低桔霉素紅曲霉變異菌株篩選及其變異位點分析

桂艷玲，唐光甫，滿海喬，趙杰宏

(貴州中醫藥大學，貴州省生藥學重點實驗室，貴州 貴陽 550025)

0 引言

【研究意義】紅曲霉是我國應用廣泛的傳統藥食兩用真菌，其代謝產物有洛伐他汀、γ-氨基丁酸、麥角甾醇、紅曲色素和桔霉素等，其中洛伐他汀有助于降低膽固醇含量，紅曲色素廣泛用于食品添加劑，而桔霉素是一種真菌毒素[1-3]。桔霉素給紅曲霉及其產品造成很大的負面影響，不僅影響著我國紅曲產品的進出口，也危害消費者身體健康。因此，不斷挖掘桔霉素代謝調控途徑，選育不產桔霉素的紅曲霉菌種具有重要應用價值?！厩叭搜芯窟M展】目前，圍繞桔霉素調控的研究主要集中在發酵條件優化[4-6]、菌種改良和遺傳調控方面[7-8]。莊曉曉等[9]利用N+離子束誘變結合紫外輻照處理得到低產桔霉素菌株；王軒等[10]使用紫外和硫酸二乙酯復合誘變選育了低產桔霉素菌株。LI等[11]通過敲除CtnB基因獲得桔霉素含量明顯下降的紅曲；HE等[7]敲除orf1和orf2基因后，桔霉素含量也顯著降低。關于ctnE[12]、ctnG[13]、ctnH[14]、orf6[15]和orf7[16]基因在桔霉素代謝途徑中的作用已相繼報道?！狙芯壳腥朦c】因桔霉素、紅曲色素和洛伐他汀皆屬于聚酮合酶(PKS)途徑的代謝產物，敲除相關基因后大多導致桔霉素和洛伐他汀同時降低，效果并不理想。為達到在消除桔霉素的同時不降低藥用成分的目標，繼續篩選優良菌株和功能基因非常重要?！緮M解決的關鍵問題】通過比較基因組分析可以檢測多種基因組變異，分析物種進化等[17]，弄清基因組變異位點。因此，對紫色紅曲霉誘變后，篩選獲得桔霉素含量差異顯著的菌株，通過分析其基因組變異位點，將為挖掘桔霉素代謝重要調控基因和調控途徑奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

紫紅曲霉(Monascuspurpureus)和枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)分別由貴州中醫藥大學生藥學實驗室和微生物與免疫學實驗室提供。桔霉素標準品和桔霉素ELISA試劑盒購自上海紀寧實業有限公司。

1.2 誘變及形態觀察

將培養7 d的紅曲霉平板開蓋，在15 W紫外燈下距離30 cm處照射10 min，然后往培養皿中加入無菌水沖刷孢子，得到的孢子懸液再用無菌水進行梯度稀釋，從獲得的每個稀釋梯度吸取500 μL均勻涂布于沙氏培養基上，30℃培養24 h，挑取單孢子菌株轉接到沙氏培養基上25℃培養7 d。篩選形態變異較大的菌株用粘片法進行顯微形態觀察，剪取小塊透明膠帶粘取少量菌絲放于載玻片上，在膠帶上滴1滴無菌水后蓋上蓋玻片，在顯微鏡下觀察各單孢子菌株的顯微形態特征。

1.3 抑菌活性測定

將枯草芽孢桿菌在LB液體培養基中振蕩培養活化12 h，待OD600值約為0.6時，取細菌懸液500 μL涂布LB平板。稱取45℃烘干的紅曲霉菌絲體0.100 g于三角瓶中，加入10 mL乙酸乙酯，封口后置于28℃搖床中140 r/min萃取2 h。用滅菌濾紙片在萃取液中浸泡24 h后取出晾干，然后放置在枯草芽孢桿菌涂布的LB平板上，每塊平板內等距離放3片濾紙作為平行對照，乙酸乙酯作為陰性對照。

1.4 化學成分含量測定

1.4.1 紅曲色素的色價 參照文獻[18]的方法，取液態發酵菌絲體在45℃烘干后研碎，精密稱取0.100 g菌絲體粉末于10 mL具塞試管，加入10 mL70%乙醇搖勻，60℃水浴1 h，取出冷卻后過濾，濾液用70%乙醇稀釋，測定OD505值。紅曲色素色價(U/g)=(OD505×稀釋倍數×浸提溶劑體積)/樣品質量。

