pH響應型碳點的熒光機制和生物醫學應用

何松杰， 張清梅,2*， 張路鵬， 杜秀娟 ， 陳峰華， 李 冰

(1. 太原科技大學 應用科學學院， 山西 太原 030024；2. 福建師范大學物理與能源學院 福建省量子調控與新能源材料重點實驗室， 福建 福州 350117；3. 山西醫科大學 口腔醫學院， 山西 太原 030051)

1 引 言

生物體內，pH在許多細胞代謝過程中起著至關重要的作用，細胞的功能障礙往往與細胞器中的pH值異常有關[1-2]。在細胞內，pH在很小范圍內的波動往往會導致細胞不當的生長和分裂[3-6]。因此，監測生物體內活細胞中的pH值在疾病的診斷與治療方面具有重要意義。目前市場上用于制備熒光探針的材料主要有熒光團[7]、熒光納米材料[8]以及熒光蛋白[9]。量子點作為一種最常見的熒光納米材料，具有比熒光團更加穩定的發光，然而量子點大多由半導體材料制成，細胞毒性較高且難溶于水，導致其不能在細胞內pH的監測及生物醫學應用方面很好地發揮作用[10]。

碳點(CDs)是至少有一維小于10 nm的碳納米材料，由sp2/sp3雜化碳原子核和附著態組成[11-12]。根據碳核和附著狀態的不同一般將CDs分為四大類：石墨烯量子點(GQDs)、碳納米點(CNDs)、碳量子點(CQDs)和聚合物點(PDs)[13-14]。碳點作為一種新型的碳基熒光納米材料，由于其優異的生物相容性、獨特的熒光性質、可調諧的光致發光、豐富的表面官能團、高的穩定性、碳源的取材廣泛及成本低廉等而備受關注，在細胞成像[15-17]、癌癥治療[18-25]、光催化[26-28]、發光二極管[29-31]、離子檢測[17,32-35]、溫度傳感[36-37]、指紋檢測[38]、信息加密[39-40]和儲能[11,12,41-44]等諸多領域展現出了很好的應用前景。碳點表面是由大量的碳、氫、氧等親水性官能團組成，相比半導體量子點而言，碳點無需進一步修飾就可均勻分散在水介質中。碳點的毒性低和良好的生物相容性使其在生物醫學中具有潛在的應用前景。最近，楊柏課題組對CDs在生物傳感方面的機理及應用做了系統的綜述[45]，葛介超[21]、鄭敏[46]課題組分別對CDs在癌癥的診斷和治療方面進行了深入的研究，薛茗月課題組[47]在藥物分析方面做了詳細的綜述。盡管CDs在生物醫學中的應用已經有大量報道，但很少有對pH響應型碳點的綜述報道[48-49]。本文的亮點在于將pH響應型碳點不同響應機制及其之間的協同關系進行了梳理，彌補了之前報道的機制之間相互分離，單獨論述的不足，為進一步研究pH響應型碳點的熒光機制提供了一種思路。本篇綜述首先介紹了pH響應型碳點的熒光機制，然后對pH響應型碳點在pH傳感、生物成像和癌癥治療等方面的應用進行了系統的闡述。最后對當前研究現狀進行了總結，提出了目前面臨的挑戰和未來發展的方向。

2 pH響應型碳點的熒光機制

為了更好地對pH響應型碳點進行可控制備和性能調控，對pH響應型碳點的熒光機制進行研究就顯得尤為重要。pH的變化可能會改變pH響應型碳點的分子結構或者電子結構，這些改變可能會導致碳點發射波長和熒光強度的改變[48]。到目前為止，對pH響應型碳點熒光機制的研究仍然未達成共識，其中被人們廣泛接受的核心機制是pH響應型碳點的堿性基團和酸性基團的質子化和去質子化。此外，pH響應型碳點在質子化和去質子化的作用下，在微觀/宏觀上具體表現為能級變化、碳點聚集、質子/電荷轉移等機制[50]。不同pH響應型碳點的主要熒光機制如表1所示。

表1 不同pH響應型碳點的主要熒光機制和響應范圍

表1(續)

