子宮內膜癌分子分型的研究進展

支文雪，劉紅剛

子宮內膜癌(endometrial carcinoma, EC)是女性生殖系統常見的惡性腫瘤[1]。目前組織學分型和分級是EC分類的基石[2]，是臨床制定治療方案的重要參考指標。然而由于EC異質性大，傳統組織學分型和分級可重復性低，各型之間組織學特點常存在重疊，有時不能完全滿足臨床對于預測預后和精準治療的需求。因此，尋求一種重復性更高、對治療更有指導意義的分類方法成為近年研究的熱點。2013年美國癌癥基因組圖譜(The Cancer Genome Atlas, TCGA)研究將EC分為POLE超突變型、微衛星不穩定(microsatellite instability, MSI)高突變型、低拷貝數型(copy number low, CNL)/微衛星穩定型(microsatellite stable, MSS)和高拷貝數型(copy number high, CNH)/類漿液樣型[3]，其中POLE超突變型預后最好，高拷貝數型預后最差。本文就近年來各分子亞型的研究進展進行綜述，以期將傳統病理學診斷與分子分型相結合，為更精準臨床診療和管理提供信息。

1 TCGA分子分型及臨床病理特征

1.1 POLE超突變型POLE是DNA聚合酶ε(DNA polymerase epsilon)的一個催化亞基，具有DNA鏈延長和延長中校正復制錯誤這兩種催化活性，該基因發生突變時，錯配堿基不能被識別及修復，從而使基因組突變數量異常增高導致腫瘤發生。POLE超突變型(或稱POLE突變型)所占比例最少，約占全部內膜癌的10%，包括6%的低級別(FIGO G1及G2)子宮內膜樣癌(endometrial endometrioid carcinoma, EEC)和15%～22%的高級別(FIGO G3)EEC。該亞型的主要特點為體細胞超高突變負荷(232×10-6突變/Mb)、POLE外切酶結構域(exonuclease domain mutations, EDM)突變、高堿基替換率(C→A)和MSS，在4個分子亞型中預后最好。其特征性的突變譜包括PTEN(94%)、PIK3CA(71%)、PIK3R1(65%)、FBXW7(82%)、ARID1A(76%)、KRAS(53%)和ARID5B(47%)，主要突變位點為P286R、V411L、S297F、A456P和S459F[3]。

典型的POLE超突變型EC臨床病理特征表現為患者年齡較輕、分期較早，形態學具有異質性，多為高級別EEC以及伴有顯著的腫瘤內淋巴細胞(tumor-infiltrating lymphocytes, TILs)(≥40個/10 HPF)或腫瘤周圍淋巴細胞浸潤[3-4]。POLE超突變型EC大部分是MSS(65%)，但是35%的腫瘤同時攜帶了TP53基因突變，這提示在檢測過程中有可能將該預后極好的分子亞型錯誤分類為預后最差的CNH/類漿液樣型。POLE超突變型在透明細胞癌、未分化癌及癌肉瘤中也有報道[5-7]。隨后的多項回顧性研究也證實了具有高級別組織學形態特點的POLE超突變型患者的預后良好[8-10]。portec-2臨床試驗中納入了427例高中危風險組EC患者，其中POLE超突變型患者的10年癌癥相關生存率為100%，而p53突變組為62.3%(P<0.001)[11]。研究發現其預后良好可能并非由于其對術后治療更敏感，而是此亞型本身生物學行為良好。POLE突變的胚胎干細胞并沒有表現出對放療和化療更高的敏感性，卻表現出對核苷酸類似物阿糖胞苷和氟達拉濱更高的敏感性，因而提示對于進展期的POLE超突變型患者有可能從核苷酸類似物治療中獲益[12]?；谏鲜鲅芯砍晒?，許多研究者認為POLE突變可作為一項提示EC預后極好的預測指標，從而引發對于該型患者治療的思考，尤其是對于有生育要求的年輕女性是否可以采取更為保守的治療。然而國內近期一項收集228例EEC的回顧性研究卻沒有得出一致的結論，研究者發現各分子亞型間臨床病理參數差異均無統計學意義[13]。國內外研究結果之間的差異可能是由于遺傳背景差異和入選病例組織學亞型及病例量的偏倚，確切數據尚需更多中心和更多病例量的確認。同時高級別EC組織學分型較困難，一些POLE超突變型可能會被錯誤分類，而分子分型整合入組織學分類中有助于改善這些問題，能更好地鑒定FIGO G3級EEC和漿液性癌，從而更好地為臨床評估預后和制定治療方案提供更為精準的信息。

