甘油對黑附球菌YL01黃色素發酵的影響

楊 柳,臺 武,梅 璐,周 悅

(合肥工業大學 食品與生物工程學院,安徽 合肥 230601)

黃色素廣泛應用于食物、飼料、化妝品、醫藥等領域,其占色素市場需求量的50%以上。按照來源不同,黃色素分為天然黃色素和合成黃色素。與合成色素相比,天然色素的安全性相對較高,并具有營養和健康效應,能賦予產品許多新功能[1]。天然黃色素主要通過抽提法從植物中獲得,如梔子黃色素、玉米黃色素、紅花黃色素等。從植物中提取黃色素的生產方法受到資源緊張、成本高的限制;利用微生物發酵法生產黃色素,不受地域、季節限制,并具有周期短、易于工業化,且具有投入少、成本低等優點,將成為生產天然黃色素的主流。但生產黃色素的菌種資源較為缺乏,目前產黃色素的微生物主要有紅曲霉屬[2]、籃狀菌屬[3]、黑附球菌[4-5]、綠色木霉[6]、散囊菌[7]等真菌。不產真菌毒素且色素合成能力強的菌株是真菌色素應用的核心,黑附球菌(Epicoccumnigrum)在一定的培養條件下可產生黃、橙、紅等色素,且尚未發現其產生真菌毒素[4-5]。

本課題組從空氣中分離到一株產黃色素的黑附球菌YL01,該菌株易于培養,且能在液體培養條件下產生黃色素,前期研究還發現以甘油為碳源能顯著提高黑附球菌YL01胞外黃色素的產量。有關甘油對黑附球菌YL01黃色素合成的影響報道并不多,本文從黑附球菌YL01黃色素生物合成途徑入手，對甘油促進黑附球菌YL01合成黃色素原因進行了分析,以期為真菌色素的開發應用提供一定的科學依據。

1 材料與方法

1.1 實驗儀器與試劑

T6紫外可見分光光度計(北京普析通用儀器有限公司);GZX-9000 MBE電熱鼓風干燥箱、YXQ-50G高壓蒸汽滅菌鍋(上海博訊生物儀器股份有限公司); VD-850超凈工作臺(蘇州凈化設備有限公司)。

三甲胺、酪氨酸、苯丙氨酸、檸檬酸三鈉、原兒茶酸、甲羥戊酸、碘乙酰胺、咪唑均購于國藥集團化學試劑有限公司;甘油、酵母提取物均購于北京索萊寶科技有限公司。

1.2 菌株

黑附球菌YL01,Genebank登錄號MF034106,合肥工業大學食品與生物工程學院微生物資源實驗室保藏菌種。

1.3 培養基

活化培養基：馬鈴薯20 g,蔗糖2 g,瓊脂2 g,自來水1 L,pH值自然；種子培養基：甘油20 g,酵母提取物1 g,自來水1 L,pH值自然；發酵培養基：甘油20 g,酵母提取物3 g,自來水1 L,pH值自然。所有培養基均在1×105Pa 滅菌20 min后使用。

1.4 實驗方法

1.4.1 菌種的培養

用接種環挑取保藏斜面一環菌絲接種于活化培養基平板上,25 ℃下培養3～5 d。將活化好的菌種用接種鏟取1 cm×1 cm的菌塊接種在裝有20 mL種子培養基的100 mL三角瓶中,25 ℃、120 r/min振蕩培養4 d。將20 mL種子液接種于裝有200 mL發酵培養基的500 mL三角瓶中,25 ℃、150 r/min振蕩培養14 d。

1.4.2 碳源對黑附球菌YL01產黃色素的影響

本文分別以葡萄糖、可溶性淀粉、乙酸鈉、蔗糖、果糖代替發酵培養基中甘油配制發酵培養基進行發酵,從發酵的第9天起,每天測定發酵液的色價,以最高色價作為該碳源下的黃色素色價。

1.4.3 抑制劑和前體對黃色素發酵的影響

原兒茶酸、檸檬酸三鈉、咪唑、碘乙酰胺、三甲胺、苯丙氨酸、酪氨酸和甲羥戊酸分別在發酵第5天時添加。發酵液中原兒茶酸、檸檬酸三鈉、三甲胺、苯丙氨酸、酪氨酸和甲羥戊酸添加的終濃度均為1.5、3.0、6.0、9.0、12.0 mmol/L;咪唑和碘乙酰胺添加的終濃度均為1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mmol/L;發酵培養12 d 后測定生物量,在發酵培養第7天起每天測定胞外黃色素產量,以最高產量計。