碳點表面官能團的質子化和去質子化是典型的pH熒光機制[60]。如圖1所示,酚羥基和羧基等酸性官能團通過共價鍵連接在碳點表面，在堿性條件下去質子化，碳點表面呈負電性；而在酸性條件下，碳點表面失去質子的一些官能團重新質子化，碳點表面表現為正電性。已有文獻證明碳點由于質子化和去質子化導致的表面zeta電位的改變可能與其對pH的響應有關[51]。Hu等發現硫摻雜碳點的熒光強度對pH響應是可逆的，在378 nm的激發下，改變pH從3.0到9.0時，碳點的熒光強度逐漸增強。然后，將pH從9.0變化為3.0時，其熒光強度隨之減弱?；谏鲜鼋Y果，可以得出硫摻雜碳點的光致發光強度與可逆的質子化和去質子化有關[52]。Huang等以檸檬酸為碳源，通過水熱法制備雙氰胺氮摻雜高量子產率(QY)的石墨烯碳量子點(GQDs)，開發了一種用于環境和細胞內的通用定量pH傳感器。得到的氮摻雜GQDs具有優異的光致發光性能，熒光量子產率為36.5%，碳點在1.81～8.96的pH之間具有光穩定性和pH響應性。進一步利用pH值與zeta電位的關系發現，熒光強度的變化可能是由于量子點表面羧基和酰胺基等官能團的可逆質子化和去質子化所致[2]。Yuan等通過電解石墨棒，在濃硝酸和濃硫酸混合溶液中回流合成了一種新型的水溶性多色熒光GQDs，它對1.0～14.0的全酸堿度都有響應。在365 nm激發下，當pH從1.0增加到11.0時，碳點光致發光峰的位置從522 nm紅移到575 nm，這可能是由于含氧官能團(如環氧基、羥基和羧基)的去質子化所引起的[61]。此外，Shi等的研究也證實了碳點可以在3.5～10.0的pH范圍內用作熒光pH納米傳感器，且碳點的這種行為可能與羧基去質子化有關[62]。Zhang等通過天冬氨酸和NH4HCO3混合物的一步微波輔助熱解成功合成了GQDs。所制備的GQDs熒光強度在pH從2.0～12.0變化時明顯衰減，且在350 nm激發下，當pH從7.0～12.0變化時其發射峰從458 nm紅移到491 nm。作者認為這種現象可能是由碳點表面官能團的質子化和去質子化引起的[63]。上述研究都將pH響應型碳點的熒光機制解釋為質子化和去質子化，但我們通過調研認為，質子化和去質子化可能只是其熒光機制的核心部分，需要進一步研究pH響應型碳點在質子化或去質子化后是否引起其自身能級變化、質子/電荷轉移以及碳點聚集等微觀結構和表象的變化，并且它們之間或許存在某種協同效應，共同影響了碳點的光致發光性質。

圖1 pH響應型碳點的熒光機制——質子化和去質子化

2.1 能級變化

碳點對pH響應的性質來源于表面含氧基團的質子化和去質子化，這是最廣泛接受的機制之一。同時，在質子化和去質子化的基礎上，H+/OH-引起的能級變化也被認為是碳點對pH響應的機制之一。pH的改變會導致碳點發生質子化或去質子化，碳點的表面態隨之發生改變并影響碳點內部和表面之間的相互作用，從而進一步引起碳點能級發生變化，最終可能直接影響碳點的熒光性質。如圖2所示，碳點在酸性條件下，隨著酸性的增強，從左到右能級逐漸加寬；而在堿性條件下，如右邊圖所示，隨著溶液堿性的增強，較寬的能級會逐漸變窄。Kong等以N-(β-氨基乙基)-γ-氨基丙基甲基二甲氧基硅烷和檸檬酸為碳源制備了pH響應型碳點。隨著pH從1.0增加到12.0，碳點的熒光強度穩定地增加到幾乎是pH為1.0樣品5倍的水平，并且在405 nm的激發下，峰值位置從520 nm藍移到463 nm。他們認為，吸收的羥基可以鈍化碳點的表面缺陷，形成表面改性的保護殼層從而使碳點被隔離，降低了非輻射復合速率從而導致熒光強度增加和發射峰藍移。而H+可以破壞羥基鈍化的保護殼層，在碳點表面產生新的缺陷，并通過延長共軛鏈的長度和擴大碳點的尺寸導致熒光猝滅和發射峰紅移。由于pH的變化，官能團的質子化和去質子化可能導致碳點的靜電電荷發生改變，從而使費米能級發生變化[53]。Choudhury等以檸檬汁為碳源通過一步熱解法合成碳點。他們研究發現，pH條件的改變可以顯著改變碳點的能級結構，從而影響半導體激光器中涉及的電子躍遷類型。這種效應可能是由于存在于碳點表面的含氧官能團的去質子化引起的能級變化，并導致一些化學性質不同的碳點形成[64]。Zhao等以綠色天然材料海帶為主要碳源，乙二胺為氮摻雜劑，采用微波法合成的碳點熒光強度在3.0～8.0的pH范圍內呈線性關系，在370 nm的激發下，碳點的熒光強度隨著pH的增加而降低。在較低的pH下，碳點表面發生質子化，氫鍵結合引起的羥基官能團的強烈振動耦合可導致其能級加寬。因此，碳點在酸性條件下的熒光強度很強。但在堿性條件下，去質子化過程中氫鍵效應的消除可能導致振動耦合的減少和更多的離散能級，從而導致碳點熒光強度降低[54]。因此，我們認為碳點表面發生的質子化或去質子化可能會引起碳點的碳核和表面官能團之間的相互作用發生改變，微觀上表現為碳點的能級發生變化，宏觀上則表現為碳點熒光強度或發射波長的改變。

