一株野生多脂鱗傘的鑒定、人工栽培與營養成分分析

陳潤臣，王藝凝，劉瀟文，王紅艷，丁 強，王鴻磊

(中國農業大學煙臺研究院，山東 煙臺 264670)

隨著生活水平的提高，人們對健康、綠色食品的要求越來越高。食用菌因其味道鮮美、營養豐富，且具有一定的保健和藥用功能[1-2]，越來越受人們的歡迎[3]，聯合國糧食及農業組織和世界衛生組織更將其納入“一葷一素加一菇”的合理膳食結構中[4]。

鱗傘屬[Pholiota(Fr.)P.Kumm.]屬于擔子菌門(Basidiomycota)層菌綱(Hymenomycetes)傘菌目(Agaricales)球蓋菇科(Strophariaceae)，廣泛分布于世界各地，目前中國境內記錄有63個種(包括亞種)[5]。鱗傘屬真菌是重要的食藥用菌資源，2019年我國小孢鱗傘(滑菇)的產量超過30萬t，成為我國13個食用菌主栽品種之一[6]。除小孢鱗傘外，我國可供食用的鱗傘屬真菌還有多脂鱗傘、黃鱗傘、金毛鱗傘、高地鱗傘等17個種[7-10]，其中，多脂鱗傘、黃鱗傘、粘鱗傘等9個種具有抗細菌、抗腫瘤、降血脂、提高機體免疫力等藥用價值[11-13]。然而目前我國除小孢鱗傘外，尚無大規模栽培其他鱗傘屬真菌的報道。

筆者于山東省棲霞市一蘋果園中采集到一個野生鱗傘屬真菌子實體，通過純種分離獲得了菌種。本文通過對該鱗傘屬真菌子實體、菌絲、孢子等的形態學觀察和分子生物學鑒定，確定了其分類地位，研究了其生物學性質，通過栽培試驗獲得了子實體，并對子實體的營養成分進行了測定，以期為野生多脂鱗傘的人工栽培、液體發酵、活性物質提取等開發利用提供技術支持。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 鱗傘屬真菌

于棲霞市蘋果園蘋果樹上采集到一個鱗傘屬真菌子實體，取菌蓋和菌柄連接處的菌絲組織接種于PDA平板上，25 ℃培養獲得菌種，編號為EF-3。

1.1.2 培養基和栽培料

PDA培養基：馬鈴薯200 g、葡萄糖20 g、瓊脂粉15 g、蒸餾水100 mL，pH值自然。

pH試驗培養基：PDA培養基滅菌后，用過濾除菌的NaOH溶液和HCl溶液調pH值至4.5、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0和11.0。

碳源試驗培養基：土豆浸粉10 g，MgSO40.5 g，瓊脂20 g，水1 000 mL，碳源分別為2%的葡萄糖、蔗糖、淀粉、玉米粉、紅糖、糖蜜、纖維素、麥芽糖和乳糖。

氮源試驗培養基：蔗糖20 g，MgSO40.5 g，瓊脂20 g，水1 000 mL，氮源分別為1%的酵母浸粉、土豆浸粉、牛肉浸粉、蛋白胨、豆餅粉、胰蛋白胨、大豆蛋白胨和0.5%的氯化銨、硫酸銨、硝酸銨、硝酸鉀。

無機鹽試驗培養基：蔗糖20 g，豆餅粉10 g，瓊脂20 g，水1 000 mL，無機鹽分別為0.1%的MgSO4、MnSO4、NaCl、CaSO4、FeSO4、K2HPO4、KH2PO4、Na2SO4、ZnSO4和K2SO4。

二級種培養料：麥粒90%、麩皮10%。新鮮麥粒煮至熟而不爛，加入麩皮拌勻，裝入菌種瓶，121 ℃滅菌150 min。

栽培料：玉米芯32%、木屑50%、麩皮15%、石灰1%、碳酸鈣1%、蔗糖1%。原料混勻后加水至含水量60%，放置2 h，裝袋，121 ℃滅菌150 min。

1.2 方法

1.2.1 鱗傘屬真菌EF-3的鑒定

子實體形態學觀察：參照文獻[14]的方法觀察子實體的形狀、顏色、鱗片、菌褶、菌柄等形態結構特征并拍照。

菌絲、無性孢子觀察：將菌種接種于PDA培養基平板上，25 ℃培養。挑取菌絲體，用美蘭染色液制作水浸片，觀察菌絲、鎖狀聯合和無性孢子[15]。

孢子印制備：取新鮮的子實體，用刀片齊菌褶把菌柄切斷，把菌蓋扣在硫酸紙上，扣上玻璃罩，2～4 h后，擔孢子散落在紙上，即得孢子印[14]。

擔孢子觀察：取少量擔孢子，于奧林巴斯BX51光學顯微鏡下觀察擔孢子形態并拍攝照片。取凍干的子實體1個、干燥的擔孢子少許，用導電膠帶固定到樣品臺上，在表面噴鍍一層導電金，JSM-7610F掃描電子顯微鏡觀察擔孢子形態并拍攝掃描圖片[16-17]。

