小麥條銹菌誘導的TaRRP4基因的克隆與表達

任惠文，楊子璠，郭雙元，張艷琴，康振生，張新梅

(西北農林科技大學 a 生命科學學院，b 植物保護學院，c 旱區作物逆境生物學國家重點實驗室，陜西 楊凌 712100)

RNA轉錄與降解密切影響生物體的生長發育，在真核細胞中，mRNA的成熟主要依靠兩種途徑，即5′→3′ RNA降解和3′→5′ RNA降解，這兩種途徑均起始于多聚腺苷-poly(A)尾部的脫腺苷化[1]，隨后5′→3′ RNA降解由5′→3′ RNA外切核糖核酸酶家族Xrn完成[2-3]，3′→5′ RNA降解由多亞基3′→5′外切核糖核酸酶復合物——RNA外切體催化[4-5]。真核生物和古生菌的外切體均由六聚體核心和三聚體帽子結構組成[4,6]。外切體在人類、酵母和古細菌中，主要參與RNA的加工和降解過程，包括正常細胞質mRNA周轉[7]、mRNA質量控制[8]和小非編碼RNA的加工[9]。真核RNA外切體由9～11個不同蛋白組成，部分蛋白序列與細菌的3′→5′外切酶相似。其中RRP4亞基含有類核糖體蛋白S1 RNA結合結構域(S1)和K同源(K Homology，KH)RNA結合結構域，RRP4協同其他2個RNA結合亞基RRP40和CSL4形成外切體頂端帽子結構，不僅穩定了外切體結構，而且增加了其對多聚腺苷酸(polyA)底物的特異性結合及催化效率[6]。

RNA加工過程中防御基因的調節是植物免疫的一個重要方面，RNA結合蛋白含有RNA結合結構域(RNA binding domain,RBD)，通過與RNA互作形成復合體，直接或間接參與RNA加工過程[10]。KH結構域是最常見最豐富的RNA結合結構域，在人源核不均一核糖核蛋白K(hnRNPK)中最先發現[11]，其廣泛存在于古細菌、細菌和真核生物中[12]，大約包含70個氨基酸，通過識別RNA或ssDNA參與多種生物學過程，如選擇性剪接、控制翻譯等[13]。含有3個KH結構域的馬鈴薯RNA結合蛋白StKRBP1能與晚疫病菌(Phytophthorainfestans)效應子Pi04089互作，過表達StKRBP1能夠促進晚疫病菌侵染馬鈴薯葉片；當StKRBP1 KH結構域上的RNA識別位點GXXG突變為GDDG時，StKRBP1會失去識別和結合RNA的能力，影響植物的可變剪接，進而抑制晚疫病菌對馬鈴薯葉片的侵染[14]。作為免疫負調控因子，馬鈴薯RNA結合蛋白StKH17同樣能促進晚疫病菌侵染[15]。U-box類E3泛素連接酶StPUB17可以正調控馬鈴薯對晚疫病菌的抗性[16]。Mclellan等[15]通過酵母雙雜交和免疫共沉淀發現，StPUB17與StKH17相互作用，有可能將StKH17降解，從而提高馬鈴薯葉片對晚疫病菌的抗性。上述研究表明，含KH結構域的RNA結合蛋白在植物與病原菌的互作過程中發揮著重要作用。

小麥(TriticumaestivumL.)作為重要的糧食作物，養育了全球近40%的人口，而由條形柄銹菌小麥?；?Pucciniastriiformisf. sp.tritici，Pst)引起的小麥條銹病嚴重影響小麥生產。因此，解析小麥與小麥條銹菌互作的分子機理，對小麥抗病品種的選育與合理利用至關重要。本研究以TaRRP4為候選目的基因，采用qRT-PCR技術分析該基因在小麥品種水源11與小麥條銹菌生理小種CYR23和CYR31互作及非生物脅迫、外源植物激素處理下的表達特征，以期為小麥與小麥條銹菌互作中該基因功能的驗證以及小麥抗病育種提供參考。

