凡納濱對蝦氣泡病的組織病理學觀察

戚瑞榮，唐紹林*，張吉鵬，崔龍波，馬家好

(1.廣州利洋水產科技股份有限公司，廣東 廣州 510515；2.廣州金水動物保健品有限公司，廣東 廣州 510515；3.煙臺大學 生命科學學院，山東 煙臺 264005)

水產動物的氣泡病在自然或養殖水體中均較常見[1-2]，但由于國內對該病的研究不多，同時在養殖過程中對該病也無明確診斷方法，導致業界對氣泡病認識不足。水產動物的氣泡病與人類潛水后發生的減壓病類似，它是由于水體中氣體過飽和或壓力、水溫變化而引起水產動物體內形成氣栓，并對機體造成損傷的一種非傳染性疾病[3-4]。水體中氣體過飽和的原因較多，自然及人為因素均可引起，因此，水產動物的氣泡病時有發生。目前，國外關于氣泡病方面的研究較多，在魚類、蝦、蟹、貝類及兩棲類中均有報道[5-14]。

氣泡病對于魚類的影響首先主要集中在眼睛部位，Grahn等[15]、Smiley等[16]、Speare[17-18]均進行了該病對魚類眼睛造成的損傷研究，這些研究表明，患氣泡病魚眼常一側嚴重突出，眼盲，且眼球組織嚴重病變，眼角膜和眼窩發生氣腫或出現氣泡，氣泡首先在眼組織脈絡膜出現。在亞急性和慢性氣泡病中，氣泡顯著位于眼周及眼球后，眼病變嚴重程度會隨著總氣體壓力的增加而增加，并伴隨視網膜下、視神經及虹膜出血，其次在魚體表、鰭、鰓等部位可以觀察到氣泡。Machova等[6]、Pauley等[19]、Espmark等[20]、彭天輝等[21]對此均有報道，他們在魚體表、鰭、口周、鰓絲表面、鰓小片內、眼等部位均觀察到了氣泡的存在。

甲殼類動物的氣泡病癥狀以觀察到動物體內的氣泡為主，Johnson[12]研究了藍蟹Callinectessapidus氣泡病及其組織病變情況，在藍蟹的鰓、心、血管、眼中均發現了氣泡，組織病變以缺血、變性為主。Lightner等[8]報道，在褐對蝦Penaeusaztecus幼體及稚蝦蝦體的甲殼下、腸腔及附近血腔內、鰓、眼柄等處均可見氣泡。Pillai等[22]研究了羅氏沼蝦Macrobrachiumrosenbergii以鰓部腫脹為主要特征的疾病，養殖戶俗稱氣球病。

本研究團隊在養殖生產過程中發現，凡納濱對蝦Litopenaeusvannamei氣泡病發生時，輕者引發蝦體行為異常，嚴重時導致死亡。甲殼動物為開放式循環系統，發生氣泡病后能存活較長一段時間，但是氣泡位于發病組織經久不消，且急性氣泡病亦可轉變為慢性氣泡病，造成對蝦應激反應，抗病力下降，并容易繼發感染其他疾病，從而影響對蝦生長甚至造成發病對蝦死亡。生產過程中，發病池塘蝦均出現每天幾尾、幾十尾至幾百尾的死亡，嚴重的甚至排塘。養殖對蝦氣泡病的高發病率及嚴重危害程度應引起足夠的重視。目前，凡納濱對蝦氣泡病的相關報道較少，特別是對養殖池塘自然發病氣泡病的報道，對該病組織病理方面也未見相關報道。本研究中，主要分析了室外土池塘養殖環境下凡納濱對蝦自然發生氣泡病的組織病變情況，從組織病變上直接觀察氣泡病，了解其致病機理，以期為診斷和防控對蝦氣泡病提供科學參考。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗用凡納濱對蝦取自廣東省珠海市凡納濱對蝦養殖土池塘，體長(6.3±1.5)cm，蝦組織內可見氣泡或氣柱，或蝦體未見氣泡但根據臨床診斷已發生氣泡病，記錄蝦塘各水體上下層溶解氧，并取健康凡納濱對蝦(體長6.1 cm±1.6 cm)作為對照。

