氨基酸衍生物的非水毛細管電泳分離研究

謝銀鳳，石瑞卿，張 輝

(1 山東省濰坊生態環境監測中心，山東 濰坊 261041;2 北京華企動力信息技術有限公司，北京 100089)

氨基酸是構成蛋白質的基本單元，在生命有機體新陳代謝的過程中起著關鍵作用，研究其分離分析在食品科學、生物化學和臨床醫學等領域有著十分重要的意義[1-3]。大多數氨基酸本身沒有天然的紫外或熒光吸收，為拓展其檢測的技術手段，提高其分離選擇性和分析靈敏度，經常需要對氨基酸進行柱前衍生。目前，氨基酸的分離分析研究通常采用氣相色譜法和高效液相色譜法進行[4-6]。

非水毛細管電泳 (NACE)，作為毛細管電泳一個相對較新的分支，近年來備受分析工作者的青睞[11-14]。與水介質毛細管電泳相比，非水毛細管電泳有以下優越性：允許使用大孔徑的毛細管柱進行分離分析；體系較低的電流允許使用高電壓以縮短分離時間；增大疏水物質溶解度，減少毛細管壁對其的吸附，有效降低焦耳熱。董玉明等以4-氯-7-硝基-2,1,3-苯并氧雜惡二唑 (NBD-Cl) 為柱前衍生試劑，采用激光誘導熒光檢測器實現了丙氨酸、苯丙氨酸、異亮氨酸和纈氨酸四種氨基酸的非水毛細管電泳分離[7]。本文采用2-[2-(7H-二苯并[a,g]咔唑)-乙氧基]-乙基氯甲酸酯 (DBCEC-Cl)[8]作為氨基酸衍生化試劑，首次實現了15種氨基酸衍生物的非水毛細管電泳分離，結果滿意。

1 實 驗

1.1 儀器與試劑

HP-3D毛細管電泳儀，美國 Agilent公司(毛細管總長58.5 cm，有效長度50 cm，內徑50 μm)。

氨基酸，美國 Sigma公司；甲酰胺(分析純)，天津市廣成化學試劑有限公司；乙腈(色譜純)，山東禹王集團化工廠；水為 Milli-Q 超純水；其它試劑皆為為分析純。

1.2 實驗方法

1.2.1 標準溶液的配制

DBCEC-Cl的配制：精確稱取20.9 mg DBCEC-Cl，用色譜純乙睛溶解后定容于10 mL容量瓶，配成5×10-3mol/L 溶液。

氨基酸標準溶液的配制：精確稱取一定量的氨基酸標準品，用 6 mol/L鹽酸溶解，然后 6 mol/L 氫氧化鈉溶液調節至pH為中性或弱堿性，再用 pH為9.0的硼酸緩沖溶液定容到所需體積，即得到1.0×10-2mol/L 的單一氨基酸標準溶液，各種低濃度氨基酸的標準溶液用上述硼酸緩沖液稀釋配制。標準溶液置于4 ℃冰箱內保存。

1.2.2 氨基酸的衍生化

依次取50 μL pH 為9.0的硼酸緩沖液 (0.1 mol/L)， 20 μL混合氨基酸標準溶液 (5×10-3mol/L)，120 μL衍生試劑(5×10-3mol /L)于2 mL安瓿瓶內，振蕩混合均勻，密封后于40 ℃水浴中衍生20 min，然后用20 μL 50 %的乙酸水溶液調節pH為弱酸性，放至室溫，進樣分析。衍生化反應如圖1所示。

圖1 2-[2-(7H-二苯并[a, g]咔唑)-乙氧基]-乙基氯甲酸酯(DBCEC-Cl)與氨基酸衍生化反應

1.3 實驗條件

不同濃度的乙酸、乙酸銨緩沖溶液由甲酰胺為溶劑配制而成。在不同電壓和溫度下，采用290 nm二極管陣列檢測，分別對氨基酸衍生物進行分離。實驗前對緩沖溶液進行超聲脫氣處理。每次進樣前，按順序用0.1 mol/L NaOH溶液(5 min)、超純水(5 min)，緩沖溶液(3 min)沖洗毛細管柱。更換緩沖液時，需分別用上述三種溶液沖洗10 min。