1 材料與方法

1.1 供試材料

供試小麥品種為水源11(Suwon 11)，供試小麥條銹菌菌種為條中23號(CYR23)和條中31號(CYR31)，均由西北農林科技大學植物免疫團隊提供。其中CYR23與水源11構成非親和體系，CYR31與水源11構成親和體系。

1.2 小麥RNA提取與cDNA合成

使用總RNA提取試劑盒(天根，北京)提取CYR23和CYR31誘導處理的小麥葉片總RNA。使用反轉錄試劑盒(Thermo Fermentas，美國)合成cDNA第一條鏈，引物使用Oligo d(T)18。

1.3 TaRRP4基因的克隆

在小麥與小麥條銹菌CYR23和CYR31構建的非親和與親和互作體系中，篩選出小麥TaRRP4基因的EST序列，結合NCBI(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)等公共數據庫，得到目標基因序列。利用Primer Premier 5.0設計擴增引物TaRRP4-ORF-F(5′-ATGAGAGACCTCCACCTCCC-3′)和TaRRP4-ORF-R(5′-CCTCTTCTTTCCCAGGAGGT-3′)，以1.2節反轉錄得到的cDNA為模板進行PCR擴增。PCR反應體系(40 μL)為：cDNA(200 ng/μL) 2 μL,2×Prime STAR Max DNA Polyme-rase(TaKaRa，大連)20 μL，TaRRP4-ORF-F/TaRRP4-ORF-R(10 μmol/L)各1 μL，ddH2O 16 μL。PCR反應程序為：98 ℃預變性5 min；98 ℃變性30 s，58 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，37個循環；72 ℃延伸10 min，16 ℃保存。目標條帶純化后進行雙向測序。引物合成和測序均由西安擎科澤西生物科技有限責任公司完成。

1.4 TaRRP4的生物信息學分析

用ProtParam(https://web.expasy.org/protparam/)對TaRRP4的理化性質進行在線分析；用NCBI(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/cdd.shtml)分析TaRRP4的保守結構域；用Phobius(http://phobius.sbc.su.se/)分析TaRRP4的跨膜結構和信號肽；在NCBI blastp搜索TaRRP4的同源序列，然后使用MEGA 7軟件構建TaRRP4的系統進化樹，分析其親緣關系；用DNAMAN6.0.40軟件分析TaRRP4同源序列之間的保守性。

1.5 TaRRP4表達特征的分析

1.5.1 小麥苗培養 挑選600粒小麥種子，均勻撒播于裝有育苗基質(莘縣魯源育苗基質有限公司)的花盆中，每盆12粒，置于16 ℃光照培養箱中培養(光/暗周期為16 h/8 h，光照強度20 000 lx)。

1.5.2 小麥條銹菌誘導處理 將150株生長至一葉一心的小麥等分為3組，參照康振生等[17]的方法給第1組和第2組分別接種CYR31和CYR23，第3組作為對照，只涂抹滅菌水。接種后，將小麥立即置于16 ℃恒溫培養箱中黑暗保濕，24 h后正常培養。分別采集接種0，12，24，48，72，96和120 h的小麥葉片，在液氮中速凍，存儲于-80 ℃冰箱，用于小麥條銹菌誘導下TaRRP4基因的表達特征分析。

1.5.3 非生物脅迫處理 將200株生長至一葉一心的小麥等分為5組，第1組和第2組分別使用200 mmol/L NaCl溶液和0.2 g/mL PEG6000溶液澆灌小麥，進行高鹽和干旱脅迫處理(溶劑為霍格蘭營養液)；第3組將小麥置于4 ℃培養，作為低溫處理；第4組使用消毒的刀片水平輕柔劃割小麥葉片，進行機械損傷處理；第5組為對照組，使用霍格蘭營養液處理[18]。分別采集處理后0，2，6，12，24和48 h的小麥葉片,在液氮中速凍，存儲于-80 ℃冰箱，用于非生物脅迫下TaRRP4基因的表達特征分析。