分子生物學鑒定：取子實體0.1 g，用CTAB法提取基因組DNA，使用真菌28S rDNA通用引物NL1(GCATATCAATAAGCGGAGGAAAAG)、NL4(GGTCCGTGTTTCAAGACGG)擴增28S rDNA的D1、D2區[18]。PCR產物送生工生物工程(上海)股份有限公司測序，所得基因序列通過Blast程序與Genbank數據庫的序列比對，進行分子生物學鑒定。用MEGA 5.0進行多序列比對并構建系統發育樹。

1.2.2 生物學特性研究

最適生長溫度試驗：用內徑8 mm打孔器打取菌落邊緣的菌絲塊，接種于PDA培養基平板表面，分別在5、10、15、20、25、30、35 ℃培養，定期測量菌落直徑，計算菌絲生長量。

最適pH值試驗：用內徑8 mm打孔器打取菌落邊緣的菌絲塊，接種于pH試驗培養基平板表面，定期測量菌落直徑，計算菌絲生長量。

最佳碳源、氮源、無機鹽試驗：用內徑8 mm打孔器打取菌落邊緣的菌絲塊，分別接種于碳源試驗培養基、氮源試驗培養基、無機鹽試驗培養基表面，25 ℃培養，定期測量菌落直徑，計算菌絲生長量。

1.2.3 栽培試驗

將菌種接種到PDA平板上，25 ℃培養7 d得栽培母種。取4～5塊母種接種到麥粒培養基上，24 ℃培養得二級種。將二級種接種到栽培料上，24 ℃培養至產生黃色液滴，打開袋口去掉老菌皮，給予溫差刺激，維持相對濕度85%～95%，每天早晚噴水各1次，噴水后通風30 min直至現蕾，觀察出菇過程。

1.2.4 營養成分分析

多脂鱗傘EF-3子實體60 ℃干燥后，依據GB5009.5—2016《食品安全國家標準食品中蛋白質的測定》、GB 5009.6—2016《食品安全國家標準食品中脂肪的測定》、GB/T 15672—2009《食用菌中總糖含量的測定》、NY/T 1676—2008《食用菌中粗多糖含量的測定》和GB5009.124—2016《食品安全國家標準食品中氨基酸的測定》測定子實體中的蛋白質、脂肪、總糖、多糖和游離氨基酸含量。

1.3 數據分析與繪圖

利用SPSS 19.0軟件對試驗數據進行顯著性分析和多重比較，利用Origin 9.1軟件進行圖形繪制。

2 結果與分析

2.1 鱗傘屬真菌EF-3的鑒定

2.1.1 子實體形態學觀察

鱗傘屬真菌EF-3菌蓋初期扁半球形，后期平展、黃色，具叢毛狀三角形鱗片。鱗片同心圓排列，菌蓋中央顏色較深。鱗片與菌蓋結合處黃色至褐色，尖端白色至淺黃色(圖1-A)。菌蓋濕時黏，鱗片清洗易脫落。

菌柄淺黃色，中生或近中生，近等粗(圖1-B)，內實，橫切面水漬狀斑點(圖1-C)。菌環絲膜狀，菌蓋邊緣殘留菌幕殘片(圖1-D)，菌環以下菌柄上有淡黃色鱗片，菌環以上光滑(圖1-B)。

菌肉淺黃色，菌肉與菌柄內部顏色一致(圖1-E)。菌褶密，淺黃色，成熟后淺褐色，彎生、不等長、不分叉(圖1-B)。

A，菌蓋正面；B，菌蓋背面；C，菌柄橫切；D，內菌幕和菌褶；E，子實體縱切。

一個擔子上4個擔孢子(圖2-A)，擔孢子腎形，頂部有孔口，向內彎曲(圖2-B)，大小(5.5～7.5)μm×(3.5～5.0)μm，長寬比約1.2～2.0(圖2-C)。孢子印褐色(圖2-D)。

