超聲復合酶法提取藍靛果多糖優化及紅細胞溶血保護作用

李小慶，修玥，唐博，張玉，安穎，徐雅琴

（東北農業大學文理學院，黑龍江 哈爾濱 150030）

天然植物多糖具有抗氧化、抗腫瘤、降血糖、降血脂、抗凝血和免疫增強等作用，因此受到研究者的廣泛關注[1-2]。多糖作為天然抗氧化劑，可清除體內自由基，對治療疾病和保護人體健康大有益處。目前評價體外抗氧化活性的方法通常采用化學方法，如ABTS法、DPPH法、羥自由基法、超氧陰離子自由基法等[3-4]。而生物體內氧化過程極其復雜，導致化學方法測定的結果不能很好同生物體內的實際情況相符。因此，在化學方法評價的基礎上需進一步結合生物實驗進行評價。目前細胞生物學法已成為評價天然產物抗氧化活性及探討作用機制的重要手段，但應用于多糖抗氧化性的研究相對較少[5-6]。

多糖的提取技術是多糖研究及應用的基礎，如何簡化提取工藝，提高多糖得率是多糖研究的關鍵問題。多糖提取方法包括溶劑（水）提取法、酶提取法、超聲輔助提取法、微波輔助提取法、超聲波輔助-酶法、微波輔助-酶法等[7-9]。超聲波輔助提取法利用超聲波的空化作用、機械作用以及熱效應來加速植物細胞壁的破碎，具有環境友好、提取時間短、提取率高等優點[8]。復合酶法提取通過酶解反應，破壞植物細胞壁，強化傳質過程，進而提高多糖得率，具有條件溫和、雜質易除等優點[10]。超聲復合酶法可綜合超聲提取和復合酶提取方法的優點，現已廣泛應用于植物多糖的提取[8，11]。

藍靛果，學名藍靛果忍冬（Lonicera aerulea L.），是一種新興的小漿果資源[4]。藍靛果果實內富含黃酮類、花色苷、糖類、維生素和礦物元素等物質，具有抗氧化、降血糖、抗菌、抗腫瘤、護肝的功效[12-14]。目前，國內外針對藍靛果果實的研究主要集中在黃酮類、花色苷等物質，對于藍靛果多糖的研究報道較少[14-15]，關于超聲復合酶法優化藍靛果多糖的提取工藝及采用細胞生物學方法評價抗氧化性的研究未見報道。本文以藍靛果果實為原料，利用響應面法優化超聲復合酶法藍靛果多糖提取工藝，并測定其對紅細胞損傷的保護作用。本研究為藍靛果果實多糖高效利用提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

藍靛果果實：黑龍江省農科院牡丹江農科所；大孔吸附樹脂D4006：南開大學化工廠；兔紅細胞：廣州鴻泉生物科技有限公司；丙二醛（malondialdehyde，MDA）試劑盒、谷胱甘肽（glutataione，GSH）試劑盒：南京建成科技有限公司；其他所用試劑均為國產分析純。

超聲破碎儀（JY92-IIV型）：寧波新芝生物科技股份有限公司；冷凍干燥機（FDU-1100型）：東京理化機械株式會社；可見分光光度計（WFJ-7200型）：北京普析通用儀器有限公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 單因素試驗

準確稱取藍靛果果實5.0 g，加入125 mL去離子水，超聲功率為300 W，超聲時間為40 min，以多糖得率為指標，采用不同pH值（2.5～6.5）、果膠酶添加量（0.1%～0.9%）、纖維素酶添加量（0.1%～0.9%）進行超聲復合酶法提取試驗，研究不同提取條件對提取效果的影響。藍靛果果實總糖含量采用苯酚硫酸法測定[16]，還原糖含量采用3，5-二硝基水楊酸比色法測定[17]，多糖質量及得率計算公式如下。

式中：m為藍靛果果實的質量，g；m1為提取液中多糖質量，g。

1.2.2 響應面優化試驗設計

以pH值、果膠酶添加量、纖維素酶添加量為自變量，多糖得率為響應值進行三因素三水平的Box-Behnken響應面試驗，并選擇二次多項式方程對模型進行擬合[7]。

1.2.3 驗證試驗

在最佳提取條件下進行3次重復試驗。將試驗值與預測值進行比較，以確定模型的有效性和準確性。

1.2.4 藍靛果果實多糖的制備

利用優化試驗得到的最佳條件提取藍靛果多糖，沸水浴滅酶10 min。提取液經抽濾，濃縮，80%乙醇醇沉、4℃冰箱靜置過夜，所得沉淀即為藍靛果粗多糖。參考文獻[18]的方法，利用D4006型大孔樹脂純化藍靛果粗多糖，得到多糖命名為BHP，進行活性試驗測定。

