瑪咖中芥子油苷及其降解過程的研究進展

顏穗桐，魏金超，高玉梅，陳芮*

1. 云南師范大學化學化工學院（昆明 650500）；2. 中國科學院化學研究所（北京 100190）

瑪咖（Lepidium meyeniiWalp.）是逐漸被人們認識的一種食品補充劑。研究表明，瑪咖的主要生物活性成分為芥子油苷（glucosinolates）、瑪咖酰胺（macamide）、瑪咖烯（macaene）、生物堿（alkaloid）和甾醇（steroid）?，斂е械慕孀佑蛙占捌浣到猱a物——異硫氰酸酯（ITCs）因具有良好的抗腫瘤活性，進而引起人們對瑪咖研究的極大興趣。

芥子油苷，又稱為硫代葡萄糖苷。芥子油苷是十字花科植物中廣泛存在的一種重要含硫次生代謝產物。從雙子葉被子植物的16個科中已鑒定出120余種不同芥子油苷。1970年，Marsh等[1]用X射線分析了芥子油苷的晶體結構后，認為芥子油苷都具有相同的基本結構式，即具有側鏈（R）以及和硫連接的β-D-吡喃葡萄糖部分（見圖1）。根據其側鏈基團R的來源，芥子油苷可分為脂肪族、芳香族和吲哚族3類。

圖1 芥子油苷的化學結構

2002年，Dini等[2]和Piacente等[3]先后報道了在瑪咖根中能夠檢測到芐基芥子油苷（benzyl glucosinolate或glucotropaeolin）和甲氧基芐基芥子油苷（methoxybenzyl glucosinolate或glucolimnanthin）等。Huang等[4]研究顯示，瑪咖中含有9種芥子油苷，其中包括脂肪族、芳香族、吲哚族。

瑪咖中總芥子油苷含量最高的部位是新鮮的塊根，其次是種子、植株、干燥的塊根及新鮮的葉子。Clément等[5]發現瑪咖的下胚軸和葉子中均含有脂肪族、芳香族和吲哚族3類芥子油苷。芳香族芥子油苷在瑪咖中含量最多，約占總芥子油苷的90%，主要為芐基芥子油苷、3-甲氧基芐基芥子油苷和對羥基芐基芥子油苷（glucosinalbin），其次為脂肪族類芥子油苷，包括5-甲基亞磺酰戊基芥子油苷（glucoalyssin）和4-甲基亞磺酰丁基芥子油苷（glucoraphnin）?，斂е羞胚犷惤孀佑蛙蘸孔钌?，主要為4-羥基吲哚基-3-甲基芥子油苷（glucobrassicin）。

盡管瑪咖中均含有脂肪族、芳香族、吲哚族3類芥子油苷，但是不同顏色的瑪咖中芥子油苷含量存在很大差異。Meissner等[6]通過對中國和秘魯2個產地不同顏色的瑪咖中芥子油苷種類及含量進行試驗后發現，不同顏色、不同種植地區的瑪咖中芥子油苷種類及含量有顯著差異。這可能是由于瑪咖的種類及生長環境不同導致，其中土壤的質地、pH及可利用的有機成分都可能是造成差異的原因。此外，干燥方法和處理條件對瑪咖中芥子油苷的含量也會產生很大影響[7]。

1 芥子油苷的提取、純化及檢測

1.1 芥子油苷的提取及純化

1.1.1 提取

芥子油苷的提取方法主要有微波法、水浴法及溶劑熱提法[8]?，斂е薪孀佑蛙盏奶崛∫话闶褂萌軇崽岱?。提取芥子油苷時，一般選用對芥子油苷有較大溶解度的溶劑來提高提取效率。通常選擇水、乙醇、甲醇等作為提取芥子油苷的溶劑。郝利民等[9]選用水、甲醇、乙醇、正己烷4種有機溶劑分別作為提取劑對瑪咖中芥子油苷進行提取。通過比較提取率，得出甲醇作為溶劑提取效率最高，水次之，正己烷最弱的結論。