圖2 擔孢子和孢子印

2.1.2 菌落和菌絲形態觀察

鱗傘屬真菌EF-3菌落呈規整的圓形，蔓延生長，棉絮狀，質地疏松，菌落表面有同心輪紋。菌落無色至淡黃色，中心顏色略深于四周，不產水溶性色素(圖3-A)。菌絲多分枝，直徑1.5～3.5 μm，具鎖狀聯合(圖3-B)。平板培養3 d左右產無性孢子，孢子大小(7.5～13.75)μm×(2.25～4.25)μm(圖3-C)。

2.1.3 分子生物學鑒定

利用CTAB法提取鱗傘屬真菌EF-3基因組DNA，用引物NL1、NL4擴增28S rDNA的D1、D2區。PCR產物送生工生物(上海)股份有限公司進行序列測定。Blast序列相似性比對結果顯示：鱗傘屬真菌EF-3的28S rDNA的D1、D2區序列與多脂鱗傘(Pholiotaadiposa)的相關序列相似率均高達98%以上，結合形態學指標鑒定其為多脂鱗傘。多脂鱗傘EF-3與鱗傘屬其他種的系統發育樹如圖4所示。

2.2 生物學特性

2.2.1 最適生長溫度

如圖5所示，多脂鱗傘EF-3菌絲在5 ℃生長極其緩慢，隨著溫度的升高，其菌絲生長加快，當培養溫度提高到25 ℃時菌絲生長最快。培養溫度超過25 ℃時菌絲生長速度急劇下降，培養溫度提高至35 ℃時菌絲幾乎不生長。

柱上無相同字母的表示差異顯著(P<0.05)。下同。

2.2.2 最適生長pH值

如圖6所示，多脂鱗傘EF-3菌絲在pH值4.5～11.0均可生長，其最適pH值為5.0，當pH值超過5.0時，菌絲生長速度緩慢降低，至pH值為11時菌絲仍能保持較快的生長速度。

圖6 多脂鱗傘EF-3在不同pH值下的菌絲生長量

2.2.3 最適碳源

碳源是多脂鱗傘最重要的營養物質，可為多脂鱗傘的生長提供碳元素和能量。多脂鱗傘EF-3能利用的碳源譜較廣泛(圖7)，無論是大分子的纖維素、淀粉，還是小分子的葡萄糖均能被菌絲吸收。但多脂鱗傘菌絲在不同碳源培養基上生長速度不同，其中，在乳糖為碳源的培養基上生長最慢，在以蔗糖、紅糖為碳源的培養基上菌絲生長最快。

A，葡萄糖; B，蔗糖; C，淀粉; D，玉米粉; E，紅糖; F，糖蜜; G，纖維素; H，麥芽糖; I，乳糖。

2.2.4 最適氮源

氮是構成蛋白質、核酸等生物大分子的重要元素，也是維生素、氨基酸等活性物質合成的基礎。從圖8可以看出，多脂鱗傘EF-3可利用的氮源非常廣泛，不管是無機氮源還是有機氮源都能很好地利用?？傮w上看，多脂鱗傘EF-3在有機氮源培養基上的生長速度明顯高于無機氮源培養基。菌絲在不同有機氮源培養基上生長速度也有明顯差異，其中，以豆餅粉為氮源的培養基最利于菌絲生長。

A，氯化銨；B，硫酸銨；C，硝酸銨；D，硝酸鉀；E，酵母浸粉；F，土豆浸粉；G，牛肉浸粉；H，蛋白胨；I，豆餅粉；J，胰蛋白胨；K，大豆蛋白胨。

2.2.5 最適無機鹽

結果(圖9)表明，培養基內添加不同無機鹽對多脂鱗傘EF-3菌絲生長有不同的作用。硫酸錳對菌絲生長具有明顯促進作用，而培養基內添加0.1%硫酸鉀、硫酸鈉等無機鹽后，多脂鱗傘EF-3菌絲生長明顯受到抑制。硫酸鎂、硫酸亞鐵、硫酸鈣等無機鹽的加入對多脂鱗傘EF-3菌絲的生長沒有明顯作用。