1.4.2 洛伐他汀吸光值 參照文獻[19]的方法，取1 mL發酵液于50 mL三角瓶，加入9 mL70%乙醇振蕩混勻，放入恒溫振蕩器，28℃下140 r/min振蕩1 h后取出，在4 200 r/min離心5 min，精密量取1 mL上清液，加入9 mL 70%乙醇定容至10 mL，測定OD237吸光度值。

1.4.3 桔霉素含量 稱取菌絲體粉末0.050 0 g，加入2 mL甲醇于具塞扁形瓶中超聲8 min后，取1 mL懸濁液加入2 mL離心管中，12 000 r/min離心5 min，取樣品上清液采用桔霉素 ELISA試劑盒進行測定。桔霉素標準曲線按照ELISA試劑盒制作。

1.5 基因組測序分析

選取桔霉素含量差異較大的紅曲霉變異菌株與野生型(WT)菌株提取DNA，送諾禾致源生物技術公司進行基因組測序，每個菌種同時測3次重復，以野生型菌株為對照進行比較基因組分析。

2 結果與分析

2.1 變異菌株的形態特征

紫外誘變后從中分離出100余個紅曲霉單孢子菌株。由圖1可見，從培養7 d的形態上看，變異紅曲霉菌株的性狀變化較大，有黃色、棕色、紅色和白色等多種顏色，菌落質地有的疏松，有的致密；菌絲有絨狀、絮狀和毯狀，分泌色素有的非常明顯，有的很少。菌落邊緣不齊整，有的菌落出現不同形態的角變，表現出豐富的變異特征?？梢?，UV誘變產生效果較明顯，便于進一步篩選有益變異株。但各變異菌株的顯微形態結構(400×)并無明細變化，推測UV誘變對紅曲霉的代謝影響較大。

注：顯微檢測400×。Note：Micro-examination 400×.圖1 部分變異紅曲霉菌株的形態特征Fig.1 Morphological characteristics of some variation Monascus purpureus strains

2.2 變異菌株的抑菌活性

桔霉素抑菌結果顯示，各紅曲霉菌株的乙酸乙酯提取物對枯草芽孢桿菌普遍有抑菌作用，其中1YM10的抑菌圈直徑較大為1.97 cm，3YM29-1和1YM5的抑菌圈直徑較小為1 cm(圖2)。推測，1YM10的桔霉素含量較高，而3YM29-1和1YM5的桔霉素含量較低。

注：A從上至下：CK、1YM10-1、2YM4；B從上至下：CK、1YM10、3YM29-1、1YM13；C從上至下：CK、3YM5、1YM5；D從上到下：CK、3YM20、2YM10；每個樣品3次重復。Note:A from top to bottom respectively indicates CK,1YM10-1 and 2YM4;B from top to bottom indicates CK,1YM10,3YM29-1 and 1YM13 ;C from top to bottom indicates CK,3YM5 and 1YM5 ;D from top to bottom indicates CK,3YM20 and 2YM10.Each sample with three replicates.圖2 部分菌株提取物對枯草芽孢桿菌的抑菌活性Fig.2 Bacteriostatic activity of the extracts from some strains against Bacillus subtilis

2.3 變異菌株的化學成分

為進一步獲得高產色素和洛伐他汀且桔霉素含量降低的變異菌株，篩選其中7株顏色變異較小的菌株進行化學成分含量檢測顯示，野生型的桔霉素含量較高，達1.673 ng/mL，其余菌株的桔霉素含量普遍降低，其中菌株3YM29-1和1YM10的桔霉素含量最低，分別為0.309 ng/mL和0.400 ng/mL，降幅分別達81.53%和76.09%(圖3)。雖然變異菌株的桔霉素含量降低，但洛伐他汀和色素的含量無同步變化趨勢，這可能與突變的隨機性和不確定性有關。1YM10的抑菌圈較大與桔霉素含量較低的結果并不一致，推測紅曲霉提取物的抑菌活性由多種化學成分共同作用。

