替加環素對耐甲氧西林金黃色葡萄球菌生物膜的清除作用

袁春妹 張能華* 傅躍青 陳興英 金燁 沈曉華

金黃色葡萄球菌（staphylococcus aureus，SA）是一類寄居于人類呼吸道、鼻咽部及皮膚的條件致病菌，是導致醫院感染的主要病原體之一。耐甲氧西林金黃色葡萄球菌（methicillin resistant staphylococcus aureus，MRSA）對大環內酯類、慶大霉素等常見抗菌素的耐藥率＞80%，對目前上市的所有β-內酰胺類藥物耐藥［1］，故MRSA被稱為“超級細菌”。研究顯示，金黃色葡萄球菌感染與導管及其他醫療設備感染相關［2］，80%的假體感染是由葡萄球菌引起［3］，而且這些感染均與其形成的生物膜相關，當金黃色葡萄球菌以生物膜的形式存在，其耐藥性和致病性大大增加，治療和根除更加困難。替加環素是新一代的甘氨酰環類抗菌藥物，抗菌譜廣且安全有效，在一定程度上還能破壞鮑曼不動桿菌的生物膜，但有關于替加環素與金黃色葡萄球菌生物膜的研究較少。本文主要探討不同濃度替加環素對MRSA生物膜的作用及其機制，為臨床治療及院感防控提供依據。

1 資料與方法

1.1 一般資料 納入研究的30株MRSA均來自于2013年1月至2017年12月浙江中醫藥大學附屬嘉興市中醫院的住院患者，同一患者同一部位分離出的重復菌株不重復計入。質控菌株：鉛黃腸球菌ATCC700327和金黃色葡萄球菌ATCC29213均購自衛生部臨床檢驗中心。

1.2 儀器與試劑 VITEK-Compact2型全自動微生物分析儀、VITEK比濁儀（法國梅里埃公司），ST-360酶標儀（上?？迫A有限公司），小型低速離心機（Thermo公司），PCR反應擴增儀（BIO公司），StepOne型熒光定量PCR儀、Stepone plus型熒光定量PCR儀（ABI），96孔細胞培養板（NEST公司），1%結晶紫染色液（北京索萊寶），Ezup柱式細菌基因組DNA抽提試劑盒、溶葡萄球菌酶（上海生工生物工程股份有限公司），定量PCR試劑SG Fast qPCR Master Mix（加拿大ABI公司）。

1.3 研究方法 （1）細菌的分離與鑒定：按照《全國臨床檢驗操作規程》及VITEK-2型號全自動化微生物分析儀器操作手冊進行規范化操作，對分離純化的細菌進行鑒定。通過VITEK-2型號全自動化微生物分析儀器鑒定，并經過mecA 基因進行MRSA菌種的確認。（2）藥物敏感試驗：按照2016版美國臨床和實驗室標準協會（CLSI）的標準，應用微量肉湯稀釋法測定30株實驗菌株對替加環素的最低抑菌濃度（minimal inhibititory concentration，MIC）和最低生物被膜清除濃度（minimal biofilm eradication concentration，MBEC），每株菌做3個復孔。其中，替加環素對MRSA的MIC值采用歐洲藥敏試驗委員會（EUCAST）標準，替加環素≤0.12為敏感。（3）生物膜形成能力定量測定：采用96孔聚苯乙烯板結晶紫染色法測定30株MRSA菌株體外培養不同時間段形成生物膜的能力。全功能微孔板酶標儀檢測各孔在570 nm處的吸光度值，即OD570值。OD570值判讀依據：當OD570≥2ODc時，為強生物膜形成株；當ODc≤OD570＜2ODc時，為弱生物膜形成株；當OD570＜ODc時，為無生物膜形成株。（4）不同濃度的替加環素作用下生物膜形成定量測定：采用96孔聚苯乙烯板結晶紫染色法測定亞抑菌濃度及亞生物膜清除濃度替加環素作用下生物膜的變化。（5）不同濃度替加環素作用下生物膜相關基因的測定：按照Ezup柱式細菌基因組DNA抽提試劑盒說明進行操作，將提取MRSADNA保存在-20 ℃。應用熒光定量PCR測定icaA、sar、fnbA、agrI基因的相對表達量。生物膜相關基因相對表達量差異采用比較Ct值法（2-（ΔΔCt））公式計算：ΔCt=Ct靶基因-Ct內參基因；ΔΔCt=ΔCt（校準樣品）-ΔCt（實驗樣本），改變倍數=2-（ΔΔCt）。