1.5 分析方法

生物量的測定采用干重法。將發酵液抽濾后,用去離子水沖洗2遍菌體,70 ℃ 烘至恒重。

發酵液在10 ℃、3 500 r/min下離心5 min,取上清液,用無水乙醇稀釋,以無水乙醇做空白對照,該黃色素在430 nm處有最大吸收峰,因此在430 nm處測定黃色素的色價,其計算公式為:

A430×稀釋倍數。

1.6 數據處理

所有實驗重復5次,應用Excel 2017軟件作圖,數據以(平均值±標準偏差)表示,采用GraphPad Prism 8統計軟件進行數據分析,組間比較采用單因素方差分析中的Duncan 法檢驗。

2 結果與分析

2.1 碳源對黑附球菌YL01黃色素發酵的影響

將發酵培養基中的碳源分別改為甘油、葡萄糖、可溶性淀粉、果糖、蔗糖、乙酸鈉等,添加量均為20 g/L,振蕩培養后,測定生物量和最大胞外黃色素產量，結果如圖1所示。從圖1可以看出,以甘油作為碳源時,發酵液透明清亮,呈亮黃色,黃色素色價最高,為13.18 U/mL;以葡萄糖為碳源時,菌體生物量最大,但黃色素色價最低,僅為1.94 U/mL。石韋內生真菌液態發酵培養10 d,黃色素色價[8]僅為1.716 U/mL，紅曲霉發酵同時產紅、黃、橙色素[2],而黑附球菌YL01只產黃色素,具有較高的開發價值。

圖1 碳源對黑附球菌YL01黃色素產量及生物量的影響

2.2 甘油對生物量和黃色素產量的影響

以甘油為碳源,25 ℃、150 r/min 振蕩培養12 d,測定胞外黃色素產量和生物量,結果如圖2所示。從圖2可以看出,甘油質量濃度為20 g/L 時,黃色素產量最高,為15.77 U/mL;當甘油質量濃度超過20 g/L 時,生物量隨甘油質量濃度增加而增加,黃色素產量隨甘油質量濃度增加而減少。而利用黑附球菌YL01在葡萄糖、酵母提取物培養基中液態發酵生產黃色素的色價為3.68 U/mL,說明在此條件下有更好的應用價值。

圖2 甘油對黑附球菌YL01生物量和黃色素產量的影響

2.3 黑附球菌YL01發酵過程分析

黑附球菌YL01發酵過程中菌體生長、黃色素色價的變化如圖3所示,從圖3可以看出,菌體在接種后經過1 d的生長停滯期后進入迅速生長期,培養5 d后生長速度開始降低,培養9 d后生長基本停滯,生物量還略有下降,可能是進入了衰亡期;黃色素從第3天開始合成,發酵5 d后其合成速度開始加快,發酵12 d時黃色素色價達到最大后增長緩慢,這與次級代謝物的合成規律是一致的。在紅曲霉生長及色素合成關系研究中,菌體生長分為調整期、生長期、穩定期和衰亡期,色素在菌體穩定期時快速合成,在衰亡期隨之減少[9];對紅球藻屬合成類胡蘿卜素的研究發現,其最大合成也在生長的指數期末甚至在穩定期出現[10]。

圖3 黑附球菌YL01發酵過程中菌體生長、黃色素色價的變化

2.4 黑附球菌YL01胞外黃色素合成途徑分析

不同的真菌黃色素合成途徑不同,如紅曲霉含氮黃色素多是通過聚酮途徑,胡蘿卜素類黃色素可通過甲羥戊酸途徑[11]。本文選擇向發酵液中添加次級代謝途徑抑制劑和前體的方法研究黑附球菌YL01黃色素的合成途徑。根據圖3,選擇在發酵第3天添加抑制劑或前體物質。

原兒茶酸可抑制甲羥戊酸途徑的關鍵酶二磷酸甲羥戊酸脫羧酶的活性,而檸檬酸三鈉則可以抑制磷酸甲羥戊酸激酶的活性。碘乙酰胺可抑制β-酮?；蝓ズ铣擅负王；o酶A轉酰酶,咪唑可抑制β-酮酯酰-ACP合成酶,這些酶是聚酮化合物生物合成途徑的合成酶[12]。莽草酸途徑是生物堿類、芳香氨基酸以及活性多肽等化合物的主要生成途徑,三甲胺是莽草酸途徑的關鍵酶氨基苯甲酸合成酶的特異性抑制劑[13-14]。因此向培養基中添加這些抑制劑,以考察它們對黑附球菌YL01黃色素合成的影響,結果見表1所列。

