高脂飲食小鼠脂肪組織胞外囊泡損傷海馬神經元的研究

周 迪， 呂子陽, 聶盛丹, 周高雅, 王 珊

(1. 中南大學化學化工學院制藥工程系，湖南 長沙 410083, 2. 湖南省人民醫院藥物臨床試驗機構辦， 湖南 長沙 410081, 3.湖南省腦科醫院神經內科，湖南 長沙 410007)

隨著世界經濟的快速發展，以高脂飲食為主的飲食模式越來越普遍。長期高脂飲食使機體脂肪異常堆積，引發代謝紊亂，損傷中樞神經系統的功能[1]。有研究顯示高脂飲食可以引發認知障礙[2]，但其具體機制尚未明確。長期高脂飲食可通過促進脂肪組織釋放各種脂肪因子，從而影響其他組織器官的功能，進而介導疾病的發生發展[3]。胞外囊泡(extracellular vesicles，EVs)是由細胞分泌的一類納米級膜囊泡，可在細胞間傳遞蛋白質、脂質、核酸等遺傳信息，幫助維持生理穩態或介導疾病發展[4-5]。研究發現，高脂飲食小鼠脂肪組織分泌的胞外囊泡可以增加肝細胞、巨噬細胞中炎性因子的表達，加快相關并發癥的發展[6-7]。同時，越來越多的研究表明，許多外周細胞，如紅細胞、間充質干細胞等，分泌的胞外囊泡可以透過血腦屏障調節中樞神經系統疾病[8-9]。然而，高脂飲食小鼠脂肪組織胞外囊泡能否透過血腦屏障直接損傷海馬神經元，尚未見相關報道。因此，本研究通過建立高脂動物模型，提取脂肪組織胞外囊泡，分析海馬神經元對其攝取情況，并檢測其對海馬神經元樹突發育及細胞活性的影響，旨在探討高脂飲食引發認知障礙的機制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1實驗動物 C57BL/6J雄性小鼠(22只)，體質量為(21±2)g，SPF級(湖南省斯萊克景達動物實驗公司提供)，許可證號：SCXK(湘)2019-0008，飼養于中南大學湘雅醫學院實驗動物中心。飼養于21 ℃～25 ℃，濕度46%～54%，光照12 h的環境中。其中20只用于高脂飲食分組和造模，并提取脂肪組織胞外囊泡，余下2只用于尾靜脈注射觀察海馬組織對脂肪組織胞外囊泡的攝取。孕18 d C57BL/6J雌鼠(1只)，SPF級(湖南省斯萊克景達動物實驗公司提供)，許可證號：SCXK(湘)2019-0009，用于提取、培養原代海馬神經元。實驗過程中無動物意外死亡。

1.1.2主要試劑 小鼠標準顆粒狀飼料脂肪占比0.04，為SJA常規嚙齒類動物飲食，由湖南斯萊克實驗動物有限責任公司提供；高脂飼料(貨號：D12492I)脂肪占比0.60，由美國Research Diets公司提供。

Neurobasal培基(貨號：21103049)、DMEM/F12培基(貨號：11320033)、B27營養因子(貨號：A3582801)、L-谷氨酰胺(貨號：25030081)、胎牛血清(貨號：A31608-02)、雙抗(貨號：15240062)購自美國Gibco公司，左旋多聚賴氨酸(貨號：P1399)、PKH 67染料(貨號：MKCK5701)購自美國Sigma公司，膠原酶I(貨號：1904GR001)購自德國BioFroxx公司；MAP-2抗體(貨號：ab5392)、β-tubulin III抗體(貨號：ab18207)購自英國Abcam公司，CCK-8試劑盒(貨號：KGA317)、BCA蛋白定量試劑盒(貨號：KGPBCA)購自江蘇凱基生物公司。

1.1.3儀器 Morris水迷宮裝置(北京吉安得爾科技有限公司)；電子血糖儀(三諾生物傳感股份有限公司)；酶標儀(賽默飛世爾科技公司)；超高速離心機(美國貝克曼庫爾特有限公司)。

1.2 實驗方法

1.2.1分組及造模 將健康8周齡小鼠20只隨機分為兩組，即正常飲食組(normal diet，ND)，高脂組(high-fat diet，HFD)，每組10只。ND組給予足夠的標準動物飼料；HFD組給予足夠的高脂飼料，兩組均自由飲水，共喂養28周，每周檢測體重1次[10]。為避免采集血糖的刺激導致動物的應激反應影響水迷宮的檢測結果，我們于進入第27周的d 1分別測量血糖值(fasting blood glucose, FBG)、胰島素水平(insulin, INS)，計算胰島素抵抗指數(HOMA-IR)，于進入第28周的d 1進行行為學檢測。