1.2 方法

1.2.1 取樣及鏡檢 取樣池塘水深1.8 m，每日分別在水深0.2、1.6 m處實時監控養殖池塘水體溶解氧，每日8:00、15:00定點取樣一次。解剖觀察、記錄蝦體表及各組織是否有肉眼或顯微鏡鏡檢可見的氣泡，以及鏡檢有無寄生蟲等。無菌條件下，從凡納濱對蝦肝胰腺處接種細菌。取對蝦肝胰腺、鰓、肌肉組織樣品固定于體積分數為95%的乙醇中，用于蝦肝腸胞蟲及各項病毒項目的檢測。取凡納濱對蝦的兩側眼、肝胰腺、鰓、肌肉(分成前中后三段)、腸、心、觸角等組織，固定于波恩氏液中用于組織觀察，同樣方法在健康凡納濱對蝦中取對應各組織樣品進行固定，用于對照觀察。

1.2.2 細菌分離、培養及PCR檢測 將試驗對蝦進行細菌分離和病毒檢測，以排除病原生物的影響。無菌條件下，從對蝦肝胰腺處接種細菌，劃線接種于TSA培養基和TCBS培養基中，37 ℃條件下倒置培養24 h，觀察記錄結果。同時，分別取健康和患病對蝦的肝胰腺、鰓、肌肉組織，固定于體積分數為95%的乙醇中。采用酚-氯仿法抽提組織病毒DNA、RNA，進行白斑綜合征病毒、傳染性皮下及造血組織壞死病毒、對蝦桿狀病毒、蝦血細胞虹彩病毒、桃拉病毒及蝦肝腸胞蟲的檢測。

1.2.3 組織切片的制備與觀察 樣品用波恩氏液固定12～24 h后，用體積分數為70%的乙醇將波恩氏液換出，之后每隔4 h換液一次，直至溶液無黃色。常規脫水、透明、浸蠟后，將組織包埋成蠟塊，待蠟塊凝固后，將組織蠟塊用石蠟切片機切成5 μm蠟帶，展片、黏片、烘干后進行H·E染色，中性樹膠封片后，于Motic光學顯微鏡下觀察。

2 結果與分析

2.1 氣泡病凡納濱對蝦臨床特征

發生氣泡病的凡納濱對蝦體色泛紅、腹部肌肉體節間發白，發病嚴重的蝦腹部第6節肌肉發白或全身肌肉發白，鏡檢附肢、鰓絲、觸角、頭胸甲肌肉等部位可見氣柱、氣泡(圖1)。鏡檢未發現寄生蟲。

患病凡納濱對蝦體節間白濁(A)，體色發紅(B,C)，鏡檢步足(D)、第一觸角(E)、游泳足(F)可見氣柱(泡)(箭頭示)。Whitish between segments(A) and red body (B,C), gas columns(bubbles) in the periopods(D),first antennae(E) and pleopods (F)(arrow) in the diseased Litopenaeus vannamei.圖1 患氣泡病凡納濱對蝦外觀及鏡檢Fig.1 Appearance and microscopic examination of Pacific white leg shrimp Litopenaeus vannamei with gas bubble disease

2.2 細菌分離培養及電泳結果

37 ℃條件下倒置培養細菌24 h，TSA培養基和TCBS培養基上均未見細菌菌落長出。白斑綜合征病毒、傳染性皮下及造血組織壞死病毒、對蝦桿狀病毒、蝦血細胞虹彩病毒、桃拉病毒及蝦肝腸胞蟲電泳結果均呈陰性。