圖2 pH響應型碳點的熒光機制——能級變化

2.2 碳點聚集

碳點聚集也是碳點對pH響應的重要機制之一。pH響應型碳點在酸性或堿性條件下其表面會發生質子化或去質子化，一些碳點受此影響會在酸性條件下表現出自組裝聚集，從而影響了碳點本身的光學性質，如圖3所示。Xu等以H3PO4為原料，在低溫60 ℃條件下一步氧化蔗糖制備了具有良好量子產率的磷酸功能化碳點，并研究了其在不同pH下的熒光可逆性質。研究發現，在3.0～13.0的pH范圍內碳點的光致發光和紫外-可見吸收光譜是可逆的，并且首次在酸性條件下直接觀察到碳點的自組裝聚集。隨著pH從2.0增加到13.0，碳點的最佳發射和激發峰都發生了紅移。他們認為,在酸性條件下，碳點迅速聚集成較大的顆粒，表面的含氧官能團緩慢氧化，導致光致發光強度降低。而在堿性條件下，碳點的結構互變異構迅速發生，類似于作為碳點核心的酚羥基和醌殘基之間的異構化，可以被視為一個大的共軛體系，由于氫化/脫氧過程發生得很慢而導致光致發光強度降低[55]。Sun等以苯二胺為碳源通過微波法合成了發紅光的碳點，并系統地測量了該碳點在4.0～11.0的不同pH下的zeta電位。研究發現，隨著pH從5.0增加到11.0，碳點的zeta電位從17 mV明顯下降到-12 mV。同時結合透射電鏡觀察，發現隨著pH的降低出現了碳點的聚集。結合透射電鏡、zeta電位和碳點在較低pH下熒光猝滅的結果，可以得出在酸性條件下，較低的zeta電位意味著更少的碳點聚集，這可歸因于碳點表面羧基和羥基的去質子化和減少的非共價分子相互作用[51]。最近，Atailson等研究也發現，碳點表面的zeta電位降低會導致碳點之間的斥力降低，從而增加了團聚的趨勢[56]。因此，我們認為pH的改變會導致碳點的結構和碳點之間表面官能團的相互作用發生改變，宏觀上表現為碳點表面的zeta電位發生改變，而zeta電位值的變化可能會影響在質子化或去質子化條件下碳點的自組裝聚集程度。

