植物源防腐劑的制備及抑菌機理研究

張梅，李曉君，*，成悅，張志軍，渠志燦

（1.中北大學化學工程與技術學院，山西 太原 030051；2.山西納安生物科技股份有限公司，山西 太原 030006）

防腐劑是指以抑制微生物生長和繁殖為目的而加入產品的一種（類）物質，是產品設計中重要的添加劑，不僅可以保障產品在生產和貨架期的穩定，同時可有效防止二次污染。傳統的化學合成防腐劑種類繁多[1]，部分防腐劑在應用過程存在許多問題，如食品防腐劑超標會引發致病的潛在風險，部分化妝品防腐劑會引發皮膚過敏等不良反應[2]，同時近年來大眾越來越追求純天然、綠色產品，越來越多的企業開始尋求新的安全無害的防腐替代方案。

植物提取物（以下簡稱植提物）以其綠色、安全等特性成為化學防腐劑的最佳替代品[3-5]。但是單一的植提物其抑菌活性和廣譜性有限，通過組合復配開發新型防腐劑顯得尤為重要?；诖?，本文以9種植提物對3種常見污染微生物的抑菌強弱及廣譜性為依據，從中篩選出4種植提物，并進一步復配得到一種抗菌性較強的植物源防腐劑，同時通過測定植物源防腐劑對大腸桿菌細胞膜通透性、細胞壁完整性等的影響來探究其抑菌機理，為開發新型綠色、安全、高效的植物源防腐劑提供理論支撐。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、白色念珠菌：中國普通微生物菌種保藏管理中心；連翹精油、無花果精油、丁香精油：江西億森源植物香料有限公司；紫蘇提取物、丁香提取物、無花果提取物（均為水提物）：中北大學生物工程實驗室提供；2%連翹苷、銀杏黃酮19C、銀杏黃酮20C：寧波瑞源生物科技有限公司；復配防腐劑（組分：1.0%～1.6%5-氯-2-甲基-4-異噻唑啉-3-酮、0.3%～0.5%2-甲基-4-異噻唑啉-3-酮、0.7%～0.8%氯化鎂、20%～25%硝酸鎂、水）：大連百傲化學股份有限公司；牛肉膏、蛋白胨、氯化鈉、瓊脂、二甲基亞砜、無水乙醇、葡萄糖、牛血清蛋白、丙烯酰胺、甲叉雙丙烯酰胺、考馬斯亮藍G-250、巰基乙醇、2.5%戊二醛、磷酸二氫鉀、磷酸氫二鉀（均為分析純）：上海阿拉丁生化科技股份有限公司。

可見分光光度計（JH-14-04）：上海菁華科技儀器有限公司；臺式恒溫培養搖床（FLY-200B）：深圳市愛特爾電子科技有限公司；立式壓力蒸汽滅菌器（YXQLS-50S）：北京同德創業科技有限公司；超凈工作臺（VD-1320）：上海市金鵬分析儀器有限公司；酶標分析儀（DNM-9602G）：北京普朗新技術有限公司；電導率儀（DDS-11A）：杭州奧立龍儀器有限公司；電泳儀（DYY-12）：北京市六一儀器廠；掃描電子顯微鏡（SU8010）：日本日立儀器有限公司。

1.2 植物提取物的篩選

1.2.1 菌懸液的制備

將菌種轉移至LB液體培養基中，37℃（真菌轉移至PDA培養基，28℃）、120 r/min于恒溫培養箱中培養，每隔1 h用分光光度計測其在600 nm處的OD值，用比濁法[6]將菌液濃度調至107CFU/mL備用。

1.2.2 植物提取物的濃度梯度

精油類：連翹精油（編號1#）、無花果精油（編號2#）、丁香精油（編號 3#），濃度梯度為 30%、20%、10%、1%、0.5%、0.25%、0.125%；其他植物提取物：紫蘇提取物（編號 4#）、2%連翹苷（編號5#）、丁香提取物（編號6#）、銀杏黃酮 19C（編號 7#）、銀杏黃酮 20C（編號 8#）、無花果提取物（編號9#），濃度梯度為100%、90%、80%、40%、20%、5%、2.5%、1.25%。精油類稀釋溶劑為4%二甲基亞砜溶液，其他植提物稀釋溶劑為水。