從表1可知,檸檬酸三鈉和原兒茶酸對黑附球菌YL01生長和胞外色素積累無顯著影響。而作為聚酮途徑抑制劑的碘乙酰胺對菌體生長和色素合成均極顯著抑制,當碘乙酰胺濃度達到5.0 mmol/L時菌體死亡且色素基本停止合成,從而使單位質量菌體黃色素合成量變化不顯著。而咪唑對菌體生長有極顯著抑制,當咪唑濃度達到5.0 mmol/L時菌體生物量減少了65.92%,導致單位質量菌體黃色素合成量的增加。三甲胺在低濃度時對胞外黃色素就有抑制作用,在中高濃度下對菌體生長和黃色素合成均極顯著抑制,使黑附球菌YL01單位質量菌體黃色素合成顯著減少,與對照組相比,實驗組黃色素色價分別減少了7.23%、16.13%、34.81%、63.22%、80.24%。說明黑附球菌YL01黃色素可能是通過莽草酸途徑合成。

表1 抑制劑對黑附球菌YL01胞外黃色素產量及生物量的影響

為了驗證該推測,在培養基中分別添加莽草酸途徑的前體物質酪氨酸和苯丙氨酸,考察其對黃色素產量的影響，如圖4所示。

圖4 酪氨酸和苯丙氨酸對黑附球菌YL01生長和黃色素產量的影響

從圖4可以看出,酪氨酸、苯丙氨酸對黑附球菌YL01生長和黃色素產量均有促進作用。當酪氨酸濃度為6.0 mmol/L時黑附球菌YL01單位菌體產黃色素量增加88.90%,當苯丙氨酸濃度為3.0 mmol/L時黑附球菌YL01單位菌體產黃色素量增加107.83%。這表明酪氨酸和苯丙氨酸對黑附球菌YL01產黃色素有極大的刺激作用。而相應的黑附球菌YL01的生物量也有不同程度的增加,這是由于黑附球菌YL01可以利用氨基酸作為碳氮源，因此可確認黑附球菌YL01黃色素的合成是通過莽草酸途徑。

3 結 論

甘油是微生物的常用碳源,也是生物柴油產業的重要副產物。甘油價格相對較低,且以甘油為碳源進行發酵時,尚未發現代謝阻遏現象。多種微生物可利用甘油轉化為高附加值產品,醋酸梭狀芽孢桿菌可將甘油轉化為1,3-丙二醇[15],向發酵基質中添加甘油能夠顯著提高紅曲霉的色素產量[16]。甘油提高發酵產物產率可能是由于該菌對甘油的利用率較高或甘油的存在促進了產物合成相關基因的表達[17]。黑附球菌YL01以葡萄糖為碳源時生物量最大,以甘油為碳源時色素色價最高,這說明甘油提高黑附球菌YL01色素產量可能促進了相關代謝途徑關鍵酶的表達。由于微生物次級代謝的復雜性,不同色素的結構差異很大,其合成代謝途徑也有很大的差異,微生物色素的生物合成與代謝調控的研究較少。黃單胞菌可通過聚酮途徑合成黃色素[12],真菌黑色素通過L-DOPA 途徑或DHN途徑等進行合成[18]。從對黑附球菌YL01代謝通路關鍵酶的抑制與前體補料發現,該黃色素合成代謝調控與兩者差異較大。

研究顯示,甘油可通過EMP途徑生產赤蘚糖-4-磷酸,從而合成莽草酸中間代謝產物[19]。以甘油為碳源促進黑附球菌YL01黃色素的合成,可能與甘油能提高菌體內莽草酸途徑代謝通量有關。因黑附球菌YL01黃色素的結構還不清楚,本文從次級代謝途徑研究其在以甘油為碳源時色素合成的途徑,甘油影響黑附球菌YL01產EYP的分子機理研究還需進行色素分離純化、結構分析、關鍵酶基因敲除以及同位素示蹤等工作。上述研究可為甘油在真菌發酵產色素方面的利用提供理論支持,也可為甘油的綜合利用提供新的思路。