1.2.2空腹血糖及胰島素檢測 空腹血糖及胰島素水平檢測于第27周進行，檢測前將小鼠禁食6 h，對小鼠剪尾用毛細管采血約100 μL，分別用電子血糖儀檢測血糖和胰島素檢測試劑盒檢測胰島素水平。

1.2.3糖耐量試驗及胰島素耐量試驗 糖耐量試驗于空腹血糖及胰島素檢測后隔天進行，試驗前，禁食16 h，于d 2早8點給小鼠稱重，以2 g·kg-1的劑量給小鼠腹腔注射葡萄糖溶液，分別于注射0 min、15 min、30 min、60 min、90 min、120 min后，用采血針從尾靜脈取血，擦去第一滴血，并用電子血糖儀檢測第二滴血的血糖值。

胰島素耐量試驗在糖耐量試驗后隔天進行。試驗前，將小鼠禁食6 h，以1 U·kg-1的劑量給小鼠腹腔注射胰島素溶液，分別于注射0 min、15 min、30 min、60 min、90 min、120 min后，通過采血針尾靜脈采血測量小鼠血糖值。

1.2.4Morris水迷宮實驗 Morris水迷宮實驗于第28周d 1開始進行，用于研究空間識別記憶能力。水迷宮直徑100 cm，平臺直徑10 cm。水迷宮分為四個象限，平臺置于一個象限中間。d 1平臺露出水面1 cm，d 2～5將平臺沒入水下1 cm，d 6撤掉平臺。前5 d進行獲得性訓練，將小鼠放入迷宮，記錄小鼠從入水到站上平臺所用時間，作為逃避潛伏期。如果小鼠在60 s內站上平臺，則允許它們在平臺上停留5 s，如果未找到平臺，則用木棍引導小鼠站上平臺并停留15 s。所有小鼠每日進行4次訓練。最后1 d進行探查訓練，拆除平臺，記錄小鼠入水中后在目標象限(原先平臺放置的象限)的停留時間。

1.2.5脂肪組織取材、稱重及HE染色 造模完成后，兩組小鼠用異氟烷麻醉，剪開腹部皮膚，取出附睪脂肪(epididymal white adipose tissue, eWAT)，稱量脂肪質量后，一半固定做HE染色，一半用于脂肪組織胞外囊泡提取。

脂肪組織取材后，用多聚甲醛固定2 d，制成石蠟切片后進行蘇木精-伊紅染色，于顯微鏡下觀察。

1.2.6脂肪組織胞外囊泡提取及鑒定 脂肪組織取材后立刻用預冷PBS漂洗，加入3 mL I型Collagenase消化液，于恒溫震蕩儀上37 ℃消化30 min，用完全培養基終止消化，400×g離心1 min，留上清液重懸于緩沖液中，重復3次，用含去胞外囊泡血清培養基重懸，轉移至90 mm培養皿培養24 h，收集培基。收集的培基2 500×g離心20 min，10 000×g離心30 min，并用0.22 μm濾器對其過濾，100 000×g離心2 h得到胞外囊泡及蛋白沉淀，再PBS緩沖液清洗(100 000×g, 2 h)得到脂肪組織胞外囊泡。

對提取的胞外囊泡進行鑒定，取部分樣品滴加在銅網上，用乙酸雙氧鈾進行負染, 使用透射電子顯微鏡(TEM)對其進行結構分析；另取部分樣品用納米顆粒跟蹤分析儀(NTA)對其進行粒徑分析。

1.2.7原代海馬神經元細胞培養 在24孔板中預先放置細胞爬片，用0.1 mg·L-1的Poly-lysine溶液進行包被，使用前用PBS清洗3遍。取孕18 d左右的C57BL/6J鼠1只，異氟烷麻醉，在醫用酒精中浸泡30 s，取出胎鼠，斷頭后，用顯微鑷劃開頭骨，取出整個大腦于預冷的HBSS中，分離海馬組織。將取出的海馬組織剪碎，加入胰蛋白酶，于37 ℃消化15 min，加入FBS終止消化，輕輕吹打，放入離心機中1 000 r·min-1離心5 min，棄去上清，制成單細胞懸液，以2×105個·L-1的濃度種板，4 h后換液，用PBS洗3遍，換成neurobasal培基，每2 d半量換液。

