂可導致多種疾病。此外，JNK對應激通路具有調控作用。p-JNK能夠磷酸化c-Jun及ATF-2的氨基末端活性區域，促進細胞因子及蛋白表達[3]。應激條件下，JNK1和JNK2分別優先磷酸化c-Jun和ATF-2，使JNK轉錄的活性增強，誘導疾病的發生[4]。因此，抑制JNK可能在預防慢性疾病中非常重要。

氧化應激與多種疾病密切相關。飲食中的抗氧化劑（包括黃酮）被認為是氧化應激相關疾病的潛在保護劑。植物膳食中的水果、蔬菜及茶等是植物黃酮的主要飲食來源。植物黃酮具有抗氧化、抗炎和調節血管滲透等活性，對多種疾病的發生具有預防作用[5]。研究發現，植物黃酮常作為JNK調節劑用于預防糖尿病、缺血/再灌注損傷及神經退行性疾病等，本文就植物黃酮對JNK干預的最新研究進展進行了綜述。

1 JNK及其編碼基因

JNK有 3種基因亞型：JNK1、JNK2、JNK3，其中JNK1和JNK2可以在機體所有細胞中表達，而JNK3主要在神經組織和大腦中限制性表達[6]。JNK3的研究集中在其對中樞神經系統及阿爾茨海默病[7]等神經退行性疾病的調控作用。此外，JNK及其編碼基因均能由促炎細胞因子、生長因子或應激信號等激活。

2 JNK信號通路的調控網絡

MAPK通路由三級激酶組成：MAPK激酶激酶(MAPK kinase kinase，MAP3K)、MAPK 激酶（MAPK kinase，MAP2K）和MAPK。它們能夠逐級磷酸化，將上游信號傳遞到下游效應器。JNK信號通路的MAP3K主要有：凋亡信號調節激酶（Apoptotic signalregulated kinases，ASK）、TGF-β激活的蛋白激酶（TGF-βactivated protein kinase，TAK）等[8]。JNK信號通路上游的MAP2K主要是MKK7和MKK4。MKK7的激活依賴于細胞因子的作用，而MKK4在環境應激作用下能夠被激活[9]。MKK7和MKK4通過雙重磷酸化Thr-Pro-Tyr基序來協同激活JNK，MKK7 靶向 Thr183，MKK4 靶向 Tyr185[10]。

作為一種重要的JNK效應器，轉錄激活因子-1（activator protein-1, AP-1）既可以作為含有兩種Jun蛋白的同二聚體，也可以作為含有Jun蛋白和Fos蛋白的異二聚體[11]。JNK被激活后，能夠使c-Jun的N端Ser63和Ser73殘基發生磷酸化[12]。因此當c-Jun磷酸化增強時，AP-1的活性也會隨之增加，進而誘導下游基因的轉錄[13]。另外，JNK也可以直接磷酸化其他下游靶蛋白進而調控細胞轉錄過程，如ATF家族的成員、Elk-1、Bcl-2、Bim等，從而調節細胞凋亡、代謝和DNA修復等生理過程[14]。JNK信號通路也受到不同的支架蛋白調控，如JIP1、JIP2、JIP3 等（圖1）。

圖1 MAPK信號級聯示意圖Fig.1 MAPK signal cascade diagram

3 JNK與氧化應激

活性氧 (reactive oxygen species，ROS)能夠破壞DNA、蛋白質，從而使細胞氧化還原狀態失衡。當抗氧化蛋白清除能力低于ROS的產生時，就會引發氧化應激，從而損傷細胞。ROS介導的JNK信號通路在應激反應中起關鍵作用。ROS能夠使MAPK信號通路發生MAP3K→MAP2K→MAPKs三級級聯反應，進而從細胞質進入到細胞核中，靶向作用于下游效應器。

ASK1是MAP3K的一種亞型，可被ROS、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）和脂多糖等多種應激激活，其中ROS是ASK1最有效的激活劑[15]。硫氧還蛋白(thioredoxin，Trx)是一類控制細胞氧化還原狀態的蛋白質[16]。Trx含有兩個半胱氨酸殘基。氧化狀態下，半胱氨酸中的巰基氧化形成二硫鍵，因此在維持細胞內氧化還原平衡方面起著關鍵作用。Trx為ASK1的結合蛋白，通過與ASK1結合來抑制其活性。ROS氧化Trx使其與ASK1分離，并誘導ASK1的齊聚以及ASK1信號體的形成[17]。ASK1被激活，并誘導ASK1激酶結構域內的關鍵蘇氨酸殘基磷酸化，進而激活p38和JNK等下游靶蛋白[18]。