1.5.4 外源植物激素處理 將200株生長至一葉一心的小麥等分為5組，前4組分別使用100 mmol/L脫落酸(abscisic acid，ABA)、100 mmol/L茉莉酸甲酯(methyl jasmonate，MeJA)、100 mmol/L乙烯利(ethrel，ETH)和2 mmol/L水楊酸(salicylic acid，SA)等體積均勻噴施于小麥及保濕桶四壁，16 ℃黑暗培養，溶劑均為體積分數0.1%乙醇；第5組作為對照組，使用體積分數0.1%的乙醇和吐溫20混合液進行相同處理[18]。分別采集處理后0，2，6，12和24 h的小麥葉片在液氮中速凍，存儲于-80 ℃冰箱，用于外源植物激素處理下TaRRP4基因的表達特征分析。

1.5.5 小麥組織采集 分別采集一葉一心小麥的第1葉、莖稈及根須在液氮中速凍，存儲于-80 ℃冰箱，用于TaRRP4基因組織特異性表達特征分析，將小麥第1葉中TaRRP4基因的表達量作為對照。

1.5.6TaRRP4基因相對表達量測定 根據TaRRP4序列特點設計保守的定量引物TaRRP4-qF/TaRRP4-qR，選擇TaEF-1α(GenBank：Q030-33)作為內參基因(表1)。使用qRT-PCR檢測試劑盒(諾唯贊，南京)，以1.2節反轉錄得到的cDNA為模板，用Bio-Rad CFX96定量儀(伯樂，美國)進行qRT-PCR。反應體系及程序參照qRT-PCR檢測試劑盒說明書。試驗進行3次生物學重復，用2-△△Ct法[18]對不同處理下小麥葉片和小麥不同組織的TaRRP4基因相對表達量進行分析。其中，TaRRP4基因的相對表達量是指不同處理下，各個時間點試驗組與對照組中TaRRP4表達量的比值或者不同組織中TaRRP4表達量與對照(葉片)中TaRRP4表達量的比值。

表1 用于TaRRP4基因qRT-PCR的引物信息Table 1 Primer information for TaRRP4 gene qRT-PCR

2 結果與分析

2.1 TaRRP4基因的克隆與生物信息學分析

2.2.1TaRRP4基因的克隆及理化性質 利用引物TaRRP4-ORF-F/TaRRP4-ORF-R擴增得到小麥TaRRP4基因序列，其全長951 bp(圖1)，編碼316個氨基酸。使用ProtParam對TaRRP4的理化性質進行分析表明，TaRRP4蛋白的分子質量為35.6 ku，等電點為6.6。

M.DL5000 DNA Marker；A.TaRRP4 PCR 擴增產物M.DL5000 DNA Marker；A.Amplification product of TaRRP4 gene圖1 TaRRP4基因的擴增Fig.1 TaRRP4 amplification

2.2.2 TaRRP4蛋白結構的預測 使用NCBI對TaRRP4保守結構域進行預測，結果(圖2)顯示，TaRRP4屬于外切體亞基RRP4家族，包含S1(第91-162位氨基酸)和KH(第180-305位氨基酸)2個RNA結合結構域及1個保守的RNA識別位點GXXG(第210-213位氨基酸)，S1和KH結構域由保守的KYGKL連接。此外，使用Phobius對TaRRP4蛋白進行跨膜結構和信號肽分析，結果表明，該蛋白無信號肽，在第250-275氨基酸處可能有1個跨膜結構，但概率極低。