圖9 多脂鱗傘EF-3在不同無機鹽下的菌絲生長量

2.3 多脂鱗傘EF-3栽培實驗

將多脂鱗傘EF-3母種接種到麥粒二級種培養基中，24 ℃培養46 d長滿瓶。將麥粒種接種到栽培料菌袋中，24 ℃培養約27 d長滿菌袋。繼續培養26 d至有黃色液滴產生，說明菌絲已成熟。打開袋口，去掉老菌皮，給予不低于10 ℃的溫差刺激，7 d后出現米粒大小的菇蕾。菇蕾初期小米粒狀，2～3 d后頂部開始膨大形成帶鱗片的半球形菌蓋。隨著子實體的逐漸長大，菌蓋展開，菌蓋與菌柄接觸部位的內菌幕被一層層撕裂，殘留在菌蓋和菌柄上形成鱗片。當菌蓋剛剛完全展開時，即可采收，從現蕾到采收約10～12 d(圖10)。

A，現蕾；B，現蕾3 d；C，現蕾5 d；D，現蕾8 d；E，現蕾10 d；F，現蕾12 d。

2.4 營養成分

多脂鱗傘EF-3子實體營養成分如圖11所示。子實體蛋白質含量為19.94%，與大宗食用菌品種香菇、平菇、金針菇等相當；脂肪含量只有2.32%，屬于高蛋白低脂肪的健康食品。多糖和游離氨基酸含量相對較低。游離氨基酸以谷氨酸含量最高，占游離氨基酸總量的31.3%。

Asp，天冬氨酸；Glu，谷氨酸；Ser，絲氨酸；Thr，蘇氨酸；Ala，丙氨酸；Tyr，酪氨酸；Ile，異亮氨酸；Phe，苯丙氨酸。

3 結論與討論

我國是食用菌生產第一大國，2019年我國食用菌總產量達到3 933.87萬t[6]，其中，香菇、黑木耳、平菇等7個主要品種產量占比高達85%，說明我國食用菌產業品種結構嚴重不平衡，如何優化食用菌產業結構是食用菌科研人員和從業人員急需解決的問題。野生食用菌味道鮮美，營養豐富，具有一定的滋補和食療保健價值，深受世界各地人民的喜愛，越來越多地出現在人們的餐桌上[19-20]。但是我國野生食用菌主要的獲取手段是野外采集，隨著人們對野生菌需求量的上升，僅靠野外采集已經不能滿足需求，而過度采集不但嚴重影響野生食用菌的可持續發展，而且會破壞環境[21]，故開展野生食用菌的人工馴化工作勢在必行[22]。

鱗傘屬是球蓋菇科中一個重要的屬，此屬的真菌除少數對人體有毒外，都是營養豐富、極具開發應用潛力的食藥用真菌[23]。目前鱗傘屬真菌中只有小孢鱗傘進行了大規模的人工栽培，尚有白鱗傘[24]、翹鱗傘[25]、黃鱗傘等[13]處于人工馴化階段。

本研究采集并人工栽培了一株野生鱗傘屬真菌，其子實體初期扁半球形，后期平展，黃色，具叢毛狀三角形鱗片，鱗片同心圓排列；菌柄淺黃色，中生或近中生，內實，橫切面水漬狀斑點；菌環絲膜狀，菌蓋邊緣殘留菌幕殘片，菌環以下菌柄上有淡黃色鱗片；菌肉淺黃色，菌肉與菌柄內部顏色一致；菌褶密，淺黃色，成熟后淺褐色，彎生、不等長、不分叉；擔孢子腎形，頂部有孔口，孢子印褐色；菌落無色至淡黃色，菌絲多分枝，具鎖狀聯合，產無性孢子。形態學和分子生物學鑒定確定其分類學地位為多脂鱗傘，其最適生長溫度為25 ℃，最適pH值為5.0，最適碳源、氮源和無機鹽分別是蔗糖、豆餅粉和MnSO4。麥粒種46 d滿瓶，菌絲長滿栽培袋需27 d，自接種至采收約需70 d。子實體蛋白質含量為19.94%，多糖含量為5.14%，脂肪含量為2.32%，游離氨基酸含量為2.84%。以上研究結果對野生多脂鱗傘的人工栽培具有一定的指導意義。該菌株屬中低溫品種，適于北方地區春秋兩季大棚栽培或工廠化栽培，其示范推廣有利于我國食用菌品種結構的優化。

食用菌母種培養階段會形成粉孢子、分生孢子、節孢子、厚垣孢子等無性孢子，有的無性孢子萌發會形成不結實或結實能力差的菌絲，影響食用菌產量，如金針菇的粉孢子[26]；有的無性孢子的形成與產量和品質無直接關系，但可以緩解菌種退化，如草菇的厚垣孢子[27-28]。多脂鱗傘EF-3菌株在母種培養時也會產生大量的無性孢子，其無性孢子的類型、產生條件、萌發后菌絲的結實能力、是否會造成菌種退化等問題還需要進一步研究。