3.1 JNK與細胞凋亡

JNK在細胞凋亡中起關鍵作用。JNK調控細胞凋亡的方式有兩種：外源性是由細胞表面死亡受體通過相應配體刺激而激活：JNK能夠磷酸化c-Jun和ATF-2進而激活AP-1和Fas/FasL通路，Fas/FasL通過激活半胱氨酸蛋白酶 8（caspase 8）進而激活caspase 3，引起凋亡[19]。內源性激活途徑是由Bcl-2家族蛋白介導的，使細胞色素c從線粒體釋放，活化caspase 9，進而激活caspase 3，最終導致凋亡。JNK磷酸化后還可通過Bax依賴的MOMP誘導凋亡[20]。

3.2 JNK與自噬

JNK通過兩種不同的機制調節自噬：一是通過磷酸化 Bcl-2/Bcl-xL促進 Beclin1-Bcl-2/Bcl-xL的分離。自噬調節因子Beclin 1具有上調自噬的作用，JNK1可使Bcl-2磷酸化，干擾其與自噬調節因子的結合[21]。作為對凋亡刺激的反應，Bcl2L11（也稱為BIM）是一種僅含BH3的蛋白質，由MAPK8/JNK磷酸化，這種磷酸化通過與Beclin 1解離促進自噬，這種解離由DYNLL1（也稱為LC8）促進[22]。另外，JNK可以上調損傷調節自噬因子（DRAM）的表達，DRAM通過產生自溶體來促進自噬體的累積[23]。最近的研究顯示ROS是JNK-AP-1信號轉導的激活因子，在JNK依賴性自噬調節中至關重要[24]。

4 氧化應激與疾病

過量的ROS會引起氧化應激，進而導致細胞和組織的氧化損傷，最終導致某些疾病的發生和發展，如糖尿病、缺血/再灌注損傷及神經退行性疾病等[25]。氧化應激通過誘導β細胞功能障礙和胰島素抵抗而成為糖尿病的罪魁禍首，在糖尿病的發病機制和進展中起主要作用。以氧化應激為靶點的治療策略在糖尿病及其并發癥的治療中具有很大的潛力。晚期糖基化終產物及受體（Advanced glycation end products-Receptor for advanced glycation endproducts，AGERAGE）激活導致氧化應激，該機制參與缺血/再灌注損傷的發病機理。神經退行性疾病如帕金森?。≒arkinson’s disease，PD）中，它主要表現為黑質致密部中的多巴胺能神經元進行性喪失和大腦路易體α-突觸核蛋白聚集體的積聚，可能是氧化應激損傷所致[26]。α-突觸核蛋白的聚集被認為是帕金森病的關鍵因素[27]。因此，許多研究集中于通過降低氧化應激來改善這些疾病。

5 黃酮對JNK干預氧化應激相關疾病的調控

JNK參與糖尿病、缺血/再灌注損傷等多種疾病的發病機制。研究表明，植物黃酮具有干預JNK參與的氧化應激相關疾病的作用（表1）。因此，尋找有效干預JNK的植物黃酮對人類健康有重要意義。

表1 黃酮類化合物在干預JNK致病中的作用及機制Table 1 Role and mechanism of flavonoids in the intervention of JNK

5.1 糖尿病

糖尿病是一組以胰島素抵抗和胰島素分泌不足為特征，可導致多器官功能障礙的疾病。胰島素抵抗、β細胞凋亡都與JNK緊密相關。在胰島素抵抗中，自由基或促炎性細胞因子激活JNK信號轉導通路[28]，促進胰島素底物受體IRS參與胰島素抵抗。在β細胞中，JNK1/2通過ROS刺激磷酸化其下游靶點c-Jun，拮抗胰島素基因的增強子來抑制基因轉錄，使胰島素的合成量減少[29]。此外，通過活化JNK下游的促凋亡因子，釋放細胞色素C誘導凋亡。因此，抑制JNK信號通路可以降低氧化應激對β細胞造成的高血糖毒性[30]。柚皮苷通過抑制JNK信號通路減輕高糖引起的糖尿病腎纖維化[31]。劉穎慧等[32]以HepG2細胞為研究對象，發現桑葉多糖和黃酮均有促進葡萄糖吸收的作用，通過減弱JNK，IRS-1基因和蛋白表達，增強PDX-1基因和蛋白表達，達到減緩胰島素抵抗的目的。二氫楊梅素通過阻斷JNK信號通路來減緩高糖引起的細胞凋亡[33]。綜上，在氧化應激條件下，激活JNK信號通路導致糖尿病及并發癥的發生，而植物黃酮可以通過調控JNK信號通路進行干預疾病。