1.2 MSI高突變型MSI是由于DNA錯配修復基因(mismatch repair, MMR)突變導致DNA堿基錯配校正異常，從而引起具有微衛星重復序列的基因發生改變。TCGA分型中采用的MSI檢測方法是應用PCR方法在美國國立癌癥研究所推薦的5個核苷酸位點(BAT25、BAT26、D2S123、D5S346、D17S250)基礎上增加了2個單核苷酸位點(BAT40和TGFR-Ⅱ)，將EC分為三型：如果有≥3個(大于40%)微衛星位點出現不穩定，為微衛星高度不穩定型(MSI-H)；如果1～2個(小于40%)微衛星位點出現不穩定，為微衛星低度不穩定型(MSI-L)；0個位點檢測到不穩定，則為MSS型[14]。該亞型有較高突變負荷(18×10-6突變/Mb)，突變頻率約為MSS型的10倍，并表現出頻繁的KRAS突變，較少發生FBXW7、CTNNB1、PPP2R1A和TP53突變。MSI高突變型占所有EC的25%～30%，且多數是由于MLH1啟動子甲基化形成表觀遺傳學沉默的散發性EC，遺傳性的林奇綜合征僅占所有EC的2%～3%[15]。PCR法檢測MSI或免疫組化檢測MMR蛋白(MLH1、PMS2、MSH2及MSH6)表達狀態作為林奇綜合征的篩查手段已在臨床上達到廣泛共識，但在臨床實踐中卻有較大差異。

組織形態學上，MSI高突變型EC與POLE超突變型EC較為相似，多為高級別EEC以及伴有顯著的腫瘤內淋巴細胞浸潤，然而兩型患者的預后卻有所不同。McMeekin等[16]在一項納入1 024例EEC的研究中發現盡管MMR缺陷型(deficient MMR, dMMR)EEC與一些不良預后因素[如FIGO分期晚、腫瘤細胞高級別和淋巴脈管間隙受累(LVSI)]相關，但其預后與MMR完整型EEC并無顯著差異，這提示dMMR-EEC可能誘發了較強的抗腫瘤免疫應答。廣泛LVSI雖然可以在各分子亞型中出現，但其在dMMR-EC中的發生率更高(P=0.002)，從而顯著提高腫瘤的復發風險[17]，這也解釋了為何分期較晚的腫瘤大部分為dMMR亞型。2017年5月23日FDA首次直接批準Pembrolizumab(Keynote)治療具有MSI-H/dMMR分子表型的實體腫瘤。研究者發現使用Pembrolizumab治療的患者中，dMMR者表現出較MMR完整者更高的免疫相關反應率和免疫相關無進展生存率[18]。