2.3 氣泡病凡納濱對蝦組織病變

2.3.1 肌肉組織病理變化 健康凡納濱對蝦肌肉組織及肌纖維紋路清晰、排列致密(圖2A)，而發病蝦肌束萎縮，相鄰肌束間距較大，局部肌肉組織壞死，肌纖維排列雜亂，有水腫或淤血現象，氣泡印跡明顯(圖2B～E)，并在背腹血管內散布大小不等、形態不一的氣泡(圖2F)；健康凡納濱對蝦外殼角質層、幾丁質鈣層、內皮緊密連接(圖2G)，而發病凡納濱對蝦外殼由于氣泡存在導致三者間發生分離(圖2H)，并在觸角內也可觀察到氣泡的存在(圖2I)。

A—健康凡納濱對蝦肌肉組織，肌束排列致密，肌纖維紋路清晰；B—發病對蝦肌肉組織輕微淤血，有小氣泡，肌束間距大；C—發病對蝦中明顯的氣柱將肌肉組織分隔開，肌束間距大；D—發病對蝦肌束萎縮，組織壞死，比較雜亂，淤血處有小氣泡；E—發病對蝦中較大的氣泡占據肌肉組織；F—發病對蝦背腹血管內散布大小不等的氣泡；G—發病對蝦肌束輕微萎縮，外殼角質層、幾丁質鈣層、內皮緊密相連；H—發病對蝦角質層、幾丁質鈣層、內皮被氣泡分離開；I—發病對蝦觸角內有一橢圓形氣泡；g—氣泡或氣柱。A—muscle bundles arranged densely, muscle fiber with clear lines in healthy Litopenaeus vannamei; B—slight congestion in muscle, there are small gas bubbles, with large space between muscle bundles of diseased L.vannamei; C—with large obvious gas column separates muscle, with large muscle bundle spacing of diseased L.vannamei; D—muscle bundle atrophy, tissue necrosis, more disordered, and small gas bubbles in blood of diseased L.vannamei; E—larger gas bubbles occupy in muscle of diseased L.vannamei; F—different sizes of bubbles are scattered in dorsal and abdominal blood of diseased L.vannamei; G—muscle bundles atrophy slightly, keratinous layer, chitin calcium layer, and endothelium of shell are closely linked of diseased L.vannamei; H—keratinous layer, chitin calcium layer, and endothelium separated by gas bubbles in the diseased L.vannamei; I—an elliptical gas bubble in the antenna of diseased L.vannamei; g—gas bubble or gas column.圖2 凡納濱對蝦肌肉和觸角組織病理變化Fig.2 Histopathological changes in muscle and antennae of Pacific white leg shrimp Litopenaeus vannamei

2.3.2 鰓組織病理變化 健康凡納濱對蝦鰓組織為枝狀鰓，鰓絲有多級分支(圖3A)；發病凡納濱對蝦鰓組織多發生水腫、淤血、出血現象，大量的液體成分充塞鰓組織，H·E染色呈紅色(圖3B-E)；發病鰓組織外圍及中間均可觀察到較大的氣泡擠壓周圍組織細胞(圖3B、C)，鰓小片上皮內也觀察到氣泡，一個鰓小片內可見1～2個圓形氣泡(圖3D、E)，鰓軸血管內散布多個大小不等的氣泡，較大氣泡的直徑與鰓軸直徑平齊，充塞于血管(圖3F)。

A—健康凡納濱對蝦鰓組織，枝狀鰓、多級分支；B—發病對蝦鰓組織淤血、出血、水腫，外圍集中分布大小不等的圓形或橢圓形氣泡，擠壓周圍組織細胞；C—發病對蝦鰓組織淤血、出血、水腫，有一較大圓形氣泡占據鰓片中間；D—發病對蝦鰓組織水腫、淤血、出血，鰓小片上皮內多量球樣氣泡；E—發病對蝦鰓上皮內氣泡；F—發病對蝦鰓軸血管內散布多個氣泡；g—氣泡。A—dendritic branchia and multi-level branches gill tissue of healthy Pacific white leg shrimp Litopenaeus vannamei; B—gill congestion, hemorrhage and edema, peripheral distribution of circular or oval bubble, and squeezing surrounding tissue cells in diseased L.vannamei; C—gill congestion, hemorrhage and edema, and a large round bubble occupies the middle gill in diseased L.vannamei; D—gill edema, congestion and hemorrhage, and a lot of bulbous bubbles in the branchial epithelium in diseased L.vannamei; E—intraepithelial bubbles gill in diseased L.vannamei; F—multiple bubbles scattered in the branchial axis vessels of diseased L.vannamei; g—gas bubbles.圖3 凡納濱對蝦鰓組織病理變化Fig.3 Histopathological changes in gills of Pacific white leg shrimp Litopenaeus vannamei