1.1.2 純化

對粗提得到的芥子油苷通常采用陰離子交換柱等傳統的柱層析方法進行純化處理。普遍選擇的層析柱填料包括酸性氧化鋁、大孔強堿性陰離子交換樹脂或者DEAE Sephadex A-25葡聚糖凝膠等。采用這些柱層析進行純化，效果較好，得到的芥子油苷樣品純度較高。

吳謀成等[10]曾利用酸性氧化鋁作為填料，硝酸鉀為洗脫劑，得到芥子油苷的粗結晶。周錦蘭等[11]采用酸性氧化鋁色譜柱及反相C18硅膠柱相結合的方法對芥子油苷進行提純。這種方法具有便捷、成本較低的特點，適于分離提純菜籽中的芥子油苷。Wang等[12]通過對3種活性炭及5種大孔樹脂進行吸附解吸試驗以篩選適合提純芥子油苷的填料。結果表明，由于芥子油苷分子中的陰離子基團—SO3-能與D261大孔陰離子樹脂表面的陽離子季胺官能團發生特異性反應，進而能夠更好地吸附芥子油苷，因此D261大孔陰離子樹脂更適合芥子油苷的提純。在此基礎上，采用制備型液相色譜進一步分離純化即可獲得純度更高的芥子油苷樣品。

1.2 芥子油苷的分離鑒別

分離鑒別芥子油苷的方法有紙色譜法、薄層色譜法、氣相色譜-質譜聯用技術（GC-MS）、液相色譜-質譜聯用技術（LC-MS）及核磁共振波譜（NMR）等。

紙色譜與薄層色譜法主要在20世紀70年代前被廣泛使用。Ettinger和Lundeen首先利用薄層色譜法從植物中分離得到烯丙基芥子油苷（Sinigrin），并給出芥子油苷的一般結構。由于薄層色譜法分離出芥子油苷的種類有限，且分離效果不夠理想，因此這種方法現已不再被廣泛采用。

GC-MS和LC-MS是分離鑒別瑪咖中芥子油苷最常用的方法。Foerster等[13]報道采用氣相色譜（GC）法分離檢測芥子油苷。由于GC的檢測對象是沸點低于500 ℃、熱穩定性好、相對分子質量＜400的易揮發性物質，而芥子油苷在瑪咖中主要是以鹽的形式存在，熔、沸點較高，因而不能直接利用GC進行測定。進行GC測定前，需要將芥子油苷酶解轉化為異硫氰酸鹽等易揮發的物質。采用GC-MS定性是通過比較ITCs標準品與芥子油苷酶解得到的ITCs的保留時間，并結合MS給出的分子量及碎片離子信息等對芥子油苷結構進行推斷。由于吲哚類芥子油苷對溫度極其敏感，如在較低溫度下，這類芥子油苷的衍生化反應不完全，溫度升高時，又易分解，因此采用GC-MS分析吲哚類芥子油苷的結果不理想[14]。

與GC不同，采用高效液相色譜（HPLC）法分析樣品時，不受試樣的揮發性及熱穩定性的限制，因此HPLC應用范圍廣。HPLC-MS具有兩種分析方法的特點，不僅可以對目標化合物的相對分子質量、離子碎片及物質結構進行綜合分析，同時還具有高效、抗干擾能力強的特點，已成為天然產物分離、分析、結構鑒定的強有力工具。芥子油苷極性大，直接采用反相C18柱進行分離時保留能力差，不利于有效的分離。因此在使用HPLC對芥子油苷進行分析時，需要采用硫酸酯酶對芥子油苷進行脫硫處理得到脫硫芥子油苷（desulphation）。經脫硫處理后，與氮原子相連的硫酸根被氫氧根所取代，產物的極性顯著降低[15]，這時候進行分析能得到較好的分離效果。Zhang等[16]通過對芥子油苷進行脫硫處理，得到脫硫芥子油苷。采用HPLC結合高效液相色譜-電噴霧質譜儀（HPLC-ESIMS）根據帶負電荷的分子離子峰、色譜圖上的保留時間及質譜給出的碎片離子信息對脫硫芥子油苷進行分析，鑒別出所對應的芥子油苷種類。

