利多卡因對大鼠蛛網膜下腔出血后遲發性腦血管痙攣的影響及腦保護作用機制研究

蘇飛，陳博文，李向男，劉佳琦，陳揚

蛛網膜下腔出血(subarachnoid hemorrhage，SAH)是一種臨床較為常見的腦血管意外，約占急性腦卒中發病率的10%，多由動脈瘤破裂、腦血管畸形、血管炎等引起[1]。腦血管痙攣(cerebral vasospasm，CVS)是動脈瘤破裂后SAH的常見并發癥之一，臨床主要表現為意識障礙和神經功能受損，是導致SAH患者死亡和致殘的重要原因[2]。SAH后CVS發生的機制尚不明確，可能與內皮素-1(endothelin-1，ET-1)產生、炎性反應、血管收縮/舒張功能障礙等有關[3-4]。目前，SAH患者主要通過術中應用溶栓劑、術后應用血管擴張劑、抗炎治療等預防和治療CVS，取得了一定的療效，但仍有部分患者的療效不理想[5]。利多卡因是一種酰胺類局麻藥，臨床常用于局部麻醉和抗心律失常[6]。近年來研究發現，利多卡因可以保護神經細胞離子通道，調節腦組織氧自由基能量代謝，發揮腦保護作用，對大鼠SAH后遲發性CVS具有一定的保護作用，但其作用機制尚未明確[7]。因此，本研究觀察了利多卡因對大鼠SAH后遲發性CVS的影響，并進一步分析了其腦保護作用的可能機制，旨在為SAH后遲發性CVS的防治提供一定的理論依據，報道如下。

1 材料與方法

1.1 試劑與動物 SPF級SD雄性大鼠54只，體質量180～220 g，由北京北方艾特生物科技有限公司提供[動物許可證號SCXK(京)2020-0005]，室溫下自由攝食與飲水。利多卡因購于國藥集團容生制藥有限公司；TUNEL組織細胞凋亡檢測試劑盒購自艾美捷科技有限公司；超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)、谷胱甘肽過氧化物酶(glutathione peroxidase，GSH-Px)、丙二醛(malondialdehyde，MDA)、ET-1和一氧化氮(nitric oxide，NO)檢測試劑盒，均購自上海雅吉生物科技有限公司；p38絲裂原活化蛋白激酶(p38 mitogen activated protein kinase，p38MAPK)、p-p38MAPK、內皮型一氧化氮合酶(endothelial nitric oxide synthase，eNOS)、p-eNOS抗體和辣根過氧化酶(horseradish peroxidase，HRP)標記羊抗兔IgG均購于美國Santa Cruz公司。

1.2 動物造模及分組 實驗于2019年2-5月于華北理工大學附屬醫院神經外科實驗室進行。大鼠預飼養1周后，采用隨機數字表法分為假手術組、SAH組、利多卡因組，每組18只。SAH組和利多卡因組大鼠采用枕大池注血法復制SAH模型[8]，腹腔注射2.5%戊巴比妥鈉麻醉，以枕外隆凸為中點行約1.0 cm切口，逐層分離，初步定位枕骨、環椎及環枕膜。分離暴露左側股動脈，抽取股動脈血0.3 ml，然后將注射器針頭沿枕骨下滑至枕骨大孔，并向前推進至枕大池，將0.3 ml血液緩緩注入枕大池，保持俯臥位頭低腳高約30 min，縫合切口，并用碘伏進行消毒。48 h后采用同樣的方法抽取0.3 ml右側股動脈血注入枕大池，若造模后大鼠基底動脈管腔縮小，管壁增厚則為造模成功。其中假手術組大鼠暴露股動脈后，將0.3 ml生理鹽水緩慢注入枕大池，采取同樣的方法注入2次，然后縫合傷口。第二次枕大池注血后30 min，利多卡因組大鼠向枕大池注入2%的利多卡因0.1 ml，SAH組和假手術組注入等體積生理鹽水。

1.3 檢測指標與方法 造模后3 d、5 d和7 d，每組各取6只大鼠進行組織取材，常規麻醉，經枕骨大孔抽取腦脊液，暫存于-80℃冰箱，向升主動脈插管灌注4%多聚甲醛PBS溶液，分離基底動脈，置入4%多聚甲醛中固定；取腦皮質及海馬組織，一部分置于4%多聚甲醛中固定，一部分暫存于-80℃冰箱待測。