5.2 缺血/再灌注損傷

在缺血一段時間內，腦和心臟的血管再通后灌注，會造成神經元損傷，稱為缺血再灌注損傷。腦和心臟是在缺血/再灌注損傷中起關鍵作用的兩個器官，其死亡率和發病率均居社會首位。腦缺血/再灌注損傷導致患者內皮細胞以及血腦屏障的損傷[34]。心肌缺血/再灌注與心肌細胞凋亡、心律失常有關[35]。在缺血/再灌注損傷中JNK家族功能紊亂[36]。山奈酚能抑制JNK途徑減弱AGE-RAGE介導的氧化應激來減緩糖尿病大鼠心肌缺血-再灌注損傷[37]。槲皮素能夠顯著提高缺氧/復氧（hypoxia/reoxygenation，H/R）誘導的H9c2心肌細胞的存活率，可能是通過抑制JNK信號通路實現的，從而進一步消除凋亡相關蛋白的激活[38]。研究發現植物黃酮可以抑制H/R后細胞內ROS的產生，這表明植物黃酮具有抗氧化作用。除此之外，白藜蘆醇也有抗氧化的作用。白藜蘆醇通過下調p-JNK的表達，保護神經元免受腦缺血再灌注損傷[39]?；ㄇ嗨赝ㄟ^阻斷JNK和p53信號通路來減輕局灶性腦缺血引起的神經元損傷[40]。以往的實驗數據表明，氧化應激在缺血/再灌注損傷中起重要作用，攝入富含黃酮類的食物可以通過調節JNK途徑減輕氧化應激來保護腦和心臟。

5.3 神經退行性疾病

MAPK在神經細胞的凋亡中起關鍵作用，JNK會被應激優先激活，從而刺激神經元細胞凋亡。植物黃酮具有神經保護作用，可改善認知能力、記憶能力和運動能力，在預防神經退行性疾病如帕金森病和阿爾茨海默病(Alzheimer disease，AD)等具有重要的應用價值。

AD是認知性功能障礙與記憶衰退為特征的神經退行性病變，從神經病理學的角度來看，其特征是細胞外形成β-淀粉樣蛋白（amyloidβ-protein，Aβ）斑塊和神經原纖維纏結以及細胞內高磷酸化tau蛋白的聚集[40]。PD是第二常見的神經退行性疾病。在α-突觸核蛋白高表達的PD小鼠模型中，神經原纖維纏結的限制性分布與JNK磷酸化的水平增加相關[41]。

原花青素可以通過抑制ROS/JNK信號通路使神經元免受1-甲基-4-苯基-1,2,3,6-四氫吡啶處理誘導的損傷[42]。在鎘誘導的神經元細胞中，川陳皮素通過抑制JNK信號通路減輕細胞凋亡[43]。Jian等[44]研究發現，原花青素能夠顯著降低魚藤酮誘導的ROS生成并通過抑制JNK信號通路來減弱SH-SY5Y細胞凋亡。刺槐素通過阻斷JNK的磷酸化減弱6-OHDA誘導的SH-SY5Y細胞凋亡[45]?；ㄇ嗨氐纳窠洷Ｗo特性與氧化應激的改善以及Aβ沉積的減少有關[46]。楊梅黃酮通過抑制MKK4和JNK的磷酸化，保護MES23.5細胞免受神經毒性藥物1-甲基-4-苯基吡啶陽離子（1-methy-4-phenylpyridinium ion，MPP+）引起的損傷[47]。姜黃素通過抑制JNK的表達來改善AD大鼠的學習記憶能力[48]。芹菜素主要通過調節氧化還原失衡、保護線粒體功能、抑制JNK通路等機制發揮抗Aβ毒性作用[49]。綜上，氧化應激與神經退行性疾病密切相關，ROS的過度累積會破壞生物分子，造成神經細胞功能損傷。植物黃酮通過抑制JNK信號通路來增強抗氧化防御系統。