1.4 統計學方法 采用Microsoft office2007軟件和SPSS13.0統計軟件。計數資料以（±s）表示，采用趨勢χ2檢驗，兩樣本間比較采用t檢驗。以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 30株臨床分離的MRSA生物膜形成能力測定 結果顯示，30株實驗菌株均能形成生物膜。根據結果判讀依據：ODc=0.066，OD570≥4ODc，30株均為強生物膜形成株。所有菌株在24 h均已形成生物膜，24 h～48 h內迅速生長。每株菌每個時間段所形成的生物膜量均有差異。5株菌培養48 h后生物膜形成量達到高峰，而后進入平臺期，96 h開始下降；16株菌在48 h產生的生物膜量達到高峰，72 h開始下降；另外9株菌在72 h產生的生物膜量達到高峰，而后開始下降。見表1。

表1 30株臨床分離的MRSA生物膜形成能力測定（±s）

表1 30株臨床分離的MRSA生物膜形成能力測定（±s）

編號 24 h 48 h 72 h 96 h 1 0.250±0.036 0.272±0.025 0.285±0.010 0.148±0.028 2 0.261±0.038 0.360±0.027 0.357±0.018 0.143±0.011 3 0.256±0.021 0.561±0.044 0.567±0.012 0.299±0.105 4 0.343±0.025 0.449±0.009 0.301±0.009 0.184±0.006 6 0.436±0.076 1.259±0.001 1.084±0.056 0.859±0.040 7 0.536±0.032 1.645±0.037 1.473±0.056 1.104±0.086 8 0.171±0.010 0.131±0.013 0.366±0.024 0.131±0.035 9 0.250±0.014 1.557±0.026 1.302±0.104 0.971±0.061 13 0.165±0.009 0.459±0.038 0.564±0.050 0.389±0.020 14 0.529±0.089 1.573±0.159 1.431±0.125 1.099±0.117 15 0.151±0.027 0.959±0.029 0.815±0.104 0.581±0.098 19 0.257±0.041 0.540±0.063 0.540±0.029 0.338±0.093 21 0.165±0.013 0.747±0.004 0.753±0.020 0.431±0.097 22 0.200±0.010 0.785±0.030 0.749±0.007 0.528±0.065 24 0.517±0.001 1.158±0.035 1.156±0.045 0.870±0.071 25 0.183±0.011 0.344±0.012 0.470±0.040 0.340±0.091 26 0.154±0.014 0.261±0.036 0.213±0.010 0.185±0.010 27 0.215±0.015 0.553±0.019 0.523±0.009 0.401±0.013 28 0.346±0.028 0.944±0.049 0.861±0.019 0.734±0.034 30 0.413±0.017 1.689±0.155 1.492±0.078 1.342±0.068 33 0.084±0.024 0.188±0.012 0.289±0.030 0.269±0.017 34 0.186±0.036 0.676±0.062 0.651±0.017 0.560±0.015 35 0.140±0.013 0.594±0.016 0.916±0.024 0.743±0.040 36 0.086±0.011 0.311±0.018 0.314±0.002 0.291±0.006 37 0.229±0.042 1.447±0.128 1.318±0.082 1.060±0.105 46 0.112±0.009 0.453±0.018 0.723±0.046 0.667±0.011 47 0.082±0.005 0.143±0.011 0.339±0.033 0.296±0.007 48 0.234±0.021 0.732±0.030 0.643±0.049 0.583±0.028 50 0.284±0.035 1.385±0.025 1.515±0.077 1.441±0.135 57 0.155±0.014 0.285±0.005 0.218±0.015 0.187±0.013

2.2 亞抑菌濃度替加環素對MRSA生物膜形成的作用 本實驗替加環素對30株MRSA的MIC值均≤0.12 μg/mL，參照CLSI標準均為敏感。對30株亞抑菌濃度替加環素作用下的MRSA實驗菌株的生物膜量進行分析，分別測定1、1/2、1/4、1/8MIC替加環素條件下實驗菌株的生物膜生成量。結果顯示，所有菌株在亞抑菌濃度的替加環素作用下的生物膜形成能力均有下降，表明在亞抑菌濃度的替加環素作用下可顯著抑制MRSA實驗菌株生物膜的形成；大部分菌株隨著替加環素濃度的增加，生物膜形成量減少；只有少量MRSA實驗菌株表現為1/4MIC替加環素下生成增加，其生物膜形成量不完全與替加環素濃度呈負相關。見表2。

