利用CRISPR/Cas9技術創制早熟甘藍型油菜材料

喬 幸，安 然，陳娜娜，韋世豪，朱彥濤，陳 靜，張彥鋒*，穆建新*

（1.陜西省雜交油菜研究中心，陜西楊凌 712100；2.綿陽市農業農村局，四川綿陽 621010）

當前，我國食用植物油供不應求、嚴重依賴進口。甘藍型油菜作為我國主要的油料作物之一，具有重要的經濟價值。開花是植物從營養生長進入生殖生長的重要階段，油菜經過春化處理才能開花成熟，開花的早晚與早熟性密切相關。開花性狀由復雜的多基因控制，擬南芥已經報道的與開花相關的基因有120多個，并且控制開花的調控網絡也逐漸明[1]。FLC和FRI是開花途徑中2個關鍵基因，FLC基因編碼MADS-box轉錄因子，是開花時間抑制因子[2]。FRI通過促進FLC的表達可抑制油菜開花[3]。對甘藍型油菜的5個FLC同源基因（BnFLC1-BnFLC5）在擬南芥中分別進行過量表達，結果顯示BnFLC1-BnFLC5都能延遲擬南芥開花，BnFLC1、BnFLC2和BnFLC3抑制開花的程度明顯高于BnFLC4和BnFLC5[4]。甘藍型油菜有4個FRI同源基因，分別是Bna A3.FRI、Bna A10.FRI、Bna C3.FRI和 Bna C9.FRI，其中Bna A3.FRI與N3連鎖群上效應最大的QTL共定位，因此Bna A3.FRI是控制甘藍型油菜開花期的主要因子之一[5]。

CRISPR/Cas9基因編輯技術，能夠對靶向基因進行精準敲除、序列替換和定點突變，快速創制目標突變體，已成為作物種質資源創制的重要手段。目前，CRISPR/Cas9系統已在擬南芥、煙草、水稻、高粱和小麥等農作物中成功應用[6-10]，在油菜中也已有報道[11-12]。

本研究通過CRISPR/Cas9基因編輯同時敲除甘藍型油菜BnaFLC和BnaFRI，成功創制了BnaFLC和BnaFRI多基因敲除的油菜早熟突變體，該突變體不需春化，從播種到開花只需59 d，表現出明顯極早熟特征。該研究結果為早熟材料的創制探索了一條新的途徑，為進一步研究早熟性狀調控機理以及油菜早熟育種創制了寶貴的種質材料。

1 材料和方法

1.1 材料

甘藍型油菜（Brassica napus L.，2n=38，AACC）半冬性品種浙油50（浙江省農科院培育）。

1.2 方法

1.2.1 BnFLC及BnFRI基因敲除靶位點序列設計

利用CRISPR/Cas9靶位點在線設計網站（CRISPR DESINGER），結合 Brassicadatabase（http://brassicadb.org/brad/）和NCBI提供的序列信息，對甘藍油菜基因BnFLC和BnFRI分別進行比對分析，分別設計FLC和FRI的靶位點。

1.2.2 載體的構建

CRISPR/Cas9基因編輯載體pHSE401由中國農業大學陳其軍教授提供，構建方法詳見參考文獻[13]，油菜FLC和FRI基因靶向位點引物序列見表1。

表1 油菜FLC和FRI基因靶向位點引物序列Table 1 Primer sequences for targeting sites of BnFRI and BnFLC genes in Brassica napus

1.2.3 甘藍型油菜的遺傳轉化

浙油50種子用75%乙醇消毒1 min，加入15%次氯酸鈉（200 mL次氯酸鈉加入吐溫 200 μL），消毒15 min。ddH2O漂洗4～5次，點播于1/2 MS培養基上，25℃暗培養5～7 d。切取8～10 mm左右的下胚軸作為外植體，用含有重組質粒的農桿菌菌液（OD=0.4～0.6）浸染外植體15 min，在M1培養基上共培養2 d，轉入潮霉素（濃度50 mg/mL）M2培養基中繼續培養20 d后，再轉入潮霉素（濃度50 mg/mL）M3培養基中繼續培養，切取幼芽，轉入M4生根培養基，生根后移入基質培養，煉苗后轉至氣候室繼續培養，收獲種子。

