乳清對馬蘇里拉奶酪成熟過程中蛋白質降解的影響

張榮榮，白芳芳，原倩倩，于鈺杰，李坤學，馬玲

(山西農業大學 食品科學與工程學院，山西 晉中 030600)

馬蘇里拉奶酪是Pasta Filata(拉伸型)的一種。這類奶酪在制作過程中都要經歷一個獨特的熱燙拉伸過程，從而使它們具備纖維狀的蛋白結構以及融化拉絲的功能特性[1]。馬蘇里拉奶酪的做法是將水牛乳與奶牛乳混合制成混合乳，并在制作后期將凝結好的奶酪凝塊放入熱水中熱燙，并對奶酪團進行拉伸，從而形成具有拉絲性和彈性的奶酪。熱燙拉伸使得奶酪凝塊具有良好的延展、拉伸能力，賦予其獨特的口感與特點。與其他品種的奶酪相比，馬蘇里拉奶酪不但具有與其他普通奶酪相同的營養成分，在營養上具有低膽固醇、低卡路里、低碳水化合物、高活性物質含量的特點[2]。

西方國家因其干酪市場發展較為成熟，所以更為重視乳清的回收和再利用，并且對乳清的再利用能力也取得了較大的發展[3]，主要是將乳清進行脫鹽并分級干燥后制作乳清粉和乳清蛋白粉，也有利用乳清進行發酵制作乳酸。而國內有報道開發乳清飲料或將乳清作為配料制作糕點等。有關直接將乳清通過加熱濃縮并制作乳清奶酪的報道較多[4]，還有將乳清酸化后制作奶酪的報道，也有將乳清和牛奶混合制作乳奶酪的報道[5-7]，此外，有報道在奶酪制作過程中添加乳清蛋白對其品質的影響[8-9]，還有報道加入乳清蛋白、大豆蛋白對奶酪成熟過程中品質的影響[10-13]。但隨著奶酪市場的不斷擴大，如何合理利用乳清成為亟待解決的問題?？傮w來說，目前我國乳清的再利用和相關產業尚處于起步階段，回收乳清并對其進行再利用的產業相對不成熟，市面上功能性明確、技術含量較高的乳清蛋白質保健品較少[14]，可將乳清用于其他行業的產品的技術較為匱乏，還不能實現高效、多種類的乳清回收再利用和大規模生產。

制作馬蘇里拉奶酪過程中排出的副產物乳清，除含有乳清中本含有的基本營養成分外，仍保留一部分制作奶酪時必需的凝乳酶，同時乳清中含有乳清蛋白、礦物質等營養物質，具有極高的經濟價值和營養價值[15]。本課題通過在奶酪制作過程中加入乳清制作乳清奶酪，以不添加乳清奶酪為對照，通過探究成熟期內添加乳清后的奶酪與不添加乳清的奶酪酸度、蛋白含量的變化，以及成熟期內蛋白降解程度和氨基酸含量的差異，分析添加乳清對奶酪的影響，為豐富馬蘇里拉奶酪的制作工藝以及對奶酪中乳清的再利用提供了一定的理論基礎。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

發酵劑：Streptococcussalivariussubsp.thermophilus(唾液鏈球菌嗜熱亞種)CH9；Lactobacillusdelbrueckiisubsp.bulgaricus(保加利亞乳桿菌德氏亞種)LB；凝乳酶(活力 1∶150000 U)：丹尼斯克(中國)有限公司；鮮牛乳：購于當地牧場，各項指標符合要求；乳清：奶酪副產物；食鹽：購于太谷家家利超市。

1.2 主要試劑

三氯乙酸、硫酸錳、硫酸鎂、硫氰酸鉀、硝酸銀、冰醋酸、硼酸(均為分析純)：購自天津市申泰化學試劑有限公司；醋酸鈉、硫酸鐵銨：天津市博迪化工有限公司；無水硫酸銅、P-磷酸甘油二鈉：天津市津北精細化工有限公司；鹽酸、硫酸鉀：天津市致遠化學試劑有限公司；硫酸、硝酸：成都市科龍化工試劑廠；氫氧化鈉：北京華騰化工有限公司；抗壞血酸：天津市恒興化學試劑制造有限公司；聚山梨酯-80：上海江萊生物科技有限公司；乙醇：天津市盛淼精細化工公司；氯化鈉：上海華星化工廠。