1.3.1 基底動脈和腦組織的病理變化觀察：取4%多聚甲醛固定的基底動脈組織，進行常規切片制作和HE染色，光鏡下(×100)觀察基底動脈組織病理變化，隨機選取5個視野，采用Image J圖像分析系統測量基底動脈管徑周長和管壁厚度。取4%多聚甲醛固定的腦海馬組織，進行常規切片制作和焦油紫染色，光鏡下(×200)觀察海馬CA1區神經元形態結構。

1.3.2 TUNEL法檢測各組大鼠腦組織凋亡情況：取4%多聚甲醛固定的腦海馬組織，進行常規切片制作和TUNEL染色，光學顯微鏡下(×200)觀察神經細胞凋亡情況，隨機選取10個視野，采用ImageJ圖像分析系統計數陽性細胞數與總細胞數，計算細胞凋亡率。

1.3.3 腦脊液中氧化應激和血管收縮因子水平檢測：取暫存于-80℃冰箱的腦脊液，采用相應試劑盒測定腦脊液SOD、MDA、GSH-Px、NO和ET-1水平，嚴格按試劑盒說明書進行操作。

1.3.4 Western Blot測定腦組織中p38MAPK、eNOS蛋白表達：取大鼠腦皮質及海馬組織，勻漿，加入1 ml細胞裂解液提取總蛋白，經BCA法蛋白定量，依次進行電泳、轉膜、封閉，加入一抗p38MAPK(1∶1 000)、p-p38MAPK(1∶1 000)、eNOS(1∶1 000)、p-eNOS(1∶1 000)，以β-actin(1∶500)為內參，4℃下孵育過夜，加HRP標記的二抗(1∶1 000)，37℃下孵育2 h，顯影，Image J圖像分析系統分析蛋白相對表達量。

2 結 果

2.1 各組大鼠基底動脈和腦組織損傷比較 HE染色結果顯示，假手術組大鼠基底動脈管腔呈圓形或橢圓形，均未見明顯異常；SAH組大鼠基底動脈管腔不規則，管壁增厚，管腔面積縮小，且隨時間延長，病變越明顯；利多卡因組大鼠基底動脈管腔較規則，有收縮，但相較于SAH組病變明顯減輕，見圖1。

圖1 各組大鼠不同時點基底動脈病理特征比較(HE染色，×100)

焦油紫染色結果顯示，假手術組大鼠海馬CA1區神經細胞排列整齊形態，未見明顯異常；SAH組大鼠海馬CA1區神經細胞出現固縮變性，細胞間隙增加，胞漿呈深紫色，且隨時間延長，病變越明顯；利多卡因組海馬CA1區神經細胞出現少量細胞固縮變性，病變較SAH組顯著減輕，見圖2。

圖2 各組大鼠不同時點海馬CA1區病理特征比較(焦油紫染色，×200)

2.2 各組大鼠基底動脈管徑和管壁厚度的比較 相應干預后第3 d、5 d和7 d，SAH組大鼠基底動脈內徑周長小于假手術組，基底動脈壁厚度大于假手術組(P<0.05)；干預后第5、7 d ，利多卡因組大鼠基底動脈內徑周長大于SAH組，基底動脈壁厚度小于SAH組(P<0.05)，見表1。

表1 各組大鼠基底動脈管徑和管壁厚度比較

2.3 各組大鼠海馬組織細胞凋亡的比較 各組大鼠予相應干預后第3 d、5 d和7 d，SAH組大鼠海馬組織細胞凋亡率均高于假手術組(P<0.05)；利多卡因組大鼠海馬組織細胞凋亡率均低于SAH組(P<0.05)，見圖3、表2。

表2 各組大鼠海馬組織細胞凋亡率比較

圖3 各組大鼠不同時點海馬組織細胞凋亡情況比較(TUNEL染色，×200)

2.4 各組大鼠腦脊液氧化應激和血管收縮因子水平比較 各組大鼠予相應干預后第7d，SAH組大鼠腦脊液SOD、GSH-Px和NO水平低于假手術組，MDA和ET-1水平高于假手術組(P<0.05)；利多卡因組大鼠腦脊液SOD、GSH-Px和NO水平高于SAH組，MDA和ET-1水平低于SAH組(P<0.05)，見表3。