1.3 CNL/MSS型體細胞拷貝數變異(somatic copy number alterations, SCNA)被定義為基因組部分重復的現象，TCGA根據SCNA的特點將EC分為CNL和CNH/類漿液性腫瘤型。CNL型即MSS型，該亞型突變負荷較低(2.9×10-6突變/Mb)，常見突變為PTEN(77%)、CTNNB1(52%)、PIK3CA)(53%)、PIK3R1(33%)和ARID1A(42%)，其中CTNNB1是唯一一個突變率高于MSI高突變型的基因。CTNNB1突變發生在19%～37%的EEC中，在MSS-EEC(24%～52%)中較MSI(11%～20%)更常見。CNL型代表了大部分低級別(G1和G2)EEC，該型在所有亞型中具有中等預后，然而其中一小部分預后卻較差。Kurnit等[19]研究發現在預后差的Ⅰ+Ⅱ期低級別EEC中，CTNNB1和TP53突變是無復發率差的獨立預測因素，84%的CTNNB1突變腫瘤免疫組化染色顯示β-catenin(CTNNB1編碼蛋白產物)核染色陽性。該研究結果提示對于CTNNB1突變的女性EC患者可能需要更為積極地治療。該亞型Wnt信號通路基因(CTNNB1、KRAS和SOX17)存在頻繁突變，Wnt信號通路異常激活促進細胞增殖及腫瘤進展，有效的Wnt通路抑制劑可能使該亞型患者受益。KRAS不僅在絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)通路中起作用，而且在Wnt信號通路中也起作用。目前，正在研究利用MAPK通路中重要的蛋白激酶MEK抑制劑的靶向治療，這可能對KRAS突變的腫瘤有效。一項臨床Ⅱ期試驗結果顯示，MEK抑制劑selumetinib單藥治療復發或持續性EC的耐受性良好，但療效有限(6個月無瘤生存率僅12%)[20]。單一MAPK途徑的改變(Ras/Raf突變)可能不足以引起臨床效應，未來需進一步研究異常Wnt/CTNNB1信號通路傳導的生物學機制。

1.4 CNH/類漿液性型與CNL/MSS型相反，CNH/類漿液性型突變負荷低(2.3×10-6突變/Mb)，具有廣泛的SCNA，常見突變依次為TP53(92%)、PIK3CA(47%)和PPP2R1A(22%)突變，而PTEN和KRAS基因突變罕見[3]。TCGA數據庫顯示此型包含幾乎所有漿液性癌(97.7%)和25%的G3-EEC，預后最差。其中漿液性癌與G3-EEC的組織學形態和免疫表型特征可能存在較大的重疊，導致高級別EC組織學分型診斷重復性差。23%～25%的CNH型腫瘤中存在MYC、ERBB2(HER-2)和CCNE1(Cyclin E1)基因的局部擴增，因此推測HER-2靶向抑制劑可能對HER-2過表達的該亞型腫瘤具有潛在治療作用。近期一項Ⅱ期臨床試驗發現在晚期復發的HER-2陽性漿液性癌中，曲妥珠單抗與卡鉑-紫杉醇聯合用藥組較單純化療組患者的無進展生存期增加[21]。

2 分子分型優化檢測方法

TCGA分子分型測序技術雖然在評估預后、指導個體化治療方面具有優勢，然而測序技術費用高昂且操作復雜，臨床應用性差。因而近年來，研究者們致力于探索方法簡便、臨床實用性強、可以在病理科常規開展的分子分型方法。

2015年Stelloo等[10]結合p53免疫組化結果(免疫組化不確定者行Sanger測序)評估p53狀態，通過Promega MSI分析系統聯合MLH1免疫組化檢測評估MSI狀態(對于MSI陽性但MLH1蛋白無缺失的腫瘤繼續行其他三項錯配修復蛋白MSH2、MSH6和PMS2免疫組化檢測)，最后通過Sanger測序鑒定POLE 9～13號外顯子的熱點突變，最終將來自多中心的116例高危組EC分為4個分子分型亞組：p53突變組(39例，34%)、MSI組(19例，16%)、POLE突變組(14例，12%)和無特定分子譜組(no specific molecular profile, NSMP)(44例，38%)。生存分析結果顯示，POLE突變組和MSI組的患者腫瘤復發和遠處轉移率均明顯低于p53突變組和NSMP組。該改良方法最終得到的分組雖不能完全等同于TCGA分型，但可觀察到與TCGA相似的4條生存曲線。此研究指出高級別EEC間異質性很大，不可單純用組織學進行簡單分類，并采用p53突變組和NSMP組重新定義了既往以組織病理學為標準的高危風險組患者，在評估患者預后、彌補治療不足、減少過度治療上具有重要意義。然而這種方法并未對無法進行分子檢測的腫瘤和包含1種以上分子改變的腫瘤(2%～3%)明確分型。

