米邦塔仙人掌兩種化學成分鑒定及定量分析

金唯一，李壯壯，吳嘉朔，張方晴，康維鈞，石 鉞*

（1. 中國醫學科學院 北京協和醫學院 藥用植物研究所，北京 100193；2. 河北醫科大學 公共衛生學院，河北 石家莊 050017）

米邦塔仙人掌（Opuntia milpa alta）原產于墨西哥，1997年引入我國，現已在我國廣泛種植并形成一定規模[1]，2012年國家將其批準為普通食品。米邦塔仙人掌葉片含多糖[2-3]、蛋白質、氨基酸[4]、有機酸、礦物質及少量黃酮和多酚類成分[5]，具有一定的抗氧化、免疫調節、降糖、神經保護等活性[6-7]。此外有文獻報道在米邦塔仙人掌中分離鑒定了20余種化合物，多為有機酸類化合物[8-9]，但目前沒有相關成分定量分析的報道。本研究從米邦塔仙人掌中分離鑒定了兩種化合物，分別為5-羥甲基-2-呋喃甲醛和番石榴酸（piscidic acid），其中番石榴酸首次在米邦塔仙人掌中分離得到；并應用高效液相色譜（HPLC）建立了同時檢測兩種化合物的定量方法，以期為米邦塔仙人掌的開發和利用提供參考。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Kromasil 100A C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）色譜柱（北京迪馬科技有限公司）；Agilent 1100高效液相色譜儀（安捷倫科技有限公司）；Bruker Avance III 600 MHz核磁共振波譜儀[布魯克（北京）科技有限公司]；Ultimate 3000超高效液相色譜儀串聯Thermo Q-ExactiveTMPlus OrbitrapTM高分辨質譜儀（美國賽默飛世爾科技公司）；UPLC HSS T3 C18（2.1 mm×10 mm，1.8 μm）色譜柱（Waters中國有限公司）。

1.2 試藥

新鮮米邦塔仙人掌（Opuntia milpa alta），米邦塔仙人掌果購自上海金欣仙人掌專業種植基地；乙腈（色譜純，Honeywell Burdick & Jackson公司）；甲酸[色譜純，賽默飛世爾科技（中國）有限公司]；5-羥甲基-2-呋喃甲醛，番石榴酸（自制）。

2 方法與結果

2.1 樣品提取與分離

取新鮮米邦塔仙人掌葉片和果實，手工去皮，將葉肉、葉片表皮、果皮分別于60 ℃烘干，打粉，密封后保存在干燥器中，果肉榨汁，經8層紗布過濾后，12 000 r/min離心10 min，除去殘渣，果汁保存在-80 ℃ 冰箱中。稱取葉片表皮、葉肉、果皮干燥粉各100 g，按料液比1:10，分別用水、70 %乙醇、50 %乙醇加熱回流提取2次，每次1 h，合并提取液，過濾除去殘渣后，減壓回收溶劑，分別得到400，500，400 mg/ml樣品儲備液。取50 ml葉肉提取液，經制備液相色譜，以乙腈-0.1 %甲酸-水進行梯度洗脫，得到化合物1（67.1 mg）和2（73.6 mg）。

2.2 結構鑒定

化合物1：黃色針晶，C6H6O3，ESI-MSm/z：127.04 [M+H]+。1H NMR（600 MHz，CD3OD）δ：9.53（1H，s，CHO），7.38（1H，d，J=3.6 Hz），6.58（1H，d，J=3.6 Hz），4.57（2H，s，H-α）。13C NMR（150 MHz，CD3OD）δ：179.4（CHO），163.2（C-5），153.9（C-2），124.8（C-3），110.9（C-4），57.6（C-α）。結合以上光譜數據和文獻報道[8]，推斷該化合物為5-羥甲基-2-呋喃甲醛。

化合物2：類黃色固體粉末，C11H12O7，HESIMSm/z：255.05 [M-H]-。1H NMR（600 MHz，CD3OD）δ：4.50（1H，S，H-2），2.99（1H，d，J=13.8 Hz，H-4α），3.14（1H，d，J=13.8 Hz，H-4β），7.08（2H，d，J=8.4 Hz，H-2’，6’），6.66（2H，d，J=8.4 Hz，H-3’，5’）。13C NMR（150 MHz，CD3OD）δ：173.3（C-1），74.1（C-2），80.1（C-3），40.6（C-4），174.6（C-5），126.6（C-1’），131.1（C-2’，6’），114.3（C-3’，5’），155.8（C-3’）。結合以上光譜數據和文獻報道[10]，推斷該化合物為番石榴酸。

圖1 5-羥甲基-2-呋喃甲醛和番石榴酸結構

2.3 對照品溶液的制備

精密稱取5-羥甲基-2-呋喃甲醛和番石榴酸，用50 %甲醇溶解，配制濃度為10 mg/ml的儲備液，備用。

2.4 供試品溶液的制備

取2.1項下的樣品儲備液，用純凈水稀釋至適宜濃度后，12 000 r/min離心5 min，取上清，果汁離心后，取上清，經HPLC分析。

2.5 色譜條件

流動相：流動相A：乙腈，流動相B：0.1 %甲酸水溶液；Kromasil 100A C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）色譜柱；進樣體積10 μl；柱溫：30 ℃；梯度洗脫條件為0～25 min，98 %B；25～25.1 min，98 %～95 %B；25.1～35 min，95 %～90 %B；35～35.1 min，90 %～50 %B；35.1～45 min，50 %B；45～50 min，50 %～10 %B；50～60 min，10 %B。流速：1 ml/min；檢測波長：275 nm。