1.2.5 多糖BHP對紅細胞溶血保護作用

1.2.5.1 紅細胞懸浮液的制備

將6%兔紅細胞用阿氏液稀釋成體積分數為3%紅細胞懸浮液，取1.0 mL體積分數為3%兔紅細胞懸浮液，分別加入0.5 mL不同濃度的多糖溶液和1.0 mL的生理鹽水，于37℃孵育10 min，然后加入1.5 mL H2O2（1 mmol/L）溶液，37℃水浴條件下反應2 h得到紅細胞多糖懸浮液。

1.2.5.2 H2O2誘導的氧化損傷紅細胞溶血率的測定

取出200 μL的反應混合液，加入4.0 mL生理鹽水，2 000 r/min離心10 min，取上清液，在415 nm處測吸光度A1，相同條件下，用4.0 mL去離子水代替生理鹽水得到吸光值A2，每組平行3次。

1.2.5.3 H2O2誘導的氧化損傷紅細胞MDA和GSH含量的測定

取紅細胞多糖懸浮液為測定樣品，生理鹽水作為空白對照組，VC作為陽性對照組，按照試劑盒說明書步驟，測定紅細胞中MDA和GSH含量。

1.3 數據分析

所有試驗數據均以平均數±標準誤差表示，采用Minitab 19.0軟件進行響應面試驗分析。

2 結果與分析

2.1 單因素試驗結果

不同pH值、果膠酶添加量和纖維素酶添加量對多糖得率影響見圖1。

圖1 不同因素對多糖得率的影響Fig.1 Effects of different factor on the polysaccharides yield

由圖1A可知，隨著pH值的不斷增加，多糖得率呈現先增大后減小的趨勢，當pH值為3.5時多糖提取率達到最高，當pH值繼續增加后，多糖得率有明顯下降趨勢，說明pH3.5更利于多糖的溶出。原因可能是pH值為3.5時更適合兩種酶發揮活性。適宜的pH值是保證酶活性的關鍵因素，pH值過高或過低會導致酶的活性減弱甚至喪失[19]。由圖1B可知，在果膠酶添加量為0.1%～0.7%的范圍內，多糖得率隨著果膠酶添加量的增加而逐漸增大。當添加量達到0.7%時，多糖得率最高；添加量超過0.7%，多糖得率開始降低，故果膠酶的最適添加量為0.7%。由圖1C可知，隨著纖維素酶添加量的不斷增加，多糖得率呈現先上升后下降的趨勢，當添加量達到0.5%時，多糖得率達到最大；再增加酶添加量，多糖得率開始緩慢下降，故纖維素酶的最適添加量為0.5%。原因是果膠酶和纖維素酶均能通過酶解作用破壞細胞壁，使得細胞內多糖的有效成分溶出[20-21]。當酶添加量升高時，酶與底物接觸的面積變大，破壞了細胞壁的網狀結構，使多糖可以更好地溶出；但當果膠酶添加量超過0.7%，纖維素酶添加量超過0.5%時，酶分子逐漸處于過飽和狀態，導致多糖得率略微下降[22]。

2.2 響應面法優化提取工藝結果

2.2.1 響應面分析結果及方差分析

響應面試驗設計方案及結果如表1所示。

表1 響應面試驗設計及響應值Table 1 Experimental results of response surface analysis

將試驗結果用Minitab 19.0軟件進行回歸擬合，得到回歸方程為Y=2.824+0.464A+10.72B+8.375C+0.675AB-0.200AC-1.375BC-0.123 5A2-7.962B2- 5.838C2。對回歸模型進行方差分析，結果見表2。

表2 回歸模型方差分析Table 2 Variance analysis of the regression model

由表2結果可知，本試驗二次方程模型顯著（P＜0.000 1）。失擬項P=0.102 2＞0.050 0，說明回歸模型擬合度很好，該數學模型可以推測該試驗的結果。預測值與試驗值具有高度的相關性（R2=0.989 4），變異系數較低（0.51%），說明模型方程可以較好地反映真實試驗值，具有較高的準確性[7]。模型準確性分析見圖2。

圖2 模型準確性分析Fig.2 Accuracy analysis of model

圖2的結果可進一步證明模型的準確性。圖2A中各數據點分布幾乎在同一條直線上，未發生嚴重的偏離現象，殘差符合正態分布規律。在圖2B中，各個殘差的分布分散且無規律，均處在合理的范圍內，說明殘差數據正常；殘差與順序圖如圖2C所示，該圖中殘差圍繞中心線隨機分布，說明殘差獨立于其他殘差，每個響應值與擬合的回歸相比不存在異常點。

此外，由表 2 可知，一次項 B、C，二次項 A2、B2、C2對多糖得率的影響極顯著（P＜0.01）。各因素兩兩之間的相互作用對多糖得率的影響的大小順序為AB＞BC＞AC；各單因素的平方對多糖得率的影響的大小順序為B2＞C2＞A2；不同因素對藍靛果多糖得率影響的順序為B＞C＞A。