1.2.8脂肪組織胞外囊泡的染色 向1 mL的Diluent C溶液中加入4 μL PKH 67試劑，振蕩混勻后加入胞外囊泡樣品，25 ℃ 孵育10 min，加入等量20 g·L-1BSA溶液孵育1 min終止染色后，重復1.2.6中提取胞外囊泡的方法，收集染色后的胞外囊泡，染色全過程避光操作。

1.2.9海馬神經元對脂肪組織胞外囊泡的攝取 取8周左右C57BL/6J雄鼠2只，分別尾靜脈注射蛋白總量30 μg的PKH 67染色的脂肪組織胞外囊泡及PBS，30 h后將小鼠麻醉處死，迅速取出腦組織保存于-80 ℃，取海馬區冠狀切片，染核，采用倒置熒光顯微鏡觀察。

向體外培養8 d的原代海馬神經元中加入20 mg·L-1PKH 67染色的脂肪組織胞外囊泡，4 h后用多聚甲醛固定，并用anti-MAP-2抗體(1 ∶500)進行免疫熒光染色，Hochest染核。

1.2.10高脂飲食小鼠脂肪組織胞外囊泡對神經元的影響 用20 μg·mL-1高脂飲食小鼠脂肪組織胞外囊泡(HFD-EVs組)、正常飲食小鼠脂肪組織胞外囊泡(ND-EVs組)及PBS(Control組)分別處理神經元，用MAP-2做免疫熒光觀察樹突數量，分析胞外囊泡對神經元形態的影響[11]。

神經元接種于96孔板，培養貼壁后，進行細胞活性檢測。每組設5個復孔，分別加入20 mg·L-1高脂飲食、正常飲食小鼠脂肪組織胞外囊泡及PBS孵育培養1 d后，每孔加CCK-8溶液10 μL，37 ℃孵育2 h，酶標儀450 nm測定吸光度，實驗重復3次。

2 結果

2.1 高脂飲食對小鼠體質量及糖代謝指標的影響分組造模后，HFD組小鼠的體質量、附睪脂肪質量、血糖、胰島素水平及胰島素抵抗指數明顯高于ND組(P<0.05)，見Tab 1。

Tab 1 Comparison of obesity indexes of

葡萄糖耐量實驗中2組小鼠血糖值均隨時間呈先上升后下降的趨勢，于15 min時達到最高值。注射葡萄糖溶液后，HFD組血糖值均高于ND組。在30 min和120 min時，2組血糖值差異存在顯著性(P<0.05)，見Tab 2。胰島素耐量試驗中各組小鼠血糖值均隨時間呈先下降后上升的趨勢，HFD組血糖值均高于ND組。在15 min、30 min和60 min時，兩組血糖值差異存在顯著性(P<0.05)，見Tab 3。

2.2 高脂飲食對小鼠學習記憶能力的影響獲得性訓練d 1、2、3，2組小鼠的逃避潛伏期無明顯差異(P>0.05)，表明小鼠體質量對逃避潛伏期影響較小。獲得性訓練d 4、5，與ND組相比，HFD組逃避潛伏期明顯延長(P<0.05)，且游泳軌跡雜亂無章，見Fig 1A，D。探查訓練結果表明，HFD組小鼠進入目標象限次數及在目標象限中游泳時間明顯低于ND組(P<0.05)，見Fig 1B，C。提示高脂飲食可損傷小鼠的學習記憶能力。

Fig 1 Results of Morris water maze

Tab 2 Changes of blood glucose at each time point in glucose tolerance

Tab 3 Changes of blood glucose at each time point in insulin tolerance

2.3 高脂飲食對小鼠脂肪組織形態學及其分泌的胞外囊泡的影響HE染色結果顯示，ND組小鼠脂肪細胞大小均一；HFD組小鼠脂肪細胞大小不一，且平均面積較ND組明顯增大，見Fig 2。

Fig 2 Influence of high-fat diet on adipose

透射電鏡結果顯示脂肪組織提取的胞外囊泡呈杯狀囊泡結構，形態完整，NTA結果顯示粒徑主要分布在50～150 nm之間，見Fig 3A，B。BCA蛋白定量結果顯示，HFD組小鼠脂肪組織分泌胞外囊泡的量明顯多于ND組(P<0.05)，見Fig 3C。