2.4 菌株的比較基因組測序

1YM10和3YM29-1的桔霉素含量消減效果較高，其基因組測序得出。野生型平均獲得Clean reads 21 717 777 bp，比對到參考基因組上(NCBI GenBank assembly accession:GCA_006542485.1)20 279 634 bp，比對率93.36%，測序深度109.87倍，覆蓋度大于99%；1YM10平均獲得Clean reads 17 160 064 bp，比對到參考基因組上15 989 053 bp，比對率93.18%，測序深度82.91倍，覆蓋度大于99%；3YM29-1平均Clean reads 21 906 496 bp，比對到參考基因組上20 384 768 bp，比對率93.04%，測序深度111.05倍，覆蓋度大于99%(表1)。獲得的基因組數據能夠滿足比較分析的需要。

注：A 桔霉素標準曲線；B 部分菌株化學成分含量。Note:Figure A indicates the standard curve of citrinin;Figure B indicates the chemical composition content of some strains.圖3 桔霉素標準曲線及部分菌株化學成分測定Fig.3 The standard curve of citrinin and chemical composition of some strains

表1 紅曲霉比較基因組測序數據Table 1 Sequencing data of comparative genome of Monascus purpureus

2.5 菌株的變異位點

與參考基因組相比，9個紅曲霉基因組序列上找到2 066個SNP位點和978個InDel位點，其中雜合型位點野生型有394個，1YM10有238個，3YM29-1有165個，說明各菌種的基因組并未純合穩定，大量變異位點仍處于雜合狀態，這可能是導致培養的紅曲菌落有角變的重要原因。與野生型菌株相比(圖4)，變異菌株1YM10有47個SNP和5個InDel位點，其中15個SNP導致氨基酸變異。變異菌株3YM29-1有28個SNP和13個InDel位點，其中10個SNP導致氨基酸變異。2株變異菌株存在18個SNP和4個InDel位點共有，其中僅7個SNP位點導致氨基酸變異，涉及4個蛋白序列(表2)，其中MPDQ_005104可能是磷酸轉移酶家族蛋白，MPDQ_001120可能是胞外復合體亞基sec-15類似蛋白，而MPDQ_005758(81個氨基酸)和MPDQ_006301(175個氨基酸)在UniProt和NCBI無高度同源序列，功能未知。

圖4 比較基因組SNP(左)和InDel(右)變異位點Fig.4 Mutation site comparative genomic SNP (left)and InDel (right)mutation site

表2 變異菌株共有SNP位點分析Table 2 Analysis of common SNP sites of variation strains

3 討論

紅曲霉作為許多重要藥食兩用產品的菌種，對其桔霉素含量的控制尤為重要。桔霉素有抑菌作用，可通過有機試劑萃取紅曲霉的化學成分，采用濾紙片法檢測其對枯草芽孢桿菌的抑菌活性，以初步檢驗各變異菌株的桔霉素含量[20]。有研究表明，桔霉素、紅曲色素和洛伐他汀皆源于聚酮合酶合成途徑，3種成分的含量存在一定的相關性[21]。如何既保證有較高含量的功能性成分，又最大限度消減桔霉素，是亟待解決的關鍵問題。

試驗對紫外誘變的紅曲霉菌株進行形態和化學成分分析發現，各化學成分的含量變異具有隨機性，可以獲得桔霉素大幅降低而洛伐他汀和紅曲色素含量不降的菌株，從而打破三者的連鎖關系，說明合成3種成分的分支代謝途徑不同。通過篩選獲得桔霉素含量比野生型菌株降低81.53%和76.09%的菌株3YM29-1和1YM10，但1YM10菌株對枯草芽孢桿菌的抑菌活性卻很高，推測與高含量的紅曲色素有關。因為紅曲色素作為食品添加劑也有防腐抑菌的作用[22-23]，可見抑菌活性不能簡單作為桔霉素含量高低的定性檢測方法。

比較基因組分析發現，3YM29-1、1YM10和野生型菌株均有許多雜合位點，推測這些雜合位點有的會在形態上表現出來，從而在培養和傳代的菌落上產生角變，這與紅曲菌落有角變的現象相符。與野生型相比，變異菌株3YM29-1和1YM10僅7個共有的SNP位點導致4個蛋白序列出現氨基酸變異。之前尚無關于這4個蛋白序列與桔霉素代謝關系的類似報道[24]。

4 結論

通過對紫色紅曲霉誘變處理，篩選出桔霉素含量降低81.53%的突變菌株3YM29-1。經比較基因組分析，獲得4條功能變異蛋白，分別為磷酸轉移酶家族蛋白、胞外復合體亞基sec-15類似蛋白，以及2條未知序列。獲得的低桔霉素變異菌株和挖掘的新基因為深入開展桔霉素調控研究奠定基礎。