表2 亞抑菌濃度替加環素對30株MRSA生物膜的作用（±s）

表2 亞抑菌濃度替加環素對30株MRSA生物膜的作用（±s）

編號 0MIC 1MIC 1/2MIC 1/4MIC 1/8MIC 1 0.271±0.015 0.063±0.020 0.104±0.006 0.157±0.007 0.218±0.017 2 0.358±0.028 0.104±0.007 0.168±0.010 0.203±0.003 0.253±0.013 3 0.543±0.040 0.067±0.007 0.110±0.010 0.188±0.011 0.257±0.007 4 0.444±0.010 0.092±0.010 0.114±0.012 0.218±0.010 0.125±0.004 6 1.168±0.079 0.124±0.006 0.220±0.003 0.308±0.009 0.413±0.012 7 1.640±0.045 0.227±0.020 0.324±0.019 0.414±0.008 0.543±0.050 8 0.357±0.009 0.048±0.010 0.084±0.005 0.111±0.009 0.120±0.009 9 1.499±0.054 0.121±0.007 0.186±0.005 0.452±0.040 0.350±0.025 13 0.556±0.044 0.158±0.213 0.117±0.009 0.087±0.003 0.108±0.008 14 1.540±0.108 0.116±0.004 0.603±0.048 0.438±0.011 0.530±0.008 15 0.959±0.014 0.071±0.007 0.090±0.002 0.130±0.008 0.163±0.012 19 0.497±0.036 0.126±0.010 0.146±0.008 0.183±0.010 0.219±0.018 21 0.731±0.032 0.043±0.008 0.081±0.004 0.105±0.004 0.138±0.005 22 0.793±0.019 0.056±0.005 0.088±0.005 0.121±0.002 0.112±0.004 24 1.154±0.043 0.117±0.008 0.180±0.006 0.247±0.011 0.342±0.005 25 0.453±0.034 0.070±0.007 0.104±0.006 0.133±0.010 0.151±0.022 26 0.261±0.024 0.029±0.003 0.060±0.007 0.089±0.004 0.116±0.014 27 0.546±0.030 0.045±0.027 0.124±0.013 0.124±0.010 0.324±0.009 28 0.891±0.016 0.131±0.016 0.277±0.029 0.425±0.024 0.541±0.030 30 1.658±0.123 0.084±0.019 0.276±0.034 0.746±0.053 0.831±0.049 33 0.295±0.016 0.042±0.009 0.066±0.011 0.098±0.011 0.121±0.008

表2（續）

2.3 亞生物膜清除濃度替加環素下對MRSA生物膜的作用 MRSA菌株生物膜形成達高峰后加入一定濃度的替加環素，并以能消除已形成生物膜的最低濃度為最低生物膜形成濃度（MBEC），分別測定1、1/2、1/4、1/8MBEC 的替加環素作用下，30株MRSA菌株生物膜形成量的變化。結果顯示，替加環素對30株MRSA的MBEC各不相同，濃度32～128 ug/mL；1/2、1/4、1/8MBEC 替加環素對生物膜均有微弱的消除作用，組間差異無統計學意義（P=0.894）。見表3-4。