圖3 pH響應型碳點的熒光機制——碳點聚集

2.3 質子/電荷轉移

pH值變化導致碳點表面官能團的質子化或去質子化也會引起官能團和碳點發射位點之間的質子轉移，從而影響碳點的光致發光。如圖4所示，碳點表面官能團去質子化后留下的O-通過共價鍵相連在碳點表面，碳點通過質子轉移改變其自身的表面態，從而對其自身光學性能產生影響，中間插圖為激發態電子向碳點表面正電荷發射的簡單示意圖。Qian等采用溶劑熱法處理四氯化碳和乙二胺合成了非晶態氮摻雜碳點。結果表明，在pH為5.0～13.5的范圍內，在最佳激發條件下碳點的熒光強度與pH值成反比。進一步研究發現，隨著pH的降低碳點的吡啶氮原子逐漸被質子化，質子可能從質子化的氮原子轉移到共軛碳結構從而增強了碳點的熒光[65]。Lv等以對苯二胺為前驅體，在酸性溶液中水熱反應10 h，制備出一種具有強橙光發射、pH和過氧化氫雙重響應的碳點。在酸性條件下，隨著pH值降低，在430 nm的激發光下，碳點的熒光強度急劇降低，這可歸因于碳點表面的氨基質子化增加了—NH3+和碳點之間的分子內電子轉移能力[57]。Wang等以間苯二胺為碳源，在濃H2SO4存在下采用溶劑熱法合成了熒光量子產率為36% 的碳點。在450 nm的激發光下，碳點的熒光強度在pH為3.0～12.0范圍內逐漸降低，并在6.0～10.0范圍內呈現線性關系。深入研究發現，隨著pH增加，碳點熒光猝滅的機制可歸因于氨基中的孤對電子向碳點的正電荷發射。在高pH值下，碳點的激發態電子可以從最高占據分子軌道(HOMO)躍遷到最低未占據分子軌道(LUMO)，然后氨基的基態電子由于其HOMO能級高于碳點而轉移到碳點的HOMO能級，導致明顯的熒光猝滅。相比之下，當質子化發生時，孤對氨基不可用于電荷轉移，碳點的LUMO能級中的受激電子直接回到碳點的HOMO能級，從而使其熒光強度得以恢復[58]。此外，Liu等首次揭示了pH響應型碳點熒光強度與其特定表面結構的定量關系。他們認為羧基通過激發態質子轉移影響碳點的非輻射與輻射復合之比，從而導致其熒光強度的變化。與此同時，α-H在β-二羰基烯醇化物中的解離增加了碳點共軛體系的離域程度，導致熒光紅移且強度降低。因此，碳點的熒光強度可通過改變羧基和β-二羰基之比進行切換，從而獲得較理想的pH響應。這項工作有助于更好地理解碳點pH響應的熒光機制，為可控調節其pH響應提供了一種有效的策略，并進一步促進了基于碳點的pH傳感器的合理設計[59]。以上結果表明，在質子化和去質子化作用下，碳點表面的質子可能被轉移到帶負電荷的基團上，并且在適當波長的光照射下，吸收能量躍遷到激發態的電子可能會向碳點表面的正電荷發射。無論是質子亦或是電荷的轉移，都改變了碳點的表面態，因此可以認為質子/電荷轉移改變了pH響應型碳點的光學性能。

圖4 pH響應型碳點的熒光機制——質子/電荷轉移

pH響應型碳點作為碳點家族的重要成員之一，已經在眾多領域展現出了巨大的應用潛力。對pH響應型碳點熒光機制的研究可以幫助我們更好地對其進行可控制備和性能調控。本文結合大量的文獻研究，將pH響應型碳點的熒光機制總結為碳點表面官能團的質子化和去質子化改變了碳點的表面態，導致碳點的碳核和表面官能團之間的相互作用發生改變，或者影響了碳點之間的相互作用，從而可能表現為碳點自身能級變化、自組裝聚集或表面質子/電荷轉移等熒光機制。除上述這些機制外，有可能存在諸如碳點能級變化和碳點聚集、碳點能級變化和質子/電荷轉移、碳點聚集和質子/電荷轉移以及碳點能級變化、碳點聚集和質子/電荷轉移的協同機制。在這些機制的協同作用下，宏觀上表現為碳點的熒光強度或者發射波長發生改變。有關pH響應型碳點的這些熒光機制，還需要在實驗上做進一步的探討。

3 pH響應型碳點在生物醫學方面的應用

pH響應型碳點因其優異的生物相容性和低毒性，在生物醫學領域顯示出了廣闊的應用前景。

目前主要應用于pH傳感、生物成像和癌癥治療等領域，如圖5和表2所示。

圖5 pH響應型碳點在生物醫學方面的應用

表2 pH響應型碳點及其復合材料在生物醫學領域的主要應用

注：PgP：聚乙二醇-g-(甲酰苯甲酸/半胱胺/溴乙胺)-共軛聚(二甲氨基乙基丙烯酸-甲基丙烯酸共羥乙基酯)；CDs-Pt(Ⅳ)-PEG：碳點-順鉑(Ⅳ)-聚乙二醇藥物遞送系統；CA-CDs：碳點與海藻酸鈣復合的水凝膠薄膜；MSNs-SS-CDP-AA：碳點通過二硫鍵連接到介孔二氧化硅納米顆粒(MSN)表面組成的智能納米載體；SCDs-MT：超碳點與線粒體靶向肽復合物；Ce6@IDCDs：chlorin e6與具有光敏性和pH響應性碳點的復合物。