1.3 主要儀器設備

KDN-08消化爐 上海新嘉電子有限公司；VORTEX-5漩渦混合器 其林貝爾儀器制造有限公司；LD5-2B低速離心機 北京雷勃爾醫療器械有限公司；BVPJ-500TS真空包裝機 艾博科技有限公司；238-10超凈工作臺 蘇州蘇凈集團；凱氏定氮裝置 上海精密儀器有限公司；BS224S電子分析天平 北京賽多利斯儀器有限公司；CM-5全自動色差儀 日本Konica Minolta公司；ST2100實驗室pH計 奧豪斯儀器有限公司；HH-S8電熱恒溫水浴鍋 北京科偉永興儀器有限公司；DHG-9243BS-Ⅲ電熱恒溫鼓風干燥箱 上海新苗醫療器械制造公司；DYY-6C型電泳儀 北京六一生物科技有限公司；L-8900氨基酸分析儀 日本日立公司。

1.4 實驗方法

1.4.1 馬蘇里拉奶酪的制作

新鮮牛乳→標準化→殺菌(63 ℃，30 min)→冷卻(至42 ℃)→添加發酵劑(0.5%，體積比)→加凝乳酶(3‰，體積比，1%食鹽水配成1%溶液)→凝乳(30 min)→切割(1.7 cm3立方塊)→排除乳清(pH值6.3)→堆釀(42 ℃，1 h)→加1.7%的鹽進行揉和→熱燙、拉伸(90 ℃，8%食鹽水)→冷卻(常溫)→真空包裝→成熟(4 ℃，90 d)。

添加乳清的馬蘇里拉奶酪的制作除在加入凝乳酶之前加入原料乳體積25%的乳清，其他工藝與馬蘇里拉奶酪的制作工藝相同。

1.4.2 pH值的測定

pH的測定：取4 ℃預儲樣品1 g置于研缽內，加蒸餾水10 mL，研磨后用pH計測定[16]，測定3次取平均值。

1.4.3 水分活度的測定

將樣品切成細碎的小顆粒，使用水分活度儀直接測定[17]，測定3次取平均值。

1.4.4 色澤的測定

使用CM-5全自動色差儀測定，指標以亨利系數表示[18]，測定3次取平均值。

1.4.5 蛋白質含量的測定

參考GB 5009.5-2016中的凱氏定氮法測定。

1.4.6 pH 4.6可溶性氮(pH 4.6 SN)的測定

測定方式溶液配制、結果計算參考劉金博的方法[19]，測定3次取平均值。

1.4.7 12%三氯乙酸溶液中可溶性氮(12% TCA-SN)的測定

參考Bertola N C等的方法[20]，測定3次取平均值。

1.4.8 SDS-PAGE凝膠電泳

本實驗主要是用SDS-PAGE凝膠電泳的方法來確定不同奶酪樣品中蛋白質的相對質量范圍，并對其進行分離。將奶酪樣品用水研磨溶解后，將溶液的蛋白含量調整為2 mg/mL，加入樣品緩沖液、β-巰基乙醇混合均勻并加熱煮沸(目的是加強SDS與蛋白的結合)[21]，煮后立即放入冷水中將其冷卻，冷卻后加入0.05%溴酚藍20 μL，將混合液振蕩均勻，取10 μL混合溶液進樣。濃縮膠電壓 100 V，分離膠電壓 150 V，電泳完成后將凝膠放入固定液中固定，然后用考馬斯亮藍G250染色，染色結束后進行脫色。

1.4.9 游離氨基酸的測定

奶酪游離氨基酸水溶液的提取方法、氨基酸自動分析儀的分析條件均參照GB 5009.124-2016進行測定。

2 結果與分析

2.1 不同奶酪成熟期內pH值的變化

由圖1可知，對照奶酪在0 d時的pH值為6.48，當成熟期達到90 d時，pH值為5.77。乳清奶酪在成熟期0 d時的pH值為6.44，當成熟期達到90 d時，pH值為5.60。整體來看，無論是對照奶酪，還是乳清奶酪，在成熟期內的pH值均呈現出下降的趨勢，在成熟期內pH下降主要是奶酪中乳酸菌在發酵過程中產生大量乳酸，致使pH值下降。另外，在成熟過程中奶酪中微生物與奶酪中凝乳酶降解脂肪并產生脂肪酸也是導致成熟期奶酪pH下降的原因[22]。0～30 d內兩種奶酪的pH值均處于較高的水平，這是因為前期乳糖代謝有限，致使其成熟初期pH值仍較高。0～30 d內乳清奶酪的pH下降幅度小于對照奶酪，其原因是乳清奶酪的蛋白含量高于對照奶酪，在凝乳酶和微生物作用下分解出堿性氨基酸，而60 d后，隨著微生物對乳清的利用和發酵作用的增強，導致乳清奶酪的pH下降幅度更大。