2.2.2 多糖最佳提取條件的確定和驗證試驗

根據Minitab軟件，得到多糖的最佳提取條件如圖3所示。

圖3 提取條件的優化Fig.3 Optimization of extraction condition

由圖3可知，最佳提取條件為pH 3.53、果膠酶添加量0.77%、纖維素酶添加量0.57%，在此條件下多糖得率達到10.17%?？紤]到實際操作，選取多糖提取工藝條件為pH 3.5、果膠酶添加量0.8%、纖維素酶添加量0.5%，試驗結果為藍靛果多糖得率（10.08±0.14）%。說明該回歸方程與實際情況擬合較好，充分驗證了所建模型的正確性與可靠性。該方法和單獨超聲波提取藍靛果多糖得率（8.31±0.23）%[23]、復合酶法提取藍靛果多糖得率（8.72±0.18）%相比，得率分別增加了（1.77±0.09）%和（1.36±0.04）%。

2.3 H2O2誘導的紅細胞溶血的保護作用

2.3.1 H2O2誘導的紅細胞氧化損傷溶血率

不同濃度多糖樣品對H2O2誘導的紅細胞氧化損傷溶血率的影響如圖4所示。

圖4 多糖對紅細胞溶血保護作用Fig.4 Protective effect of the polysaccharides on the hemolysis of erythrocytes

由圖4可知，不同濃度多糖和VC均能有效地抑制由H2O2誘發的紅細胞氧化性溶血，但是多糖對紅細胞溶血的保護作用小于對照VC。隨著多糖濃度的增加，紅細胞溶血率逐漸減小。樣品濃度為4.0 mg/mL時，VC和多糖BHP可使由H2O2誘導的紅細胞溶血率分別降至（16.15±0.48）%和（29.08±0.73）%，同未加多糖相比，紅細胞溶血率減少（61.82±0.10）%。

2.3.2 H2O2誘導的紅細胞氧化損傷MDA含量的測定

不同濃度多糖樣品對H2O2誘導的紅細胞氧化損傷的MDA含量的影響如圖5所示。

圖5 多糖對H2O2誘導紅細胞氧化損傷的MDA含量的影響Fig.5 Influence of the polysaccharides on MDA levels of erythrocytes oxidative damage induced by H2O2

脂質過氧化物MDA是生物膜中的多不飽和脂肪酸受到自由基的攻擊產生的，其含量高低能夠反映細胞膜受損害的程度，因此，測定MDA含量可以間接代表機體氧化損傷的程度[24-25]。由圖5可知，當加入多糖或者VC后，紅細胞內的MDA含量明顯降低并且呈現劑量關系。當多糖或者VC濃度為4.0 mg/mL時，紅細胞內 MDA 含量最低，分別為（38.05±3.46）、（18.31±1.07）nmol/mL。同未加多糖和VC相比，MDA含量分別減少（25.85±1.51）%、（45.59±3.90）%?？梢姸嗵悄軌虮Ｗo紅細胞免受氧化損傷，但是保護作用小于VC。

2.3.3 H2O2誘導的紅細胞氧化損傷GSH含量的測定

GSH是一種重要的抗氧化劑，它能使血紅蛋白及其它輔因子免受氧化損傷，GSH含量的多少是衡量機體抗氧化能力大小的重要因素[26]。不同濃度多糖樣品對H2O2誘導的紅細胞氧化損傷的GSH含量的影響如圖6所示。

圖6 多糖對H2O2誘導的紅細胞氧化損傷的GSH含量的影響Fig.6 Influence of the polysaccharides on GSH levels of erythrocytes oxidative damage induced by H2O2

由圖6可知，隨著多糖濃度增加，GSH含量逐漸增大。VC和多糖BHP體系的GSH值最高達到（15.36±1.07）、（13.21±1.07）mg GSH/L。同未加多糖或者 VC體系相比，GSH含量增加了（6.79±0.36）%、（8.93±0.36）%。

3 結論

在超聲功率300 W、超聲時間40 min、料液比1∶25（g/mL）的條件下優化復合酶法提取藍靛果果實多糖，響應面分析得到回歸模型合理。最佳提取條件為pH 3.5，果膠酶添加量0.8%、纖維素酶添加量0.5%。在此條件下，多糖得率為（10.08±0.14）%，接近預測值10.17%。藍靛果多糖對紅細胞氧化損傷具有一定的保護作用，當多糖濃度為4.0 mg/mL時對紅細胞氧化損傷的保護作用最強，紅細胞溶血率與MDA含量分別減少了（61.82±0.10）%和（25.85±1.51）%，GSH 含量增加了（6.79±0.36）%?？梢娝{靛果多糖具有作為天然抗氧化劑的潛力。