5.4 慢性炎癥性疾病

慢性炎癥是氧化應激的重要表現，過度的氧化應激會促進炎性細胞因子的生成。MAPK信號轉導通路與多種炎癥反應有關。研究表明，JNK與包括敗血癥在內的各種炎癥性疾病的發病機制有關[50]。JNK激活通過轉錄因子c-Jun促進炎癥誘導的細胞功能障礙和多個器官中Caspases的激活。類黃酮抑制LPS誘導的炎性細胞因子產生的幾種機制已被研究，其中阻斷NF-κB和MAPK途徑被認為是兩種主要機制[51]。

漆黃素通過抑制類固醇受體共激活劑介導的JNK信號通路，減緩腎臟炎癥進而抵抗LPS誘導的敗血性急性腎損傷小鼠[52]。高良姜精通過減弱JNK誘導的炎癥而顯著減弱順鉑誘導的腎毒性[53]。Wang等[54]研究發現，在LPS誘導的WI-38肺成纖維細胞中，槲皮素通過使JNK通路失活，保護細胞免受炎性損傷。甘草甙抑制IL-1β誘導的類風濕性關節炎-成纖維樣滑膜細胞中JNK的磷酸化，表明甘草甙可以減輕滑膜炎癥，其分子機制可能與MAPK信號轉導途徑的異常激活有關[55]。原兒茶酸通過調節JNK信號傳導、破骨細胞標記基因的表達，以及破壞c-Fos穩定性來抑制NF-κB配體的受體激活劑（receptor activator of NF-κB ligand，RANKL）誘導的破骨細胞分化和功能，結果表明原兒茶酸可用于治療炎癥性骨疾病[56]。在牛乳腺上皮細胞中，桑色素通過抑制JNK信號通路的激活來保護LPS誘導的炎癥反應[57]。黃芩苷減輕LPS刺激的人肝L-02和THLE2細胞炎癥可能是通過上調TUG1，抑制JNK途徑，顯示出抗炎活性[58]。在上皮細胞中，木犀草素以及其他黃酮類物質，如白楊素和山奈酚，通過抑制JNK阻斷TNF-α觸發ICAM-1的表達[59]。

研究表明，巨噬細胞的異常激活在包括敗血癥在內的許多炎性疾病中起有害作用[60]。槲皮素的糖苷衍生物槲皮素n-3-O-β-D-葡萄糖醛酸通過抑制JNK的磷酸化對LPS刺激的RAW264.7巨噬細胞中具有抗炎作用[61]。大量實驗數據表明，氧化應激在慢性炎癥性疾病中起關鍵作用，植物黃酮通過調控JNK途徑減輕氧化應激發揮保護作用。

5.5 其他

研究表明，氧化應激還會導致白癜風黑色素細胞的變性。芹黃素通過抑制多巴胺誘導的JNK磷酸化，減輕ROS的積累，從而抑制黑素細胞的凋亡，可能具有治療白癜風的潛力[62]。近些年來，食物過敏越來越普遍。食物過敏會導致機體功能紊亂。蕓香柚皮苷通過阻滯JNK磷酸化來干預小鼠過敏性哮喘發作[63]。姜黃素通過抑制JNK而有效抑制凝血酶誘導的人牙齦成纖維細胞中結締組織生長因子（connective tissue growth factor,CTGF/CCN2）的表達，說明姜黃素在牙齦過度生長的發展有抑制作用[64]。

6 結論與展望

JNK調控許多細胞過程，包括細胞周期、分化、凋亡及炎癥反應，在多種疾病的發生過程中起關鍵作用，是調節細胞處于正常狀態與疾病狀態時的關鍵靶點。近些年來，JNK信號通路的研究取得了很大的進展，眾多JNK的上游激酶、下游靶點及調節因子被發現，為進一步研究JNK信號通路奠定了基礎。但是， JNK信號通路受多種因素的調控，呈現出保守性和復雜性，其參與疾病調控的分子機制仍需進一步闡明。

目前主要通過藥物干預JNK從而對疾病達到預防與治療的作用。然而，許多藥物具有副作用，從植物中得到的天然化合物是一種更安全的選擇。植物黃酮能夠有效減緩氧化應激損傷，可以減輕由于自由基產生而導致的JNK磷酸化，進一步預防糖尿病等多種疾病的發生和發展。近年來，植物黃酮調控JNK信號通路的研究越來越多，為預防多種疾病的發生提供了干預策略。然而，由于黃酮分子結構的多樣性，仍需對不同黃酮進行細致、準確的構效表征，以便更好地闡明其保護作用的分子機制。此外，植物黃酮在體內的代謝產物是否具有調控JNK的作用及其與人體內環境平衡相互作用的機制仍需進一步研究。