1.2.3 最小抑菌濃度（minimum inhibitory concentration，MIC）的測定

MIC值測定采用96孔板法，確定菌懸液的菌落形成單位（CFU）滿足 106CFU/mL～108CFU/mL后，將試驗組（各植提物＋菌液）、陰性對照組（無菌水＋菌液）、空白組（無菌水）分別加入到無菌的96孔板中，在37℃（真菌28℃）培養0、12、24 h后于600 nm處測其OD值，對比OD600得出MIC值，每個樣品做3組平行。通過比較9種提取物對3種供試菌的抑菌強弱及廣譜性，篩選出4種植提物進行后續試驗。

1.3 4種植提物的復配

通過1.2篩選出4種植提物，分別為連翹精油（編號 1#）、無花果精油（編號 2#）、丁香精油（編號 3#）、紫蘇提取物（編號4#），用棋盤稀釋法[7-8]將4種植提物進行復配，首先兩兩復配，然后選取有聯合作用的兩種植提物與第3種植提物進行復配，以此類推。以各提取物MIC值的1/8、1/4、1/2、1倍、2倍進行聯合，示意圖見圖1。

圖1 棋盤稀釋法示意圖Fig.1 Schematic diagram of chessboard dilution method

在96孔板中，保證每個孔內所加液體體積一致，平均每個孔做3組平行。MIC值的測定同1.2.3，通過以下公式計算復配強度（compound strength，CS），判斷其復配抑菌效果。

式中：CS≤0.5為協同作用；0.5＜CS≤1為相加作用；1＜CS≤2 為無關作用；CS＞2 為拮抗作用。

1.4 植物源防腐劑抑菌機理分析

按1.3復配后將得到3個配方，以抑菌能力及廣譜性為原則，選擇最佳配方，并選擇抑菌性較強的100%無花果精油作為對照，以大腸桿菌作為試驗菌種研究抑菌機理。

1.4.1 植物源防腐劑對3種供試菌MIC值測定

方法同1.2.3。

1.4.2 細胞膜通透性試驗

細胞膜通透性指細胞膜遭到破壞后，胞內的物質釋放到胞外的程度。細胞膜完整性可通過K+滲透試驗及核酸滲漏試驗有效反映。

1.4.2.1 K+滲透試驗

參照文獻方法[9-11]并稍作修改。取對數生長期的菌懸液，8 000 r/min離心10 min，棄去上清液，用5%葡萄糖溶液洗滌3次，重懸菌體調節至107CFU/mL，分別加入無菌水、無花果精油（編號2#）、植物源防腐劑（編號BP）、復配防腐劑（編號MIT）使其最終濃度為各自的0.5 MIC，于37℃下培養4 h。然后8 000 r/min離心10 min，取上清液測定電導率L1；測定葡萄糖溶液的電導率L0；測定不含菌體、加入不同抑菌劑的葡萄糖溶液的電導率L3；取另一份不加抑菌劑的菌懸液煮沸5min后測定上清液電導率L2，細胞內膜的滲透性用相對電導率C來表示。

1.4.2.2 核酸滲漏試驗

參照Lv等的方法[12]并稍作改動。取對數生長期的菌懸液8000r/min離心10min，棄去上清液，用0.067mol/L的磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered solution，PBS）（pH7.2）洗滌沉淀3次，用PBS重懸至107CFU/mL得到菌體沉淀和PBS的混合液，混合液分別加入無花果精油（編號2#）、植物源防腐劑（編號BP）使其最終濃度為各自的0.5MIC，以加無菌水的混合液作為陰性對照，加復配防腐劑（編號MIT）的混合液作為陽性對照，37℃恒溫振蕩培養4 h，10 000 r/min離心10 min，測定上清液OD260值即為核酸滲漏量，陰性對照組以PBS為參比，試驗組以加入抗菌劑的PBS為參比。

1.4.3 十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis，SDSPAGE）分析

參照Xing等[13]的方法稍作改動。取大腸桿菌菌懸液，分別加入無花果精油（編號2#）、植物源防腐劑（編號BP）使其最終濃度為各自的0.5MIC，以加無菌水的菌懸液作為陰性對照，加復配防腐劑（編號MIT）的菌懸液作為陽性對照，分別加100 μL樣品緩沖液，37℃下分別孵育 1、3、6 h，8 000 r/min 離心 1 min，取 20 μL上清液進行SDS-PAGE。濃縮膠和分離膠的濃度分別為5%和12.5%，電泳結束后用考馬斯亮藍染液染色并脫色處理。