圖1 不同奶酪成熟期內pH值的變化Fig.1 The changes in pH values of different cheese during maturation

2.2 不同奶酪成熟期內水分活度的變化

由圖2可知，對照奶酪和乳清奶酪在奶酪的成熟期間水分活度總體呈下降趨勢。在成熟期0～30 d區間內，水分活度的降低程度大，隨后水分活度的減少幅度逐漸放緩，且在奶酪成熟過程中的任何時期，乳清奶酪的水分活度均高于對照奶酪。成熟90 d時，對照奶酪的水分活度減少了2.3%，乳清奶酪的水分活度減少了2%。

圖2 不同奶酪成熟期內水分活度的變化Fig.2 The changes in water activity of different cheese during maturation

成熟末期的奶酪相較于初期，內部水分含量大幅減少，水分活度也會因此降低。其原因從微觀來看，是成熟過程中脂肪與蛋白質在微生物及酶的作用下不斷降解，導致化學鍵斷裂，此時脂肪與蛋白質的降解產物與內部游離水結合形成新的結構，游離水含量勢必降低，該現象的出現直接導致了水分活度的降低[23]。宏觀來講，因馬蘇里拉奶酪加工時進行的熱燙處理會導致奶酪中形成細小的空洞，導致水分蒸發，造成水分流失，致使水分活度降低。而后下降幅度放緩是因為隨著成熟時間的延長，奶酪表層逐漸硬化，形成了一層外殼，阻止其內部水分繼續蒸發，因此在成熟后期，奶酪的水分活度下降趨勢明顯放緩[24]。乳清奶酪總體水分活度高于對照奶酪，是由于在奶酪制作過程中，乳清奶酪將一部分乳清添加進奶酪中，致使乳清奶酪相較于對照奶酪水分活度更高。

2.3 不同奶酪成熟期內色澤的變化

由圖3可知，對照奶酪與乳清奶酪的L*值在成熟期0～30 d內均呈現大幅度下降的趨勢，表明奶酪的亮度下降。在成熟期30～90 d內，對照奶酪與乳清奶酪的L*值趨于穩定，且在同成熟期內，乳清奶酪的亮度明顯高于對照奶酪。成熟期內奶酪的L*值不斷減小，主要原因是成熟期內奶酪中蛋白質的水解作用，使奶酪內部的酪蛋白膠粒結構強度下降，進而導致光在奶酪中的反射與散射能力變得很弱。膠粒結構強度的下降使得原本包裹在膠粒結構中的脂肪分子滲透出來，并在滲透出來的脂肪分子中脂溶性色素的作用下，導致奶酪的亮度下降。因乳清奶酪整體蛋白質含量高于對照奶酪，所以乳清奶酪的亮度要高于對照奶酪。

圖3 不同奶酪成熟期內L*值的變化

在圖4可知，在0～30 d的奶酪成熟期內，對照奶酪與乳清奶酪的b*值均出現了大幅度的下降。而后在30～60 d的奶酪成熟期中，兩種奶酪的b*值呈上升趨勢，且乳清奶酪的b*值上升幅度明顯高于對照奶酪的b*值上升幅度。而后在60～90 d內，b*值的變化趨勢趨于穩定?？傮w來看，除成熟期30 d外，乳清奶酪的b*值整體高于對照奶酪。且兩種奶酪的b*值整體呈現先下降后上升最后趨于穩定的變化趨勢。奶酪的b*值在成熟期間先減小后增大，主要是因為成熟前期奶酪中蛋白、脂肪等種類物質間發生了相互作用，致使奶酪的質地趨于均勻，進而導致奶酪的黃度下降。在奶酪成熟時間變長的過程中，加速了奶酪中蛋白質的水解，包裹于酪蛋白網狀結構內部的脂肪隨著結構強度的下降脫離出來，所以黃度上升。同一成熟期，乳清奶酪的蛋白降解程度高于對照奶酪，原先包裹在酪蛋白膠束結構中的脂肪分子較對照奶酪中脂肪分子的滲透量更多，導致乳清奶酪的黃度高于對照奶酪。

圖4 奶酪成熟期內b*值的變化Fig.4 The changes in b* values of different cheese during maturation

2.4 不同奶酪成熟期內蛋白質的變化

2.4.1 不同奶酪成熟期內總氮含量的變化

由圖5可知，對照奶酪的初始總氮含量為26.34%，乳清奶酪的初始總氮含量為28.64%。30 d時乳清奶酪的總氮含量下降至27.33%，對照奶酪的總氮含量下降至25.43%，60 d時兩種奶酪的總氮含量均出現了小幅度的增加，當奶酪成熟期達到90 d時，兩種奶酪的總氮含量小于初始值?？傮w來看，兩種奶酪在0～90 d內總氮含量的變化呈現先下降而后小幅度上升的趨勢，且整個成熟期內乳清奶酪的總氮含量明顯高于對照奶酪(P<0.05)。這種現象的出現主要是乳清奶酪在制作時添加了一部分乳清，而乳清中含有乳清蛋白，所以其蛋白總量要高于對照奶酪。