2 結果與討論

2.1 電解質的選擇

在有機溶劑中加入電解質使其具有導電性是實現非水毛細管電泳分離的必要條件。常用的電解質有乙酸銨、乙酸鎂、三羥甲基甲酰胺、甲酸、檸檬酸、甲磺酸等，其中乙酸銨比較常用，一般還需加入乙酸共同調節介質的酸堿緩沖性能。緩沖溶液濃度的大小可以明顯影響電滲流、焦耳熱、離子強度、電解質的粘度和毛細管壁對分析物的吸附，有效改善分離效果。因此，本實驗選用常用的乙酸銨-乙酸體系為電解質，分別對乙酸銨、乙酸濃度進行了優化。

2.1.1 乙酸銨濃度對分離的影響

在固定其它實驗條件下，以鳥氨酸(Orn)、亮氨酸 (Leu)、異亮氨酸(IIe)、脯氨酸(Pro)、羥脯氨酸(Pro-OH)為代表，考察了乙酸銨緩沖體系在60～80 mmol/L濃度范圍內對四種氨基酸衍生物遷移時間、分離度和理論塔板數的影響(見圖2a，2b，2c)?？梢钥闯?，遷移時間隨著乙酸銨濃度的增加而延長。乙酸銨濃度為70 mmol/L時，雖然遷移時間相對60 mmol/L和65 mmol/L較長，但理論塔板數較高，分離度也較為理想，故選擇70 mmol/L作為乙酸銨最佳分離濃度。

圖2 乙酸銨濃度對遷移時間(a)、分離度(b)和理論塔板數(c)的影響

2.1.2 乙酸濃度對分離的影響

在固定乙酸銨濃度的前提下，調節乙酸的濃度可顯著改變分析物粒子間的作用力，改善分離。在固定其他實驗條件的情況下，以鳥氨酸(Orn)、亮氨酸 (Leu)、異亮氨酸 (IIe)、脯氨酸(Pro)、羥脯氨酸(Pro-OH)為代表考察了乙酸濃度在0.55～0.75 mol/L范圍內對遷移時間、分離度和理論塔板數的影響(見圖3a，3b，3c)。由圖3可知，遷移時間隨乙酸濃度的增加呈現先減小后增大的趨勢，在0.65 mol/L時遷移時間最短。與此同時，理論塔板數和分離度也較為理想，故選擇0.65 mol/L為乙酸最優分析條件。

圖3 乙酸濃度對遷移時間(a)、分離度(b)和理論塔板數(c)的影響

2.2 電壓對分離的影響

分離電壓在毛細管電泳分離中有著重要作用，可直接影響電滲流大小、焦耳熱、分離度和遷移時間等。與水介質毛細管電泳相比，非水毛細管電泳的電流和焦耳熱相對較小，從而允許使用較高的分離電壓。當然，分離電壓過高也會導致焦耳熱的影響加劇，柱效下降。實驗比較了24 kV、27 kV和30 kV電壓下對衍生物的分離影響(見圖4)。結果顯示，遷移時間隨電壓的升高而明顯縮短，部分衍生物分離度有所增加，基線穩定性和焦耳熱未見明顯變化，因此選定30 kV為最優實驗電壓。

圖4 電壓對氨基酸衍生物分離的影響

2.3 溫度對分離的影響

毛細管電泳分離過程中保持柱溫恒定，可在一定程度上散逸分離過程中產生的焦耳熱和改善分離。在較高溫度下操作，可縮短分離時間，亦可克服某些難溶性分析物的不足。但柱溫過高，不僅會導致有機溶劑的揮發，還會導致較大的焦耳熱，使柱效降低，從而導致分離效率降低。實驗溫度考察范圍為 12～21 ℃，發現在18 ℃時基線較為平穩，重現性好，最終選定18 ℃為毛細管柱溫度。

2.4 氨基酸衍生物的分離

按上述優化條件，50 Mbar壓力進樣，進樣時間8 s，以甲酰胺作溶劑，乙酸銨濃度70 mmol/L，乙酸濃度0.65 mol/L，分離電壓30 kV，柱溫18 ℃，檢測波長290 nm，對15種DBCEC-Cl氨基酸衍生物進行了分離，結果見圖5和表1。

圖5 氨基酸衍生物的非水毛細管電泳分離圖

表1 氨基酸衍生物最佳的分離參數

3 結 論

用實驗室自行合成的2-[2-(7H-二苯并[a,g]咔唑)-乙氧基]-乙基氯甲酸酯(DBCEC-Cl)作為氨基酸衍生試劑，以甲酰胺為溶劑，乙酸銨-乙酸為緩沖體系，二極管陣列進行檢測，獲得了氨基酸衍生物的非水毛細管電泳基線分離，建立了氨基酸在毛細管電泳中分離分析的一種新方法。