圖2 TaRRP4保守結構域分析Fig.2 Conserved domain analysis of TaRRP4

2.2.3 TaRRP4及其同源蛋白序列分析 在NCBI blastp搜索TaRRP4的同源蛋白序列并使用MEGA 7進行聚類分析，結果(圖3)顯示，小麥TaRRP4與節節麥(Aegilopstauschii)AtRRP4、大麥(Hordeumvulgare)HvRRP4、二穗短柄草(Brachypodiumdistachyon)BdRRP4同屬一個大分支，其中與AtRRP4的親緣關系最近，與HvRRP4、BdRRP4的親緣關系次之。用DNAMAN6.0.40進行多序列分析發現，TaRRP4與其同源蛋白序列高度相似，均含有保守的S1和KH結構域。其中TaRRP4與擬南芥(Arabidopsisthaliana)AtRRP4p的氨基酸序列相似性為62.96%。

括號中為各物種基因登錄號Genetic entry number of each species is shown inside brackets圖3 TaRRP4同源蛋白的聚類分析Fig.3 Clustering analysis of TaRRP4 homologous proteins

2.3 TaRRP4在轉錄水平上的表達特征分析

2.3.1 小麥條銹菌誘導下TaRRP4的表達特征 利用qRT-PCR分析小麥條銹菌誘導下TaRRP4的表達特征，結果(圖4)顯示，與接種0 h相比，TaRRP4在接種CYR31后24，48和72 h表達極顯著上調；之后隨著接種時間的延長，其表達量逐漸降低。與接種0 h相比，TaRRP4在接種CYR23后48 h表達顯著上調，但上調倍數較??；接種后其他時間點均無顯著上調趨勢。

*和**分別表示與處理0 h相比，TaRRP4在各個時間點的相對表達量差異顯著(P<0.05)和極顯著(P<0.01)。下同* and ** show significant (P<0.05) and extremely significant (P<0.01) differences in TaRRP4 expression among time points compared with 0 h treatment,respectively.The same below圖4 水源11接種小麥條銹菌后TaRRP4的表達特征Fig.4 Expression patterns of TaRRP4 in wheat Suwon 11 inoculated with Puccinia striiformis f. sp. tritici

2.3.2 非生物脅迫處理下TaRRP4的表達特征 對小麥進行高鹽、干旱、低溫和機械損傷處理，分析TaRRP4響應非生物脅迫時的表達特征。由圖5可知，高鹽脅迫下，TaRRP4的表達量在處理12 h極顯著上調，約為0 h表達量的7倍；在處理48 h顯著上調，約為0 h表達量的3倍。TaRRP4的表達量在干旱脅迫6 h上調表達最為顯著，為干旱處理0 h表達量的29倍。與低溫處理0 h相比，TaRRP4表達量在處理2 h開始極顯著或顯著上調，且維持時間較長，直至48 h表達量才降低。在機械損傷處理后，各時段TaRRP4的表達量無明顯變化。

圖5 非生物脅迫處理下TaRRP4的表達特征分析Fig.5 Expression analysis of TaRRP4 induced by abiotic stresses treatments

2.3.3 外源植物激素處理下TaRRP4的表達特征 使用ABA、MeJA、ETH和SA 4種外源植物激素處理小麥，分析TaRRP4響應激素信號的表達特征。由圖6可知，與ABA處理0 h相比，ABA處理小麥2和6 h，TaRRP4表達量下調，但差異不顯著；處理小麥12和24 h，TaRRP4的表達量極顯著下調。MeJA處理各時段對小麥中TaRRP4表達量的影響均不明顯。與ETH處理0 h相比，ETH處理小麥2 h后，TaRRP4的表達量呈極顯著上調趨勢，且在12 h達到最高，是對照表達量的10倍，處理24 h上調不顯著。與SA處理0 h相比，SA處理小麥2～12 h，TaRRP4表達量呈極顯著上調趨勢，但上調倍數較低；處理24 h上調不顯著。

圖6 外源植物激素處理下TaRRP4的表達特征Fig.6 Expression analysis of TaRRP4 induced by exogenous plant hormone treatments

2.3.4TaRRP4的組織特異性表達 對TaRRP4在小麥不同組織中的表達量進行定量分析，結果(圖7)表明，TaRRP4在小麥根、莖、葉中均有所表達，且在葉片中的表達量顯著高于根和莖中。