圖5 不同奶酪成熟期內總氮含量的變化

2.4.2 pH 4.6可溶性氮和12%三氯乙酸可溶性氮

在奶酪成熟過程中，奶酪中的凝乳酶、奶酪中微生物產生的內源酶及其他外部因素共同作用使奶酪中的蛋白質發生水解，其程度通過pH 4.6可溶性氮的變化進行描述。

pH 4.6可溶性氮(SN)的組成物質主要為大分子肽類，大分子肽是成熟過程中酪蛋白在凝乳酶、奶酪中乳酸菌產生的蛋白分解酶以及血纖維蛋白酶共同作用下生成的。故可溶性氮受奶酪中凝乳酶添加量及其活性的影響，能夠直觀地體現出蛋白的降解，奶酪的成熟度由其水溶性氮與總氮之比來體現，因此，pH 4.6可溶性氮可作為奶酪成熟情況的重要考察指標[25-28]。 12%三氯乙酸可溶性氮(TCA-SN)為小肽和氨基酸類的氮，反映奶酪成熟過程中蛋白降解的程度。

由圖6可知，對照奶酪與乳清奶酪在成熟期內的pH 4.6可溶性氮隨著成熟時間的增加呈上升趨勢，其中乳清奶酪在成熟期內pH 4.6可溶性氮含量均高于對照奶酪，其原因可能是乳清奶酪添加的乳清內含有凝乳酶，與奶酪制作時添加的凝乳酶協同作用，促進了蛋白質的水解，且乳清本身營養物質含量高，能夠為奶酪中微生物的生長繁殖提供幫助，可以促進奶酪中微生物的生長代謝，進而有利于對蛋白質的降解，使得成熟期內任何時期乳清奶酪的pH 4.6可溶性氮含量均高于同時期對照奶酪的pH 4.6可溶性氮含量。

圖6 不同奶酪成熟期內pH 4.6 SN含量的變化

由圖7可知，在整個成熟期內，乳清奶酪與對照奶酪的12% TCA-SN含量均呈現上升趨勢，在成熟后期，上升趨勢放緩，且在任意成熟時間內，乳清奶酪的12% TCA-SN含量均高于對照組奶酪，其變化趨勢與乳清奶酪和對照奶酪總氮含量、pH 4.6可溶性氮含量的變化趨勢相吻合，乳清奶酪相較于對照奶酪有更高的蛋白含量，另外乳清奶酪中添加的凝乳酶能夠促進成熟期內蛋白的降解，且乳清可以被奶酪中的微生物利用，使其在成熟期內的12% TCA-SN含量增加，成熟后期12% TCA-SN含量的上升趨勢放緩，原因可能是發酵后期奶酪內微生物的活力及數量均低于成熟前期[29]，且奶酪在成熟期內蛋白降解致使發酵后期大分子的蛋白含量較發酵前期減少，則使得成熟后期12% TCA-SN的上升趨勢放緩[30-32]。

圖7 不同奶酪成熟期內12% TCA-SN含量的變化

2.4.3 不同奶酪成熟期內蛋白降解SDS-PAGE分析

使用SDS-PAGE電泳考察奶酪成熟期內蛋白質的降解情況。SDS-PAGE依靠不同蛋白片段和肽片段分子量的不同將其以條帶形式分布排列出來，條帶顏色的深淺反映該種蛋白或肽片段含量的多少。不同工藝奶酪在不同成熟時間的SDS-PAGE電泳見圖8。圖8中包含3條主要條帶，代表了3種不同類型的酪蛋白，Zone 1主要包含β-酪蛋白，Zone 2主要為αs-酪蛋白，Zone 3主要包含k-酪蛋白。

圖8 不同奶酪成熟期內蛋白降解的變化Fig.8 The changes in protein degradation of different cheese during maturation