1.2.4 陽性植株靶位點檢測

選取具有明顯早花表型的基因編輯植株提取DNA（SDS法），用載體序列特異性擴增引物U6-26p-F、CRIS-JD-R-all（表2）進行遺傳轉化真實性檢測。

1.2.5 CRISPR/Cas9敲除位點檢測

分別設計BnaFLC和BnaFRI靶位點側翼特異引物（表2），PCR擴增含有靶位點的目標序列，構建克隆載體，測序，解析早花材料BnaFLC和BnaFRI基因的突變位點。

表2 CRISPR/Cas9敲除位點檢測引物Table 2 Detection primers of CRISPR/Cas9 knockout sites

1.2.6 T1代植株靶位點檢測

將基因敲除后的早熟表型植株套袋自交，提取子代明顯早花植株的DNA，用載體序列特異性擴增引物U6-26p-F、CRIS-JD-R-all篩選不含轉基因成分的植株，并用含有靶位點的目標序列引物（表2），檢測靶位點突變序列，以確定具有非轉基因特性的早熟性狀的突變材料，用于后續早熟油菜品種的培育。

2 結果與分析

2.1 靶位點設計及載體的構建

2.1.1 靶位點設計

對比已公布的甘藍油菜基因BnFLC和BnFRI基因序列，利用在線設計軟件設計，選擇BnFLC基因上3個靶點，BnFRI基因上4個靶點。

BnFLC基因在甘藍型油菜中有9個拷貝，分別位于 A2（BnaA02g00370D）、A3（BnaA03g02820D、BnaA03g13630D）、A10（BnaA10g22080D）、C2（BnaC0-2g00490D）、C3（BnaC03g04170D、BnaC03g16530D）和 C9（BnaC09g46500D、BnaC09g46540D）染色體上。設計的靶位點T1位于BnFLC基因A2或C2染色體的第6個外顯子區域，可以同時編輯A2和C2染色體的2個同源拷貝。靶位點T2位于BnFLC基因A10或C9染色體的第1個外顯子區域，可以同時編輯A10和C9染色體的3個同源拷貝。靶位點T3位于BnFLC基因A10或C9染色體的第3個外顯子區域，可以同時編輯A10和C9染色體的3個同源拷貝（圖1）。

圖1 甘藍型油菜BnFLC和BnFRI基因敲除位置信息圖Figure 1 BnFLC and BnFRI knockout location

BnFRI基因在甘藍型油菜中有4個同源基因，分別位于 A3（BnaA03g13320D）、A10（BnaA10g058-50D）、C3（BnaC03g16130D）和 C9（BnaC09g27290D）染色體上。設計的靶位點T4和T5位于BnFRI基因A3或C3染色體的第1個外顯子區域，可以同時編輯A3和C3染色體的2個同源拷貝。靶位點T6位于BnFRI基因A3或C3染色體的第3個外顯子區域，可以同時編輯A3和C3染色體的2個同源拷貝。靶位點T7位于BnFRI基因A10或C9染色體的第1個外顯子區域，可以同時編輯A10和C9染色體的2個同源拷貝（圖1）。

靶位點T6、T7（表1）為BnFRI基因的單靶點，為提高靶點效率，設計5個雙靶位點，可以同時敲除BnFRI和 BnFLC 2 個基因，分別是 T2+T5、T1+T4、T1+T6、T3+T4和T1+T5（表1），具體靶位點序列見表 1。

2.2 油菜陽性植株靶位點檢測

使用農桿菌介導法侵染甘藍型油菜下胚軸，獲得一株具有明顯早熟表型的植株GM13，該陽性植株比正常植株（浙油50）提早抽薹，提早開花40 d左右。利用靶點檢測引物U6-26p-F、CRIS-JD-R-all（表2）進行PCR檢測，獲得500 bp的單靶點陽性片段以及1 000 bp的雙靶點陽性片段，驗證早熟植株GM13被成功轉化。陽性片段克隆測序，對比靶位點序列。驗證該植株靶位點T1-T7（表1）均被成功轉化。

2.3 陽性轉化苗靶位點編輯結果檢測

擴增陽性植株靶位點所在區域片段，并對PCR產物進行克隆測序分析，發現所有靶位點T1-T7中，BnaFLC基因中存在2種編輯情況，即BnaFLCA2（BnaA02g00370D）染色體的靶位點T1存在一個堿基C的插入；C2染色體缺失7個堿基（AAGAGAA）；BnaFRI基因中存在1種編輯情況，即C9染色體的T7靶位點有一個堿基T的插入，其余靶位點均未被編輯（表3）。