1.3 芥子油苷的含量測定

測定芥子油苷含量的方法可為間接測量法和直接測量法。

間接測量法是將芥子油苷酶解，對酶解后的產物進行定量分析，如通過測定ITCs、硫氰酸酯等的含量，可間接測定芥子油苷的含量。由于影響酶解過程的因素較多，導致測量結果波動較大，準確度不高。GC對芥子油苷的定量分析方法就是通過內標法或外標法，以ITCs為標準品，通過計算芥子油苷水解得到的ITCs含量間接求出芥子油苷含量。

直接測量法是通過直接測定總芥子油苷的含量或者采用分量法對樣品中芥子油苷的每一種組分進行分析。該法主要用于分析每種樣品中芥子油苷組成的差異[17]。顧振新等[18]提供了一種測定植物中芥子油苷總含量的方法，即：將經粉碎的植物原料用乙酸鹽緩沖液勻漿；勻漿液經高溫水浴滅酶后，依次添加聚乙烯吡咯烷酮、醋酸鉛混合液及飽和硫酸鈉溶液；振蕩混勻后離心制得芥子油苷提取液；芥子油苷提取液分別采用堿降解、37%濃鹽酸中和；中和液再與鐵氰化鉀溶液反應后，用紫外-可見分光光度計在420 nm處測定鐵氰化鉀吸光度的減少量，以烯丙基芥子油苷為標準品制作標準曲線，經計算得到植物中總芥子油苷含量。

總芥子油苷含量還可利用芥子油苷與氯化鈀反應生成有色芥子油苷鈀的原理通過分光光度法在540 nm下進行比色定量[19]。該方法的缺點是顯色時間長，在復雜的體系下受溫度和樣品芥子油苷濃度影響較大，進而產生較大誤差。

HPLC可通過峰面積和樣品量的線性關系來對芥子油苷進行定量。該方法重現性好、精密度高，并且能同時檢測總芥子油苷及單個芥子油苷含量。缺點是前期硫酸酯酶處理過程復雜、耗時、設備價格昂貴等。

2 芥子油苷降解過程與產物

用于降解芥子油苷的植物糖基化酶是黑芥子酶（myrosinase）。黑芥子酶又稱為β-硫代葡萄糖苷酶，在植物體內一般以二聚體的形式存在。黑芥子酶是較為穩定的一類酶，能在pH 5～8的環境下保持活性[20]。在植物中黑芥子酶不是單獨存在的，它通常與芥子油苷共同構成特殊的底物酶系統[21]。

2.1 芥子油苷的降解過程

2.1.1 芥子油苷的酶降解

黑芥子酶和芥子油苷位于幼苗植物細胞的不同區域。黑芥子酶定位于細胞的特定蛋白體中，而芥子油苷分布于細胞液中。植物組織受到損傷時，黑芥子酶細胞中的黑芥子酶將被釋放，并與芥子油苷結合[22]。芥子油苷降解后產生1分子葡萄糖和糖苷配基，糖苷配基不穩定，隨即重組形成生物活性化合物，如腈、硫氰酸鹽和異硫氰酸鹽、惡唑烷-2-硫酮等物質[23]，芥子油苷酶降解產物的結構如圖2所示。芥子油苷則被認為是異硫氰酸鹽穩定的水溶性前體。

圖2 芥子油苷酶解過程的產物

2.1.2 影響酶降解的因素

芥子油苷降解得到的產物有些是對人體有害的，如腈類物質；另一些物質則是對人體有益的，如具有抗癌作用的硫氰酸酯類物質。體系pH、側鏈基團R及植物種類等因素會對酶降解產物產生影響。