2.3.3 肝胰腺組織病理變化 健康凡納濱對蝦肝胰腺為一個個腺管構成的復管狀腺，各腺管緊密相鄰，管腔為四角形或五角形，管壁由4種類型的細胞構成，根據形態可分為分泌細胞、吸收細胞、纖維細胞和胚細胞(圖4A，胚細胞主要位于組織邊緣的腺管內，分化形成其他類型的細胞，圖中未顯示)；發病凡納濱對蝦肝胰腺組織腺管間偶爾可觀察到氣泡，腺管萎縮較重，腺管間距變大，不再逐個緊密相鄰，腺管上皮脫離基底膜，上皮細胞類型不可分辨，腺管間有少量細胞增生(圖4B)。

A—健康凡納濱對蝦肝胰腺，由多級分支的腺管組成，管腔呈五角形或四角形，Bc—分泌細胞，Rc—吸收細胞，Fc—纖維細胞;B—發病凡納濱對蝦腺管萎縮嚴重，腺管間少量細胞增生，管壁上皮細胞類型無法區分，腺管間可觀察到氣泡；g—氣泡。A—hepatopancreas of healthy Litopenaeus vannamei consists of glandular ducts with multiple branches, and the lumen is pentagonal or quadrangular in shape, Bc—secretory cells，Rc—absorbent cells，Fc—fibroblast; B—the glandular ducts atrophy severely, a small number of cells proliferate between the glandular ducts, the types of epithelial cells are not distinguished, and gas bubbles are observed between the glandular ducts in the diseased L.vannamei; g—gas bubbles.圖4 凡納濱對蝦肝胰腺組織病理變化Fig.4 Histopathological changes in hepatopancreas of Pacific white leg shrimp Litopenaeus vannamei

2.3.4 心組織病理變化 健康凡納濱對蝦心組織由肌纖維及血淋巴組成(圖5A)；發病凡納濱對蝦心部分肌纖維被氣泡和氣柱占據，組織中形成較大的空白區域(圖5B)，有部分樣品心組織還可見淤血比較嚴重的現象。

A—健康凡納濱對蝦心組織；B—發病凡納濱對蝦心組織，大的氣泡和氣柱占據心肌;g—氣泡和氣柱。A—heart of healthy Litopenaeus vannamei; B—heart, and large gas bubbles and gas columns occupied the myocardium in diseased L.vannamei; g—gas bubbles and gas columns.圖5 凡納濱對蝦心組織病理變化Fig.5 Histopathological changes in heart of Pacific white leg shrimp Litopenaeus vannamei

2.3.5 眼組織病理變化 健康凡納濱對蝦的眼為復眼，由許多小眼組成，小眼又由角膜、晶狀體、小網膜細胞等構成(圖6A)；發病蝦兩側眼組織出現不同程度的空泡化，常一側眼組織空泡化較重(圖6B、C)，有時也可觀察到較大的氣泡擠壓眼組織(圖6B)。但發病對蝦腸組織未見明顯異常。

A—健康凡納濱對蝦眼組織；B～D—發病凡納濱對蝦眼組織,眼組織內有一較大氣泡(B)，一側眼組織空泡化嚴重(D)，一側眼組織輕微空泡化(C)，比較正常；g—氣泡。A—eye of healthy Litopenaeus vannamei; B-D—eyes of diseased L.vannamei: one big gas bubble in the eye(B), vacuolization of one eye is serious (D), and the other one is slightly vacuolated(C), relatively normal; g—gas bubble.圖6 凡納濱對蝦眼組織病理變化Fig.6 Histopathological changes in eyes of Pacific white leg shrimp Litopenaeus vannamei