表3 亞生物膜清除濃度替加環素對30株MRSA生物膜的作用（±s）

表3 亞生物膜清除濃度替加環素對30株MRSA生物膜的作用（±s）

編號 MBEC 0MBEC 1/2MBEC 1/4MBEC 1/8MBEC 1 64 0.253±0.021 0.212±0.006 0.217±0.012 0.224±0.007 2 64 0.345±0.027 0.270±0.018 0.317±0.046 0.224±0.015 3 128 0.517±0.039 0.423±0.012 0.440±0.024 0.419±0.003 4 64 0.425±0.007 0.327±0.021 0.322±0.007 0.319±0.003 6 128 1.093±0.066 1.084±0.112 1.028±0.017 0.982±0.053 7 128 1.514±0.068 1.522±0.031 1.331±0.021 1.425±0.044 8 32 0.334±0.012 0.277±0.009 0.268±0.025 0.264±0.025 9 128 1.501±0.045 1.385±0.050 1.488±0.051 1.668±0.057 13 64 0.535±0.049 0.433±0.008 0.459±0.018 0.452±0.012 14 128 1.483±0.073 1.418±0.044 1.569±0.021 1.475±0.118 15 128 0.945±0.009 0.738±0.017 0.678±0.021 0.650±0.031 19 64 0.475±0.049 0.372±0.019 0.340±0.047 0.377±0.021 21 128 0.713±0.038 0.594±0.029 0.650±0.027 0.715±0.013 22 128 0.777±0.021 0.521±0.011 0.610±0.059 0.608±0.007 24 128 1.151±0.076 0.982±0.023 1.323±0.065 1.367±0.051 25 64 0.433±0.040 0.263±0.022 0.250±0.031 0.286±0.052 26 32 0.248±0.029 0.113±0.007 0.124±0.004 0.129±0.014 27 64 0.521±0.034 0.389±0.012 0.426±0.015 0.465±0.010 28 128 0.875±0.024 0.760±0.015 0.815±0.017 0.869±0.017 30 128 1.635±0.039 1.533±0.066 1.577±0.023 1.706±0.025 33 32 0.275±0.012 0.225±0.008 0.257±0.021 0.240±0.008 34 64 0.669±0.029 0.552±0.023 0.565±0.013 0.592±0.012 35 64 0.896±0.018 0.792±0.008 0.832±0.019 0.848±0.028 36 32 0.300±0.025 0.303±0.007 0.316±0.009 0.324±0.008 37 128 1.420±0.078 1.283±0.056 1.302±0.037 1.415±0.074 46 64 0.658±0.084 0.580±0.020 0.613±0.014 0.711±0.010 47 32 0.327±0.028 0.281±0.004 0.310±0.012 0.334±0.009 48 128 0.694±0.061 0.553±0.020 0.609±0.028 0.698±0.016 50 128 1.334±0.166 1.263±0.048 1.295±0.042 1.333±0.020 57 32 0.250±0.025 0.225±0.014 0.230±0.021 0.255±0.011

表4 1/2、1/4、1/8MBEC替加環素對MRSA生物膜的差異性比較

2.4 RT-PCR法測定亞抑菌濃度替加環素作用下生物膜相關基因相對表達量 選取實驗菌株中的四株菌在四個不同濃度替加環素作用24 h后進行RT-PCR檢測icaA、sarA、fnbA、agrI基因的相對表達量，并計算生物膜形成量與其之間的相關性，內參基因為16sRNA。見表5。

表5 icaA，sarA，fnbA和agrI基因相對表達量

2.5 MRSA生物膜形成量與相關基因表達量的相關性分析 結果顯示，生物膜量與以下基因有相關性：icaA（PCC=0.873，P＜0.01），icaA和sarA（PCC=0.817，P＜0.01），icaA和fnbA（PCC=0.941，P＜0.01），sarA和fnbA（PCC=0.844，P＜0.01）。見表6。

表6 MRSA生物膜形成量與相關基因表達量的相關性分析

3 討論

金黃色葡萄球菌是一種機會性人類病原體，感染的范圍從輕度皮膚感染到嚴重壞死性肺炎，同時是菌血癥、感染性心內膜炎的主要病原菌，還可引起骨關節、皮膚、軟組織、胸膜、肺和裝置相關感染。MRSA具有多重耐藥性，生物膜的形成是MRSA毒力因子之一［4］。生物膜是一種膜性結構，MRSA由于生物膜的作用，并不引起強烈的炎癥反應，因為生物膜隔絕了細菌與機體的直接接觸，使細菌得以與機體共存，即使在慢性黏附的狀態下［5］。更重要的是，生物膜能夠有效阻滯抗生素和機體防御系統對被膜內細菌的殺傷，雖然部分抗生素能夠有效殺滅浮游菌，但還會不斷釋放浮游菌，從而導致感染遷延不愈。生物膜致病機制較為復雜，主要包括以下幾個方面［6-11］：①生物膜提供保護屏障，MRSA生物膜可通過多種機制對抗抗生素的殺菌作用，主要是表現在內部微環境的改變、基質屏障作用、群體感應系統、被膜菌的表型變異以及主動外排系統等，為細菌的定植和侵入提供了屏障。②生物膜介導的免疫損傷。中性粒細胞不能進入生物膜內殺傷細菌，只能圍繞在生物膜周圍，由于生物膜基質屏障缺少特定的化學信號，這些細胞被激活后能釋放蛋白酶、細胞毒素等，可引起周圍組織損傷。③葡萄球菌生物膜能夠通過降低淋巴細胞釋放γ干擾素，可減少巨噬細胞的激活，也會導致周圍組織損傷。④生物膜能夠對抗免疫系統的清除，抗體和炎性細胞只能環繞在其周圍，很難進入生物膜內，這樣就不能發揮吞噬殺傷作用。