一般情況下，在pH 5～8的中性體系中，芥子油苷經過酶水解生成糖苷配基和D-葡萄糖2種初產物，不穩定的糖苷配基發生Lossen重排，形成異硫氰酸鹽；在pH 2～5的酸性體系中，中間產物易發生脫硫反應，芥子油苷主要轉化為腈類化合物；在堿性條件下，黑芥子酶易失活，中間產物將生成硫代氰酸鹽[24]。

除此之外，結構中的側鏈基團R會對降解產物的結構產生影響?；鶊FR若為甲基、烯丙基、3-丁烯基、芐基或間甲氧基芐基時，其酶解易于產生具有相應揮發性的ITCs。對于大部分芥子油苷而言，酶解都能形成較為穩定的ITCs。而側鏈中含有β-羥基時，酶解會形成不穩定的ITCs，后環化形成硫代惡唑烷酮。

2.1.3 芥子油苷的無酶降解

芥子油苷既能夠在黑芥子酶參與下進行降解，也能在高溫高壓、無黑芥子酶參與的情況下發生降解。一般情況下，無酶降解的產物為腈類物質及ITCs[25]。降解的產物及反應速度受反應體系中溫度、壓強、含水量、反應化學試劑以及是否有過渡金屬離子參與等因素的影響。如高溫條件下，無酶降解的產物以腈類物質為主；體系含水量降低時，降解速度會變慢。

3 芥子油苷及其降解產物的生理活性

瑪咖獨特、刺鼻的味道主要來源于芥子油苷降解得到的ITCs[26]?，斂е薪孀佑蛙盏慕到猱a物具有生理活性如下：

3.1 殺蟲、除菌

芥子油苷酶系統是植物的一種化學防御系統。芥子油苷被黑芥子酶降解后，得到的最常見的一類水解產物是ITCs。ITCs在十字花科植物化學預防機制中起主要作用。ITCs對于不以十字花科為食的昆蟲有劇毒。因此芥子油苷可以抑制真菌、微生物的生長，可作為天然殺蟲劑被使用[27]。

3.2 抗腫瘤

芥子油苷及其分解產物因為具有抗癌活性而引起學者們的廣泛關注。芥子油苷在黑芥子酶的蛋白催化下產生最具有活性的水解產物ITCs。在抑制腫瘤過程中，ITCs通過誘導泛醌還原酶的活性成為致癌物的阻斷劑，而對正常細胞和淋巴系統均無害。

瑪咖之所以表現出很強的抑制癌癥的功能，是由于其含有芥子油苷，尤其是瑪咖中含量最高的芐基芥子油苷和甲氧基芐基芥子油苷水解得到的芳香族ITCs所起的作用[28]。

4 結語與展望

芥子油苷是瑪咖中一種重要的次生代謝物。芥子油苷及其降解產物ITCs對瑪咖的抗腫瘤活性起著重要作用。隨著科技的發展以及分析檢測技術的提高，人們對芥子油苷的研究逐漸深入，特別是對芥子油苷的提取、純化、鑒別、定量及其降解過程均有深入研究。

由于影響芥子油苷種類及含量的因素很多，且芥子油苷的降解過程很復雜，因此在對芥子油苷的研究過程中，仍存在很多急需解決的問題。鑒于芥子油苷及其降解產物具有殺蟲、除菌、抗腫瘤等優異的生理活性，如何提高芥子油苷的提取效率仍是研究熱點之一。芥子油苷降解過程中會產生對人體有害的腈類物質，研究芥子油苷降解過程及影響因素，通過改變控制條件降低芥子油苷降解過程中產生的腈類物質也是芥子油苷研究的重點。此外，提高瑪咖中芥子油苷的利用效率等均是具有重要價值的芥子油苷研究方向。