由圖8可知，在成熟0 d時，對照奶酪與乳清奶酪中Zone 1、Zone 2條帶顏色深，代表該成熟期內β-酪蛋白與αs-酪蛋白含量高，這是由于成熟初期，奶酪中凝乳酶、微生物產生的酶對蛋白降解有限，且該成熟期內乳清奶酪較對照奶酪條帶顏色更深，由此可說明乳清奶酪中兩種蛋白的含量高于對照奶酪。當成熟期為30 d時，兩種奶酪Zone 1、Zone 2、Zone 3條帶顏色與0 d時相比變淺，這說明此時期奶酪隨著內部微生物數量的增加，蛋白開始由奶酪中微生物與其他酶類物質協同作用被逐步降解，導致條帶顏色變淺[33-35]。成熟期60 d時，條帶顏色持續變淺，表明此階段的奶酪內部蛋白降解作用增強，大分子蛋白被分解為小分子蛋白或肽片段，致使此階段各區域條帶顏色變淺。凝乳時間達到90 d時，對照奶酪各區域條帶顏色進一步變淺，說明在成熟末期奶酪中蛋白逐漸降解為小分子肽類等物質，乳清奶酪在該階段條帶顏色仍較深，其原因可能是相較于對照奶酪，乳清奶酪中乳清蛋白含量更高，能夠形成乳清蛋白中的酪蛋白纖維聚合物，使其交聯程度較對照奶酪更加緊密，導致其條帶顏色更深。

續 表

2.5 不同奶酪成熟期內游離氨基酸含量的變化

由表1可知，總計分離出15種氨基酸，且不同種類氨基酸含量存在差異。在奶酪成熟初期，兩種工藝制作的奶酪氨基酸含量均呈現出上升的趨勢。成熟初期，奶酪中氨基酸含量的升高是由于奶酪中蛋白質的遞進式分解。成熟0 d時，蘇氨酸、谷氨酸、丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸和精氨酸的含量較高，其中精氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸及亮氨酸主要呈現苦味，谷氨酸呈現微酸味，而蘇氨酸、纈氨酸、丙氨酸則呈現甜、鮮、苦味，在成熟0 d時，上述氨基酸的含量高，使得奶酪在此成熟時期呈現甜、鮮、苦、酸多種風味。且在該成熟時期，對照奶酪和乳清奶酪中均未檢出賴氨酸。賦予苦味的氨基酸由酪蛋白產生，是由于酪蛋白在奶酪中微生物產生的酶的降解以及制作奶酪時添加的凝乳酶與酪蛋白的水解協同作用所致。成熟30 d時，兩種奶酪均檢出賴氨酸，且其余的氨基酸較成熟0 d時均呈現出大幅度的上升，其中谷氨酸、亮氨酸的含量較高。當奶酪成熟至60 d時，除了蘇氨酸、苯丙氨酸外，其余氨基酸含量均呈現出不同幅度的下降?？傮w來看，兩種奶酪中氨基酸總含量隨著凝乳時間的增加呈現小幅度下降的趨勢。通過觀察不同種類的氨基酸在成熟過程中的變化趨勢可以發現，隨著成熟時間的增加，并不是所有種類氨基酸的含量都隨著奶酪成熟期的延長而增加。除蘇氨酸、苯丙氨酸的含量隨著成熟時間的增加而增加外，其他氨基酸在成熟期30～90 d內，其氨基酸含量均呈現出先下降后上升的趨勢，其原因可能是奶酪中的微生物活動所產生的酶將奶酪中的氨基酸轉化成了其他類型的物質，然后隨著凝乳時間的增加，微生物的活性降低，蛋白質的降解程度不斷增加，致使發酵后期奶酪中氨基酸的含量再次呈現上升的趨勢。

表1 不同奶酪成熟期內游離氨基酸含量的變化

3 結論

為充分利用乳清中的營養成分和殘留的凝乳酶，降低奶酪制作過程中凝乳酶的使用量，節約制作成本，本實驗通過對比添加乳清的馬蘇里拉奶酪和不添加乳清的馬蘇里拉奶酪在成熟期(0，30，60，90 d)內理化性質、蛋白質含量和氨基酸含量等指標的變化和差異進行分析，探究添加乳清對馬蘇里拉奶酪成熟過程中蛋白降解的影響。試驗得出如下結論：

在成熟期內兩種奶酪的pH、蛋白含量、水分含量隨著成熟時間的增加呈下降的趨勢，奶酪的L值下降，b值先下降而后小幅度上升，pH 4.6 SN和12% TCA-SN隨著成熟時間的增加呈現上升的趨勢，奶酪中總氨基酸的含量呈先上升再小幅下降而后又上升的波動式變化。與對照奶酪相比，乳清奶酪在成熟期內pH值更低，蛋白質含量、pH 4.6 SN和12% TCA-SN含量更高，水分活度較高，色澤指標L*值、b*值較高，總氨基酸含量及每種氨基酸含量均高于對照組的馬蘇里拉奶酪。