2.6 方法學考察

2.6.1 專屬性 將適宜濃度的對照樣品溶液和供試樣品溶液分別注入液相色譜儀，按2.5項下色譜條件測定。對照品溶液和供試樣品溶液色譜圖分別見圖2。供試品溶液的色譜圖與對照品溶液的色譜圖有相同保留時間的色譜峰，且其他成分無干擾。

圖2 專屬性考察結果

2.6.2 線性關系、檢測限和定量限 取2.3項下對照品溶液，按2.5項下色譜條件進樣測定，進行線性回歸，計算相關系數。檢測限和定量限分別在信噪比為3和10時測定，結果見表1。結果表明，5-羥甲基-2-呋喃甲醛在5～150 μg/ml范圍內線性范圍良好，R2=0.9992，檢測限和定量限分別為0.64 μg/ml和2.31 μg/ml；番石榴酸在10～1200 μg/ml范圍內線性關系良好，相關系數R2=0.9997，檢測限和定量限分別為1.51 μg/ml和5.05 μg/ml。

表1 米邦塔仙人掌中兩種成分的線性方程、相關系數、檢測限和定量限（n=3）

2.6.3 精密度試驗 取60 μg/ml對照品溶液，按2.5項下色譜條件重復進樣6次，測定兩種化合物的峰面積，以峰面積的相對標準偏差（RSD）評價精密度，結果顯示5-羥甲基-2-呋喃甲醛和番石榴酸的峰面積RSD分別為0.90 %和0.45 %，均小于3 %，表明該方法精密度良好。

2.6.4 重復性試驗 按2.4項下方法，各部位分別平行制備6份供試品溶液，按2.5項下色譜條件測定，以各峰面積RSD評價重復性，結果顯示5-羥甲基-2-呋喃甲醛和番石榴酸峰面積RSD分別為2.10 %和1.52 %，均小于3 %，表明該方法重復性良好。

2.6.5 穩定性試驗 取重復性樣品1份，分別于0，6，12，24，48，72 h進樣分析，測定各峰面積RSD值，結果顯示5-羥甲基-2-呋喃甲醛和番石榴酸的峰面積RSD分別為0.26 %和0.17 %，均小于3 %，表明待測樣品穩定性良好。

2.6.6 加樣回收試驗 分別取已知含量的樣品，分別加入高、中、低3個濃度水平的對照品溶液，每個水平平行制備3份，按2.5項下色譜條件進樣測定，計算樣品加標回收率，結果見表2、表3，結果顯示各樣品的加標回收率在90 %～110 %之間，RSD均小于3 %，表明該方法準確度較好。

表2 5-羥甲基-2-呋喃甲醛加樣回收試驗結果（n=3）

表3 番石榴酸加樣回收試驗結果（n=3）

2.7 樣品分析

將2.4項下適宜濃度的樣品，按2.5項下色譜條件，測定各樣品中5-羥甲基-2-呋喃甲醛和番石榴酸的含量，平行測定3份樣品，結果見表4。

表4 米邦塔仙人掌各部位5-羥甲基-2-呋喃甲醛和番石榴酸的含量（n=3）

3 討論與結論

本研究對提取溶劑水、30 %乙醇、50 %乙醇、70 %乙醇和100 %乙醇的提取效果進行考察，結果葉肉粗提物、葉片表皮粗提物和果皮粗提物分別由70 %乙醇、水、50 %乙醇提取，樣品活性較好且待測成分含量較多。對超聲提取和加熱回流提取兩種方法進行考察，兩種方法提取率相差不大，但考慮到需大量提取樣品，因此選擇加熱回流提取。

分別對甲醇-水、乙腈-0.1 %甲酸水、甲醇-0.1 %甲酸水3個系統流動相進行考察，結果發現采用乙腈-0.1 %甲酸水作為流動相時，各峰分離度較好，基線平穩，因此采用乙腈-0.1 %甲酸水作為系統流動相。對兩種定量成分對照品溶液分別進行UV全波長（190～400 nm）掃描，發現5-羥甲基-2-呋喃甲醛在280 nm處有最大吸收，番石榴酸在220 nm和275 nm處有兩個吸收峰，其在220 nm處有最大吸收，但考慮到本實驗所測樣品番石榴酸含量高于5-羥甲基-2-呋喃甲醛，且在275 nm處各峰的分離度較好，基線平穩，因此本實驗選擇275 nm作為檢測波長。

綜上，本實驗通過半制備液相色譜儀，分離純化了兩種化合物，分別為5-羥甲基-2-呋喃甲醛和番石榴酸，番石榴酸首次在米邦塔仙人掌中被鑒定。本研究采用HPLC同時測定米邦塔仙人掌中5-羥甲基-2-呋喃甲醛和番石榴酸含量，方法穩定可靠，方法學考察結果表明精密度、穩定性、重復性和準確度均符合要求，能準確測定米邦塔仙人掌中5-羥甲基-2-呋喃甲醛和番石榴酸的含量，可為米邦塔仙人掌的開發利用和質量控制提供依據。