本實驗通過96孔聚苯乙烯板結晶紫染色法發現，留取的30株MRSA均形成生物膜，并且都是強生物膜形成株。從30株臨床分離的MRSA生物膜形成能力測定表及生物膜生長曲線圖可見，菌株生物膜的生長周期具有差異性。細菌形成生物膜的階段為黏附→聚集與增殖→生物膜的成熟→細菌脫落與播散，由表1可見，培養24 h已經完成黏附形成生物膜，24 h～48 h是聚集與增殖的快速階段，53.3%的菌株在此時間段成生物膜已經達到高峰，72 h開始下降；16.7%的菌株在此階段生物膜形成量達到高峰，72 h量與其持平；30%的菌株在此階段生物膜繼續增殖至72 h達到高峰形成成熟的生物膜。72 h～96 h為細菌脫落與播散期，浮游菌遇到適宜的表面繼續附著、發展、成熟，形成循環。因此，生物膜的形成是一個動態過程，是導致感染遷延不愈的重要原因。

本研究使用1、1/2、1/4、1/8MIC替加環素對30株MRSA實驗菌株進行刺激。結果表明，所有應用替加環素作用下的MRSA實驗菌株在亞抑菌濃度條件下其形成生物膜的能力均降低。此外，亞抑菌濃度的替加環素作用下可明顯抑制MRSA生物膜的形成。實驗菌株形成的生物膜量各自不同，在不同的亞抑菌濃度作用下，大部分的菌株在替加環素作用下表現為隨著濃度增加，生物膜形成量減少，呈負相關性。有少量菌株在亞抑菌濃度的替加環素作用下，其形成的生物膜不隨替加環素的濃度變化而變化，可能是因為亞抑菌濃度不僅不能破壞、減少生物膜，反而可能誘導刺激生物膜形成，這個問題值得繼續研究。

本研究檢測了替加環素對30株MRSA實驗菌株最低生物膜清除濃度。結果顯示，30株的MBEC均顯著高于其浮游菌的MIC，表明在替加環素作用下以生物膜形態存在的細菌與浮游菌耐抗菌素的能力相比大大增加。以1/2、1/4、1/8MBEC濃度刺激30株MRSA菌株，結果表明亞生物膜清除濃度對已經形成的生物膜有微弱的消除作用，但不同MBEC的替加環素對成熟生物膜的作用無差異。臨床上，可以根據需要聯合用藥對MRSA成熟的生物膜進行干預。

本研究中亞抑菌濃度替加環素作用下生物膜形成量與sarA、icaA和fnbA呈明顯相關性，提示亞抑菌濃度替加環素對MRSA生物膜影響的主要機制是對相關的生物膜基因如sarA、icaA、fnbA進行調控進而影響生物膜的形成。結果提示，亞抑菌濃度替加環素影響生物膜形成與agrI基因相關性不大，可能與本研究中6號菌株在亞抑菌濃度替加環素作用下的agrI未擴增有關，后期需要更多的實驗來證明與探究。

綜上所述，不同濃度替加環素的作用影響了相關基因的相對表達量，從而影響生物膜形成量的變化。替加環素影響生物膜形成的機制復雜，通過對毒力因子、基因的調控能否降低MRSA生物膜相關感染的發病率和病死率，還需進行深入的研究。另外，MRSA的耐藥形勢給臨床治療及院內感染防控帶來極大的挑戰，提示臨床醫師必須合理選用抗菌藥物［12］。