2.4 不同溶解氧值下患氣泡病凡納濱對蝦組織病變比較

從蝦池塘取樣測得上下層水體溶解氧范圍為4.15～15.06 mg/L，溶解氧飽和度為56%～293%(上層水體溶解氧為4.56～15.06 mg/L，下層水體溶解氧為4.15～12.06 mg/L)，不同溶解氧值下患氣泡病凡納濱對蝦組織病變差異較明顯的是眼和鰓組織。

當上、下層水體溶解氧分別為5.85、4.15 mg/L時，患病對蝦眼組織輕度空泡化且僅在眼球外圍發生空泡化，空泡范圍約占據晶狀體束的1/2(圖7A)；當上、下層溶解氧分別為15.06、4.86 mg/L時，眼組織嚴重空泡化，小網膜細胞外及整個晶狀體束均空泡化(圖7B)。當上、下層水體溶解氧分別為4.56、4.46 mg/L時，患病對蝦鰓組織僅在鰓絲血管內可見個別氣泡印跡(圖7C)；當上、下層水體溶解氧分別為14.27、5.86 mg/L時，鰓組織不僅在血管內可見氣泡印跡，在鰓絲上皮亦可見多個氣泡印跡(圖7D)。這表明，水體溶解氧越高，對蝦的眼組織和鰓組織損傷就越大。

A、B—眼組織，A—上、下層水體溶氧分別為5.85、4.15 mg/L，B—上、下層水體溶氧分別為15.06、4.86 mg/L；C、D—鰓組織，C—上、下層水體溶氧分別為4.56、4.46 mg/L，D—上、下層水體溶氧分別為14.27、5.86 mg/L；箭頭示氣泡印跡。A,B—eyes; A—the dissolved oxygen levels of upper and lower water bodies are 5.85 and 4.15 mg/L respectively, B—the dissolved oxygen levels of upper and lower water bodies are 15.06 and 4.86 mg/L respectively;C,D—gills;C—the dissolved oxygen levels of upper and lower water bodies are 4.56 and 4.46 mg/L respectively, and D—the dissolved oxygen levels of upper and lower water bodies are 14.27 and 5.86 mg/L respectively.圖7 不同溶解氧值下患病凡納濱對蝦組織病理變化(氣泡變化趨勢)Fig.7 Histopathological changes in diseased Pacific white leg shrimp Litopenaeus vannamei at different dissolved oxygen values(the trend of bubble change)

3 討論

3.1 氣泡對患病凡納濱對蝦組織的影響及危害

本研究中觀察發現，在患氣泡病凡納濱對蝦的肌肉、鰓、觸角、心、肝胰腺、鰓血管、背腹動脈中均有不同數量的氣泡。同時，多組織可見氣泡印跡取代原有組織，尤其是肌肉組織，氣泡印跡多集中于腹部中后段，體積較大，可占據約2/3肌束面積(橫切面)。同時，患病蝦肌肉組織局部有壞死，表現為肌纖維紋路消失、核固縮等。肌肉組織的這些病變，會導致眼觀肌肉發白，這也就解釋了發生氣泡病的凡納濱對蝦經常出現腹部肌肉發白，尤其是腹部第6節肌肉白濁的現象。