表3 各組SAH大鼠腦脊液氧化應激和血管收縮因子水平比較

2.5 各組大鼠腦組織p38MAPK及eNOS表達的比較 各組大鼠予相應干預后第7d，SAH組大鼠腦組織p-p38MAPK/p38MAPK蛋白表達高于假手術組(P<0.05)，p-eNOS/eNOS蛋白表達低于假手術組(P<0.05)；利多卡因組p-p38MAPK/p38MAPK蛋白表達低于SAH組(P<0.05)，p-eNOS/eNOS蛋白表達高于SAH組(P<0.05)。見圖4。

3 討 論

SAH后CVS是多種因素作用導致血管平滑肌收縮異常的結果，臨床多采用鈣離子通道阻滯劑、ET拮抗劑、他汀類藥物等治療，以調節血管收縮和血管炎性反應，達到治療效果[9]。利多卡因是近年來發現的一種腦保護劑。既往多項研究顯示，利多卡因可以阻斷神經細胞Na+、K+、Ca2+離子通道，調節神經細胞的氧化應激水平，改善腦組織能量代謝，發揮腦保護作用[10-11]。本研究中，SAH組大鼠腦組織神經細胞病變明顯，基底動脈管腔周長明顯縮短，動脈壁厚度明顯增厚，經利多卡因干預后，神經細胞病變明顯減輕，基底動脈管腔周長延長，動脈壁厚度減小，提示SAH大鼠出現明顯腦組織損傷和CVS，而利多卡因干預可明顯減輕腦組織損傷，緩解CVS的發生。且本研究發現，SAH組大鼠腦組織神經細胞凋亡率明顯升高，而利多卡因干預可以明顯抑制腦組織細胞凋亡發生。

注：與假手術組相比，aP<0.05；與SAH組相比，bP<0.05

SOD和GSH-Px是機體重要的抗氧化酶，可以清除機體過多的氧自由基，降低過氧化中間產物MDA水平[12]。已有研究顯示，SAH大鼠產生的過多氧自由基可以破壞線粒體結構，激活Bax/Bcl-2凋亡途徑，引起線粒體能量代謝障礙，導致腦組織損傷[13-15]。本研究中，利多卡因干預可以升高SAH大鼠腦脊液中的SOD和GSH-Px活性，降低MDA水平，提示利多卡因干預可能通過降低SAH大鼠的氧化應激水平，清除腦組織過量的氧自由基，減輕腦組織損傷。NO是一種氣態自由基，可以激活細胞內鈣泵，減少細胞內游離Ca2+，舒張血管，還可以通過多種途徑抑制ET-1的分泌，抑制血管平滑肌細胞收縮，在SAH后CVS的發生中發揮重要的調控作用[16-17]。ET-1是一種主要由血管內皮細胞合成的強效血管收縮因子，可以促進血管平滑肌增殖，還可以抑制eNOS表達，抑制NO合成，促進SAH后CVS的發生[18-19]。Munakata等[20]研究亦顯示，NO和ET-1是調控SAH后CVS發生的關鍵細胞因子。本研究中，利多卡因干預可以升高SAH大鼠腦脊液中的NO水平，降低ET-1水平。提示利多卡因可能通過調節NO和ET-1釋放，抑制SAH后CVS的發生。

已有多項研究顯示，p38 MAPK信號通路激活可以調節eNOS-NO系統的表達，磷酸化的p38 MAPK可以抑制eNOS的磷酸化，抑制NO的合成和分泌，調節血管收縮功能，參與調控SAH后CVS的發生發展[21-22]。Jiang等[23]的研究顯示，利多卡因可以抑制p38 MAPK的磷酸化，減輕腦缺血再灌注大鼠的腦組織損傷。本研究結果表明，利多卡因可能通過抑制p38 MAPK的磷酸化，促進eNOS的表達，調節NO和ET-1釋放，緩解SAH后CVS的進展。

綜上所述，利多卡因可能通過抑制p38 MAPK的磷酸化，促進eNOS-NO表達，抑制ET-1的分泌，調節血管收縮功能，緩解SAH后CVS的發生發展，還可以抑制腦組織細胞凋亡，減輕腦組織損傷，有望應用于臨床SAH后CVS的防治。但本研究尚處于探索階段，其具體機制尚需進一步實驗驗證。

利益沖突：所有作者聲明無利益沖突

作者貢獻聲明

蘇飛：設計研究方案，實施研究過程，資料搜集整理，論文撰寫；陳博文、李向男、劉佳琦：設計研究方案，分析試驗數據，論文修改，進行統計學分析；陳揚：提出研究思路，實施研究過程，論文審核