3.1 pH傳感

pH熒光探針一直都是生物醫學領域重要的細胞或生物體內pH的檢測手段，近年來，將碳點作為熒光探針應用于pH傳感也受到了研究人員的廣泛關注。Gao等以對苯二胺和硫脲為碳源制備了具有溶酶體靶向功能的碳點熒光探針。在360 nm激發下，所制備的碳點在4.0～8.0的pH范圍內熒光強度逐漸減弱，且在4.0～7.4的pH范圍內具有良好的線性關系，該碳點有望成為一種優良的pH熒光探針[66]。Liu等以鄰苯二胺為前驅體，通過二次碳化制備了具有良好水分散性的碳點，該碳點表現出明顯的pH依賴性。在450 nm激發下，隨著pH從3.92增加到7.0，碳點(Scy-CDs)熒光強度逐漸增強，如圖6(a)所示。圖6(b)為在4.0～7.0 的pH下碳點熒光強度的線性擬合。碳點的pKa值為5.30，而這恰好與正常溶酶體pH值范圍一致。此外，在較低的酸性條件下，碳點的熒光發生猝滅后，加入半胱氨酸(Cys)或同型半胱氨酸(Hcy)熒光會完全恢復，表現出靈敏的“開-關-開”的熒光現象，該傳感器可用于細胞內溶酶體的pH檢測[67]。Yang等以木質素為碳源、氫氧化鎂和乙二胺分別為摻雜劑和鈍化劑，一步水熱法成功制備了鎂氮共摻雜碳量子點(Mg，N-CQDs)。制備的Mg，N-CQDs在紫外燈照射下發射綠色熒光，熒光量子產率高達46.38%。在405 nm激發下，當碳點溶液的pH從12.0～5.4變化時，Mg，N-CQDs的熒光顏色從藍色變為綠色, 進一步將pH值從5.4降低到2.2時，其溶液的熒光顏色又從綠色變為黃色。隨著pH值從12.0降低到2.2，Mg，N-CQDs的最大吸收峰從400 nm移動到480 nm。同時，Mg，N-CQDs的熒光強度隨著pH從7.0降低到2.2而逐漸降低。這種現象可能是由于Mg，N-CQDs邊緣的金屬配體在酸性條件下發生改變，這種改變使其能夠在細胞內pH檢測中更好地發揮作用[80]。Li等設計了一種基于聚集誘導發射選擇性檢測四環素(TCs)和pH的新型熒光探針。作者以中性紅和硫脲為原料，采用一鍋水熱法合成了具有紅色熒光、低細胞毒性和優異光穩定性的碳點。制備的碳點對pH表現出良好的傳感能力，在3.0～5.0的pH范圍內，碳點的光致發光強度略有變化。隨著pH從5.0增加到9.0，光致發光強度急劇下降, 同時溶液的顏色從粉紅色變為黃色。該pH響應型碳點表現出令人滿意的可逆性、良好的化學穩定性以及對氫離子濃度的特異性。碳點的這些性質有利于雙模pH傳感的實現和細胞內pH的檢測[68]。此外，Safavi，Guo，Chang以及Zhang等課題組也分別在pH傳感領域做了相關的研究工作，并取得了一些很有意義的研究成果[50,69-71,81-82]。

圖6 (a)在450 nm 激發下，Scy-CDs(0.04 mg·mL-1)在水中的發射光譜(pH從7.0降低到3.92)；(b)在556 nm 處的發射下，Scy-CDs 的pH依賴性熒光強度變化[67]。

比率熒光探針能夠有效地消除外界環境的干擾，因此可準確測量細胞及細胞器內的pH，目前已有一些基于碳點的比率型pH熒光探針的報道。例如，Wang等報道了一種使用3-氨基苯基硼酸(3-APBA)作為唯一前驅體，通過一步溶劑熱法合成氮和硼共摻雜的碳點。碳點在單個激發波長下顯示出兩個發射峰，并且這兩個發射峰以相反的趨勢響應pH值的變化，因此作者將碳點作為比率式pH熒光探針應用于細胞內pH的檢測[83]。Xu等以苯二胺和殼聚糖為前驅體，采用水熱法合成了碳點。在380 nm的單波長激發下，在439 nm和550 nm處顯示出雙發射峰。并且隨著pH值的增加，碳點在439 nm處的熒光強度略有下降，而在550 nm處的熒光強度明顯增加，兩個發射峰表現為相反的變化趨勢。研究表明，該碳點具有出色的pH敏感性和抗干擾能力，可以用做比率熒光探針來測量活細胞內溶酶體的pH值，同時還可進行細胞成像[72]。