本研究中，發病對蝦心臟組織也常觀察到被大氣泡占據心肌纖維導致心臟組織出現大面積空白區域的情況，且有些病蝦心組織淤血嚴重，這些病變會影響凡納濱對蝦正常的血液循環。氣泡病凡納濱對蝦鰓組織水腫、淤血、出血，導致鰓浸潤于液體中，所以眼觀發病蝦鰓組織常見顏色發白、腫脹。同時，在鰓軸血管內可觀察到多量的氣泡，有些氣泡直徑較大且與鰓軸直徑平齊，直接堵塞鰓血管，嚴重影響對蝦血液循環及呼吸功能，從而造成對蝦呼吸困難而上浮水面。Johnson[12]將藍蟹暴露于空氣過飽和的水中，在藍蟹的鰓、心、血管、眼中均發現氣泡，組織病變以缺血、變性為主，且發現存活藍蟹受損最嚴重的是心和鰓組織，組織中可見氣泡栓塞，尤其鰓組織中的氣泡栓塞在暴露之后35 d仍然存在。

Lightner等[8]研究發現，升溫及降壓均可引發褐對蝦幼體及稚蝦氣泡病，患病蝦行為異常、游泳無方向，蝦昏迷、漂浮于水面，在蝦體的甲殼下、腸腔及附近血腔內、鰓、眼柄等處均可見氣泡。本研究中發現，在凡納濱對蝦眼組織神經區域及眼柄內也常有氣泡，且凡納濱對蝦眼睛常一側組織空泡化嚴重，分析認為是氣泡擠壓眼部神經進而引起對蝦游泳異常。

患病凡納濱對蝦背腹動脈血管內血液中存在大量大小不一、形態不同的氣泡，導致發病蝦血液如同泡沫一樣，影響對蝦血液循環。這與其他學者在魚類氣泡病中的研究結果相一致[7,23]。

3.2 凡納濱對蝦急性、慢性氣泡病的診斷

急性氣泡病發生時，凡納濱對蝦有較明顯的臨床癥狀，如游塘、跳躍、上浮，肌節間發白或肌肉發白等，肉眼觀察或鏡檢對蝦，在其體表、殼下、附肢、鰓、觸角等處可見氣泡，蝦持續性死亡，每天死亡幾尾、幾十尾至幾百尾，嚴重時甚至出現排塘，再結合天氣及水質情況可以判斷對蝦是否發生了氣泡病[2,24]。而慢性氣泡病較難發現和診斷，慢性氣泡病發病時，一般較難在現場用肉眼和顯微鏡觀察到蝦體內的氣泡，但通過組織切片觀察，可在鰓、肌肉、眼、肝胰腺等組織觀察到氣泡印跡，再根據天氣和水質情況進行確診，如陰雨后晴天、連續晴好高溫天氣、早晚溫差較大時，或者水體溶解氧和pH值較高、藻類突然大量繁殖等情況。

發生慢性氣泡病的凡納濱對蝦水體溶解氧飽和度不高，鏡檢活體未發現明顯氣泡，但其組織切片觀察顯示，肌肉、鰓等組織中有氣泡印跡，只是比鏡檢可見明顯氣泡的蝦組織中的氣泡印跡少。隨著溶解氧飽和度升高，鰓組織氣泡有增多、變大的趨勢；溶解氧飽和度較低時，眼組織常一側病變稍重，隨著溶解氧值的升高，空泡化趨向嚴重；溶解氧飽和度較高時，兩側眼組織空泡化均較為嚴重。

4 結論

1)患氣泡病凡納濱對蝦體表微紅，肌節間及肌肉發白，附肢、鰓絲、觸角、肌肉等部位鏡檢其內部可見氣泡或氣柱。對蝦養殖期間若觀察到上述外觀癥狀，則表明氣泡病已經發生并影響蝦體。

2)患氣泡病凡納濱對蝦組織病變特征以組織中出現氣泡印跡為主，肌肉、眼、鰓、肝胰腺、觸角、心等組織、器官均可見氣泡印跡，相比較而言，鰓、肌肉組織中氣泡印跡更明顯，鰓血管內氣泡亦比較明顯，有些占據整個血道。根據上述組織病變特征可以確診對蝦是否患有氣泡病。

3)水體溶解氧越高，患氣泡病的對蝦鰓、眼組織病變程度越嚴重，養殖過程中應注意隨時監測水體溶解氧的變化。