3 討 論

外切體是一類參與生物體內RNA加工或降解的3′→5′核糖核酸外切酶，在古細菌、酵母、動物、植物中均有發現[4,6,19-20]。而RRP4作為真核生物外切體亞基之一,可以協同其他2個RNA結合蛋白RRP40和CSL4穩定外切體結構，同時結合并幫助目的RNA進入外切體酶活性中心[6,21]。植物RRP4最早發現于含有AtRRP41p的復合體中，它與酵母RRP4p同源，包含S1和KH結構域，對植物生長發育十分重要[22]。在AtRRP4p缺失突變體中，擬南芥表現出不同發育階段生長停滯現象，突變體產生的大多數種子含有雙細胞胚和非細胞胚乳，在胚胎早期就已經停止發育，嚴重損害了合子的發育過程[23]。

**表示與葉片相比，不同組織中TaRRP4相對表達量 差異極顯著(P<0.01)** indicates extremely significant differences (P<0.01) in relative expression of TaRRP4 between leaves and other tissues圖7 TaRRP4的組織特異性表達分析Fig.7 Expression levels of TaRRP4 in leaves,roots and stems of wheat Suwon 11

本研究在小麥與小麥條銹菌互作體系中克隆到一個外切體亞基RRP4家族的基因TaRRP4，其編碼的蛋白包含S1和KH 2個RNA結合結構域，與擬南芥AtRRP4p蛋白的氨基酸相似度達62.96%，推測TaRRP4對小麥的生長發育也十分重要。采用qRT-PCR對TaRRP4在小麥根、莖、葉中的表達量進行分析，發現TaRRP4在小麥組織中均有表達，但在葉片中表達量最高，暗示其主要在葉片中發揮作用。

RRP4具有RNA結合與外酶切活性[21-22]，極有可能是響應植物免疫的重要組成成分。本研究在轉錄水平上，通過分析TaRRP4在小麥與小麥條銹菌互作中的表達譜，初步證實TaRRP4可能參與小麥對小麥條銹菌的防御反應。外源激素SA、ETH和ABA處理下，TaRRP4應答強烈，且早于對小麥條銹菌的應答，說明其可能通過SA、ETH和ABA信號途徑的“交流”，介導小麥對小麥條銹菌的防御反應。其中，ETH誘導TaRRP4顯著上調表達，推測TaRRP4是通過響應ETH信號途徑，在小麥感條銹病過程中發揮正調節作用，這與ETH是番茄對鐮刀菌感病性的正調節因子[24]相一致。

小麥條銹菌對TaRRP4的誘導主要發生在接種后24和48 h，前期研究表明，接種小麥條銹菌24 h，吸器大量形成，抗病基因表達，過敏性壞死明顯；接種小麥條銹菌48 h，條銹菌生長發育在親和與非親體系間的差異開始明顯[25]。因此，從小麥接種小麥條銹菌后TaRRP4的表達模式可以看出，TaRRP4在小麥對小麥條銹菌的防御反應中發揮作用。真核RNA外切體亞基RRP4主要結合RNA，通過RRP4外切體-底物互作機制使有效的RNA降解[21]。在小麥與小麥條銹菌互作過程中，TaRRP4蛋白結合哪個RNA序列，如何進行基因表達調控，尚有待深入研究。到目前為止，關于其他物種TaRRP4受高鹽、干旱、低溫和機械損傷的誘導情況鮮有報道，但是依據本研究可以推斷，TaRRP4在植物抗逆過程中發揮重要作用，且作用范圍廣泛。

4 結 論

本研究克隆了小麥條銹菌誘導的小麥外切體亞基TaRRP4基因，該基因長951 bp，編碼316個氨基酸。在小麥與小麥條銹菌互作中，TaRRP4基因在親和體系中的表達量顯著高于非親和體系；外源激素SA、ETH和ABA參與并協同調控TaRRP4的表達；干旱、高鹽和低溫脅迫均誘導TaRRP4上調表達，推測其可能參與小麥的抗逆應答。