3.2 生物成像

pH響應型碳點已廣泛應用于生物成像，它可以作為熒光標記物，在改變pH的情況下表現為熒光強度的變化或者熒光顏色的改變，并以此來監測活細胞的生理狀況。Kong等報道了一種基于碳點的無機-有機熒光探針的設計和合成。這是基于碳點的無機-有機雜化納米系統對活細胞和組織中的pH進行雙光子熒光成像和生物傳感的首次報道[84]。Shi等制備了可以應用于人宮頸癌(HeLa)細胞共聚焦熒光成像的碳點，并研究了硼摻雜碳點的pH依賴性熒光成像。硼摻雜碳點(0.6 mg/mL)和HeLa細胞在37 ℃下孵育0.5 h，然后分別在3種不同的磷酸鹽緩沖液(pH=3.5，7.4，10.0)中孵育。研究發現，在pH 為10.0的磷酸鹽緩沖液中，硼摻雜碳點染色的HeLa細胞顯示出強藍色熒光，且熒光亮度隨著pH降低而明顯降低[55]。Shen等制備了量子產率高達68% 的碳點，當pH從1.0提高到13.0時，碳點水溶液迅速由透明/無色變為黃綠色，且無聚集和沉淀。相反，當將碳點溶液調節到酸性條件時，該溶液顏色又變成透明/無色?；谔键c的低細胞毒性和優異的光學性質，已將其成功應用于細胞成像。在405 nm激發下，可以從HeLa細胞觀察到碳點樣品的藍色發射[85]。Choi等利用熒光共振能量轉移(FRET)機理構建了pH/氧化還原活化熒光碳點(FNP)，該碳點可通過熒光“開-關”監測癌細胞的消除。當谷胱甘肽(GSH)的二硫鍵被還原、苯甲酸亞胺在酸性條件下被裂解時，FNP(IR825)在腫瘤細胞中的內化產生了生物成像能力。為了研究FNP(IR825)對谷胱甘肽水平和酸性條件的信號效應，Choi等使用激光共聚焦顯微鏡在不同細胞系中進行了觀察。研究發現，在MDCK細胞中沒有觀察到熒光，在MDA-MB-231細胞中猝滅效應僅在酸處理時喪失，而在處理過的MDA-MB-231細胞中添加谷胱甘肽和酸證實了IR825的完全釋放。同時Choi等還發現，他們的智能納米載體可以在近紅外激光照射下殺死小鼠體內的腫瘤細胞。如圖7所示，用FNP(IR825)和近紅外光譜處理的MDA-MB-231細胞出現死亡細胞數量增加(紅色)的變化，而在近紅外光譜處理的MDCK細胞中沒有觀察到顯著變化(綠色)。因此，這個可調系統可用于評估基于FNP顏色變化的給藥系統的效率，該系統依賴于細胞環境，同時用于光熱治療引導的生物成像以跟蹤治療進度[73]。Gao等制備了具有溶酶體靶向功能的pH響應型碳點。該碳點可以被細胞吸收然后進入溶酶體中，并應用于體外和體內pH變化的監測。脂多糖(LPS)可以模擬細胞內炎癥，作者通過對昆明小鼠背部的3個不同位置皮下注射LPS、LPS+CDs、磷酸鹽緩沖液(PBS)+CDs，進一步探索了CDs在LPS誘導的炎癥模型中可視化pH變化的應用。實驗結果表明，CDs可以作為跟蹤體內pH變化的熒光探針應用于生物成像中[66]。到目前為止，pH響應型碳點作為熒光探針已被廣泛應用于體內或體外生物成像，對活細胞、細胞器以及體內炎癥的監測具有重要的生物學意義。目前，現有的文獻中很少有單獨使用碳點作為細胞器或組織中pH監測的熒光探針，因此需要我們進一步開發具有靶向性的pH響應型碳點對細胞內pH進行更加精準的監測。