表3 CRISPR/Cas9敲除結果Table 3 Result of CRISPR/Cas9 knockout

2.4 T1代植株的突變是否可穩定遺傳

早熟表型植株GM13的T1代植株與對照浙油50相比（圖2），有明顯早熟性狀，表現為提早抽薹開花。選取3株T1代植株提取植物DNA為擴增模板，首先用載體序列特異性擴增引物U6-26p-F、CRIS-JD-R-all篩選不含轉基因成分的植株，再對每個T1代株系PCR擴增后送2個克隆測序，結果表明T1代植株的編輯位點序列與T0代植株的靶位點編輯情況完全一致（表4）。表明突變位點可穩定遺傳到下一代。

圖2 基因編輯早熟材料T1代植株與ZY50開花時間比較Figure 2 Flowering time of T1 generation plants compared to ZY50

表4 T1代植株突變位點情況Table 4 Result of CRISPR/Cas9 knockout in T1 generation plants

3 討論

CRISPR/Cas9技術基因編輯可以對基因組進行定點修飾和定點突變，現已被廣泛應用于擬南芥、水稻、玉米和煙草中，目前在油菜中已有報道利用該技術創制高油酸甘藍型油菜新種質[14]、創建甘藍型油菜多室突變體[15]。甘藍型油菜為異源多倍體植物，基因組高度重復，基因存在多個拷貝，但拷貝之間又不完全相同，基因定向編輯難度較二倍體植物高，雖然轉基因陽性率可以高達92.5%，但多靶點CRISPR/Cas9的T0代突變效率為12.9%～59.5%，單靶點平均編輯效率為6.5%～14.9%[15]。高謝旺等[14]對兩個高油酸基因BnaFAD2和BnaFAE1進行基因編輯，T0代均未發生基因編輯，在T1代檢測到了編輯的發生。本研究設計的7個靶位點均被成功轉化，但T0代被成功編輯的靶位點僅有2個。說明基因編輯在多倍體植物中效率不高，如果采取單個靶點遺傳轉化，鑒定工作量大，費時費力。為提高基因轉化效率和編輯效率，獲得基因編輯的早花甘藍型油菜材料，我們在遺傳轉化中將含有多個靶位點的載體混合遺傳轉化，轉化后獲得表型植株再檢測驗證植株靶位點的編輯情況，通過表型篩選植株減少了直接鑒定陽性植株的盲目性并且更加可靠。

FLC和FRI是油菜春化途徑的兩個關鍵基因，甘藍型油菜中的9個FLC同源基因中，BnaFLC.-A02、BnaFLC.C02、BnaFLC.A10 與油菜早晚熟開花有密切關系。代書桃[16]將BnFLC.A10基因轉入春油菜品種Westar，發現在春油菜環境或者無春化處理條件下陽性株系花期延遲。魏大勇[17]對甘藍型油菜開花期進行了GWAS分析，檢測到位于A02染色體上的已知開花基因BnaA02g00370D在冬性油菜和春性油菜中表達量差異達到極顯著水平。陳磊[18]通過轉基因驗證試驗證實BnFLC.A2導致雙親材料開花期差異，BnFLC.C2導致晚花親本R15和早花親本R11開花期差異，因此BnFLC.A2和BnFLC.C2基因在花期調控中起著重要的作用。本研究中FLC基因位于染色體A10和C9的同源基因并未編輯成功，而A2、C2染色體上的同源基因均被成功編輯，推測相較BnaFLC.A10和BnaFLC.C9，BnaFLC.-A02、BnaFLC.C02是影響開花時間的主要因子。

FRI是FLC上游調控因子，促進FLC基因的表達以此來抑制開花，甘藍型油菜中分離的4個FRI同源基因中[5]，BnaA3.FRI可能是決定油菜春化的主要因子，其余3個基因與甘藍型油菜春化以及開花的關系尚需進一步研究[19]。本研究中，FRI基因C9的堿基T插入，導致氨基酸發生變化及基因功能突變，但該反應對開花的影響有待于進一步剖析。T1代植株1中，雖未檢測到BnFRI基因靶位點被編輯，但植株具有明顯的早熟性狀，相比對照浙油50早抽薹，早開花。這可能是由于T1代的克隆測序程度不夠，或BnFLC基因靶位點被編輯后對早熟性狀的貢獻更大導致的。