2015年Talhouk等[22]進一步簡化了上述檢測方法和步驟，發明了ProMisE(Proactive Molecular Risk Classifier for Endometrial Cancer)模型，該改良方法首先進行MMR蛋白(MLH1、MSH2、MSH6、PMS2)免疫組化檢測確定dMMR組，進而通過測序鑒定POLE EDM突變情況確定POLE突變組，第三步采用p53免疫組化法代替拷貝數狀態檢測確定p53突變組與p53野生組，來重現TCGA基因分組。其中p53突變組中高級別、進展期、非EEC所占比例最高，而POLE突變組中的腫瘤雖富于侵襲性(大部分為G3級EEC，并常伴有深肌層浸潤和LVSI)，但預后較好。2017年Talhouk等[8]繼續收集319例EC患者，證實ProMisE模型分組在總體生存、疾病特異生存和無進展生存期中差異有顯著性(P<0.001)，與之相對應的現在臨床上廣泛應用的基于術后病理特點的歐洲腫瘤內科學會(European Society of Medical Oncology, ESMO)風險評估系統中所定義的低危組和中危組預后并無明顯差異，從而確定該模型分組適用于臨床，并可提供獨立的預后信息。該分型方法首先對全部病例進行MMR免疫組化檢測，可以及時對林奇綜合征疑似患者進行分流；并且在福爾馬林固定石蠟包埋組織中即可進行，對樣本要求較低，可以用于病理科日常工作實踐。2018年Kommoss等[23]進一步驗證了ProMisE分類模型的意義，并且證實了術前診刮標本和術后標本中ProMisE結果高度一致(約為91%)。這意味著術前應用ProMisE分型可較準確地進行分子分型并指導后續輔助治療，并為有生育要求的年輕女性提供更多的選擇機會，當然，這一分型需要更多的前瞻性研究來進行臨床評估。

值得注意的是，各組腫瘤之間的分子改變有時并非截然分開，比如POLE超突變型也可以同時攜帶TP53基因突變。ProMisE分型檢測方法如果不是序慣進行而是平行進行分類時，則對同時包含多個基因組突變(POLE突變、dMMR或TP53突變)的腫瘤無法進行準確分類；同時也無法檢測出CNL組中的顯著異質性。因此，Rajmohan等[24]建議在病理科實際檢測工作中對ProMisE分型流程略作改動，即先進行POLE測序分組，再行MMR免疫組化檢測。這一檢測流程也是2020年第1版NCCN指南所推薦的流程。

3 結語

EC的發生、發展是由多種信號轉導通路及基因異常的相互作用，其在組織形態及分子水平上具有較大異質性，目前單純基于組織病理學分類或基因改變的分子分型均不能很好地全面反映腫瘤的生物學行為及患者預后。因此，未來臨床病理特征與分子分型信息的整合可能為內膜癌的診斷及預后評估提供了一個更合適的方式，這不僅有助于將G3-EEC中預后良好組與預后不良組(POLE高突變和CNH亞型)區分開來，還能將漿液性癌與分型難定的類似于漿液性癌的低級別EEC(如POLE高突變型及dMMR型)區別開來。然而對于TCGA分子分型的研究多是回顧性研究，缺乏前瞻性的臨床試驗驗證，所以4個亞型與臨床病理特征和生物學行為之間的關系需要進一步研究。此外，POLE突變檢測也需要臨床醫師的認可和更多醫保政策的支持?，F今仍然有很多問題需要解決，比如是否有必要將p53突變組/CNH組中的G3-EEC、漿液性癌和透明細胞癌鑒別診斷出來，以及ProMisE模型在術前活檢標本的應用能否真正將患者分流至不同分期手術方式等均有待深入探究。