圖7 在pH為7.4和6.8時，分別在MDCK正常細胞和MDA-MB-231癌細胞中使用pH/氧化還原活化熒光碳點得到的細胞成像圖[73]。

3.3 癌癥治療

3.3.1 藥物遞送

研究表明，碳點在藥物遞送的應用中可以作為納米載體或納米載體的封端劑，同時還可以增加載體的載藥量。Zhang等研究了一種基于pH響應型碳點的pH和氧化還原雙重響應的CDs-Pt(Ⅳ)-PEG給藥系統，如圖8所示。作者以檸檬酸和氨水為碳源，采用一步水熱法合成碳點，順鉑(Ⅳ)作為藥物前體，醛官能化的單甲氧基聚乙二醇(mPEG-CHO)與碳點-順鉑(Ⅳ)共軛形成對pH響應的苯甲酸亞胺鍵，CDs-Pt(Ⅳ)-PEG藥物遞送系統對癌細胞的細胞毒性與順鉑相當，而對正常細胞的副作用顯著降低。此外，該系統通過高對比度熒光成像實現了對癌細胞的識別。這種基于碳點的給藥系統可以提高藥物的利用效率，減少正常生理條件下的副作用。在癌細胞MGC-803中用CDs-Pt(Ⅳ)-PEG體系分別在7.4和6.8的pH下處理發現，CDs-Pt(Ⅳ)-PEG體系在pH為 6.8的條件下比pH 為7.4時具有更明顯的抑制作用[74]。此外，Feng的團隊也做了類似的研究工作，并得到了良好的實驗結果[86]。隨后Wang等通過將非線性聚乙二醇、殼聚糖和石墨碳點整合到單個納米粒子中，設計了一類生物相容性聚乙二醇-殼聚糖@碳點雜化納米凝膠，用于雙光子熒光(TPF)生物成像和近紅外光雙響應藥物釋放以及協同治療。碳點的復合增強了雜化納米凝膠對疏水性抗癌藥物的負載能力，殼聚糖可以誘導雜化納米凝膠對pH敏感的溶脹/解溶脹，從而在pH為5.0～7.4的重要生理范圍內調節藥物的釋放，并對包埋的pH響應型碳點進行表面調節以實現熒光pH傳感，具有熱敏性的非線性聚乙二醇可以通過嵌入的碳點在近紅外輻射下產生的局部熱來促進藥物釋放。體外實驗結果表明，雜化納米凝膠通過化學-光熱聯合治療的協同效應表現出了很高的治療效果[87]。Sarkar等以蘆薈葉凝膠為碳源制備了pH響應型碳點，并設計制備了海藻酸鈣(CA)水凝膠膜，旨在控制抗生素萬古霉素在胃腸道(GI)中的遞送。與CDs相比，CA/CDs膜的載藥量從38%提高到89%。此外，加入β-環糊精后萬古霉素的吸收能力提高了96%。萬古霉素通過CA/CDs膜的釋放在pH 1.5時更明顯，這接近胃的pH值，并且發現在pH 1.5和β-環糊精共存時萬古霉素的釋放速率降低，在120 h內達到56%。CA/CDs水凝膠膜在pH 1.5和β-環糊精共存時的高藥物吸收能力和較低的釋放速率可作為萬古霉素胃區控釋的給藥載體，為口服萬古霉素提供一種潛在的選擇[75]。Jiao等通過二硫鍵將pH響應型熒光碳點引入到介孔二氧化硅納米粒子表面，研制了一種智能納米載體用于氧化還原響應的藥物控釋和體內生物成像。使用多柔比星(DOX)作為模型藥物以評估氧化還原反應的體外藥物釋放，結果表明，所制備的MSNs-SS-CDPAA/DOX在pH 7.4和pH 5.0的磷酸鹽緩沖液中顯示出高度氧化還原響應的藥物釋放，并具有實時成像能力以監測癌癥治療過程中的細胞行為[76]。以上結果表明，pH響應型碳點可以作為納米載體或納米載體的封端劑在藥物遞送中發揮重要作用。

圖8 CDs-Pt(Ⅳ)-PEG納米給藥系統示意圖[74]