2.4 海馬神經元對脂肪組織胞外囊泡的攝取情況對培養的原代海馬神經元進行純度鑒定，免疫熒光結果顯示神經元細胞形態正常且純度達到98%以上，見Fig 4A，可用于后續實驗。體外孵育PKH 67標記的脂肪組織胞外囊泡，免疫熒光結果顯示，原代海馬神經元能夠攝取脂肪組織胞外囊泡，見Fig 4B。小鼠尾靜脈注射PKH 67標記的脂肪組織胞外囊泡，在海馬組織中可檢測到明顯的熒光信號，見Fig 4C，提示脂肪組織胞外囊泡可以通過血腦屏障被海馬神經元攝取。

2.5 高脂飲食小鼠脂肪組織胞外囊泡對海馬神經元的影響用相同濃度的高脂飲食、正常飲食小鼠脂肪組織胞外囊泡及PBS分別處理原代海馬神經元，免疫熒光結果顯示，HFD-EVs組海馬神經元較Control組及ND-EVs組，樹突長度降低、初級樹突數和次級樹突數減少，見Fig 5。

CCK-8結果顯示，高脂組小鼠脂肪組織胞外囊泡處理神經元使神經元細胞活性下降(P<0.05)，見Fig 6。

Fig 3 Influence of high-fat diet on EVs derived from adipose

Fig 4 EVs purified from adipose uptaken by hippocampal neurons

Fig 5 Effects of EVs purified from adipose on morphology of hippocampal neurons

Fig 6 Effect of EVs on cell viability of

3 討論

長期的高脂飲食可導致肥胖，并誘導心血管疾病及脂肪性肝病、糖尿病等代謝相關性疾病的發生[12-14]。近年來，高脂飲食與神經系統疾病的關系也倍受矚目[2]。研究發現在動物及臨床試驗中，高脂飲食會導致海馬功能受損，引發認知障礙[2, 15]。但是高脂飲食介導認知障礙的具體機制仍有待深入研究。

脂肪組織不僅可以平衡能量的儲存和消耗，還可以作為一種內分泌器官，分泌各種脂肪因子影響機體代謝[16]。有研究表明，脂肪組織的異常堆積是誘發胰島素抵抗、2型糖尿病及代謝綜合征的重要驅動因素[17]。本研究中，HFD組小鼠的體質量、附睪脂肪質量、血糖、胰島素水平明顯高于ND組，出現胰島素抵抗狀態。與ND組相比，HFD組小鼠在Morris水迷宮中逃避潛伏期時間明顯延長，目標象限內游泳時間明顯減少，表明高脂飲食能夠介導認知功能障礙。

近年來，一些研究者開始關注脂肪組織來源的胞外囊泡在多種疾病中的作用，他們證實高脂飲食可通過影響脂肪組織分泌的胞外囊泡引起肝細胞、巨噬細胞等外周細胞的損傷[6-7]。此外，因胞外囊泡的納米級膜結構，使其具有透過血腦屏障的能力[18]；外周細胞產生的胞外囊泡可以攜帶蛋白或藥物順利透過血腦屏障調節中樞系統疾病[8-9]。那么，脂肪組織分泌的胞外囊泡是否可以透過血腦屏障直接造成中樞神經系統的損傷呢？本研究結果表明，脂肪組織分泌的胞外囊泡可被原代培養的海馬神經元攝取，通過尾靜脈給小鼠注射標記過的脂肪組織胞外囊泡，可在海馬組織中檢測到明顯的熒光信號。提示，脂肪組織胞外囊泡可被腦組織海馬神經元攝取，病理狀態下脂肪組織胞外囊泡的改變可能介導海馬依賴性認知功能障礙的發生。

長期高脂飲食誘導脂肪組織異常堆積，很可能改變了脂肪組織分泌的胞外囊泡的分泌量及內容物[19]。在本研究中，相比ND組，HFD組小鼠脂肪細胞體積顯著增大，其分泌的胞外囊泡明顯增多；HFD組小鼠脂肪組織胞外囊泡可明顯降低神經元細胞活性，減少海馬神經元樹突分支總數和總長度。提示，高脂飲食可能通過影響脂肪組織分泌的胞外囊泡損傷海馬神經元，介導小鼠認知障礙的發生。但給正常小鼠多次注射高脂動物脂肪組織胞外囊泡是否足以導致小鼠認知功能障礙，有待后續進一步研究。

綜上所述，長期高脂飲食會使小鼠脂肪堆積，出現糖耐量異常、胰島素抵抗，學習記憶能力下降，其機制可能與脂肪組織分泌的胞外囊泡異常有關。本研究提示了高脂飲食介導認知障礙的可能機制，為高脂飲食介導認知障礙的防治提供新思路。