3.3.2 光熱治療/光動力治療

光熱治療(PTT)是利用光敏劑在激光照射條件下產生熱療、有效殺死癌細胞并抑制腫瘤轉移的一種新興癌癥治療方法。碳點由于其優異的光熱轉換性能，已有研究將其作為PTT試劑。Zhang等以檸檬酸和雙氰胺為前驅體，采用水熱法制備了一種具有pH響應特性的智能碳納米點，用于癌細胞的選擇性光熱治療。在中性條件下，該碳納米點在紅外區域附近沒有吸收，而在弱酸性條件下，碳點發生聚集并在近紅外區域附近表現出明顯的吸收，因此可以將其應用于腫瘤的光熱治療。實驗表明，碳納米點能夠在溶酶體中選擇性內化，智能碳納米點在癌細胞的溶酶體中內化后，癌細胞中較低的pH環境導致智能碳納米點更嚴重的聚集狀態，與未內化智能碳納米點的癌細胞相比，內化了智能碳納米點的癌細胞可以通過更大的光收集效應來提高PTT效應[77]。類似地，Shen等也以檸檬酸和雙氰胺為前驅體，采用水熱法并通過在酸性環境下自組裝制備了小尺寸pH響應型碳點(約5 nm)，調節碳點的pH值構建了具有高可見和近紅外光吸收的新型SCD，所制備的SCD具有優異的光熱轉換效率和良好的生物相容性。進一步通過在SCD表面修飾線粒體和癌細胞靶向肽，以獲得對癌細胞選擇性、線粒體靶向的PTT敏感劑。結果表明，靶向SCD通過近紅外光熱療法精準損傷癌細胞，癌細胞和正常細胞的存活率差異高達70%，表明該方法具有高特異性選擇[78]。

光動力治療(PDT)是指在適當的光源照射下，光敏劑產生的活性氧(ROS) 具有非常強的細胞毒性,可以殺滅癌細胞。Kim等以檸檬酸和1-(3-氨基丙基)咪唑(API)為碳源，通過微波和透析兩步法合成了負載chlorine6(Ce6)的咪唑化pH響應型碳點(Ce6@IDCDs)。在pH為6.5的條件下，發現Ce6@IDCDs復合體系被破壞，這說明在該pH值時脫質子化咪唑的質子化導致Ce6@IDCDs解體。細胞實驗表明，在腫瘤pH環境下，表面咪唑質子化導致封裝在IDCD中的Ce6泄漏，從而產生更多單線態氧，與pH值為7.4的Ce6@IDCDs相比增加了2.15倍，并且在激光照射下成功地在腫瘤組織中引發了PDT效應。因此，Ce6@IDCDs激光照射很可能成為基于PDT的多種腫瘤免疫治療的強大治療平臺[79]。

綜上所述，pH響應型碳點不僅在監測活細胞和生物體內的pH變化方面具有很好的應用前景，而且在癌癥治療方面作為藥物載體或者光敏劑也發揮著重要的作用。這些報道為我們進一步開發pH響應型碳點在生物醫學中的重要應用指明了方向。

4 總結與展望

碳點以其獨特的熒光特性、低毒性以及良好的生物相容性，在生物醫學領域的應用中顯示出巨大的潛力。本文對pH響應型碳點的熒光機制(以質子化和去質子化為核心機制，具體表現為能級變化、碳點聚集以及質子/電荷轉移等機制)及其在生物醫學領域的應用(pH傳感、生物成像以及癌癥治療等)進行了系統的闡述。雖然有關pH響應型碳點的研究報道很多，但無論是熒光機制，還是在生物醫學領域的應用，都有待于進一步探索。簡述如下:

(1)到目前為止，pH響應型碳點的熒光機制仍然存在爭議，有待進一步深入研究。諸如將揭示pH響應型碳點熒光機制的宏觀光學性質和微觀表征有機結合起來，或者利用第一性原理計算不同pH響應型碳點對應的能級寬度等來進一步探究其熒光機制。同時，在pH響應型碳點現有的熒光機制基礎上，通過實驗和理論研究進一步挖掘新的機制。

(2)碳點的表面官能團往往影響著碳點的熒光性能，因此我們有必要設計一種能夠定量調控碳點表面官能團的實驗來更好地研究碳點對pH響應的機理。深入探討pH響應型碳點表面官能團和熒光機制之間的關系，為發展和設計可利用的pH熒光探針提供實驗基礎和理論支撐。

(3)pH響應型碳點在pH傳感、生物成像以及癌癥治療方面的研究已有很多，然而對將其應用于光熱治療、光動力治療以及光熱和光動力協同治療的研究很少，需要對pH響應型碳點在光熱/光動力治療方面的研究工作做深入的探索。

(4)目前對于由綠色環保的生物質碳源為前體來合成pH響應型碳點的報道較少，應該充分發揮生物質碳點先天無毒性及其藥食同源的優勢，積極探索pH響應型生物質碳點基多功能熒光探針，使其在生物醫學領域大放光彩。

(5)拓寬pH響應型碳點的應用范圍，目前其多應用在生物醫學上的生物成像和癌癥治療方面，應當積極發展對pH響應型碳點在抗菌材料、傷口愈合以及促進成骨等其他領域的應用。

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