1.4.4 掃描電鏡分析

參照文獻方法[14]并稍作修改。取對數期的菌懸液，分別加入無花果精油（編號2#）、植物源防腐劑（編號BP）使其最終濃度為各自的0.5MIC，以加無菌水的菌懸液作為陰性對照，加復配防腐劑（編號MIT）的菌懸液作為陽性對照，37℃、120 r/min培養3 h，8 000 r/min離心10 min，棄去上清液，用0.067 mol/L的PBS（pH7.2）洗滌沉淀3次，重懸至108CFU/mL。然后用預冷的2.5%戊二醛重懸，4℃下固定24 h后8 000 r/min離心5 min，棄去上清液，按順序分別用30%、50%、70%、80%、90%、100%乙醇脫水，每次靜置10 min，最后將酒精換為叔丁醇，冷凍干燥，噴金后進行掃描電鏡觀察。

1.5 統計分析

試驗均設置3次平行，采用Origin 2019進行繪圖。

2 結果與分析

2.1 9種植物提取物對3種供試菌的MIC值測定結果

不同植物提取物對3種供試菌的MIC值見表1。

表1 不同植物提取物對3種供試菌的MIC值Table 1 MIC values of different plant extracts against three tested bacteria

由表1可知，連翹精油、無花果精油、丁香精油、紫蘇提取物對3種供試菌抑制作用較強，因此選擇這4種植提物進行后續研究。

2.2 4種植提物復配結果

4種植提物聯合對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、白色念珠菌的CS值見表2、表3、表4。

表2 4種植提物聯合對大腸桿菌的CSTable 2 Four plant extracts combined with CS against Escherichia coli

表3 4種植提物聯合對金黃色葡萄球菌的CSTable 3 Four plant extracts combined with CS against Staphylococcus aureus

續表3 4種植提物聯合對金黃色葡萄球菌的CSContinue table 3 Four plant extracts combined with CS against Staphylococcus aureus

表4 4種植提物聯合對白色念珠菌的CSTable 4 Four plant extracts combined with CS against Candida albicans

由表2、表3、表4可知，4種植提物對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、白色念珠菌得到3種復配結果，分別為配方Ⅰ（0.062 5%連翹精油-0.031 25%無花果精油-0.125%丁香精油-1%紫蘇提取物）、Ⅱ（0.062 5%連翹精油-0.125%無花果精油-0.031 25%丁香精油-1%紫蘇提取物）、Ⅲ（0.062 5%連翹精油-0.031 25%無花果精油-0.125%丁香精油-1%紫蘇提取物），體積比均為1∶1∶1∶1。由于配方Ⅰ、Ⅲ結果一致，考慮到植物源防腐劑抑菌廣譜性，選擇配方Ⅰ為植物源防腐劑最佳配方，即0.062 5%連翹精油-0.031 25%無花果精油-0.125%丁香精油-1%紫蘇提取物。

2.3 植物源防腐劑抑菌機理分析

2.3.1 植物源防腐劑對3種供試菌的MIC值

植物源防腐劑對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、白色念珠菌的MIC分別為0.25%、0.125%、0.25%。

2.3.2 植物源防腐劑對細胞膜通透性的影響

2.3.2.1 K+滲透試驗

不同試驗處理組對K+滲透的影響見圖2。

圖2 不同試驗處理組對K+滲透的影響Fig.2 Effect of different experimental treatment groups on K+permeation

由圖2可知，與陰性對照相比，植物源防腐劑處理組（BP處理組）菌懸液相對電導率增加了82.57%，原因可能是植物源防腐劑能破壞大腸桿菌的細胞膜，導致膜內的K+等電解質離子釋放到菌懸液中導致菌懸液電導率升高[15]，也有可能因為植物源防腐劑進入到大腸桿菌細胞內，破壞了細胞正常生理代謝，導致細胞凋亡，細胞膜破裂。

2.3.2.2 核酸滲漏試驗

不同試驗處理組對核酸滲漏的影響見圖3。

圖3 不同試驗處理組對核酸滲漏的影響Fig.3 Effect of different experimental treatment groups on nucleic acid leakage

核酸在260 nm處有最大吸收，通過測定菌懸液在260 nm處的OD值可有效反映大腸桿菌的核酸滲漏情況。如圖3所示，植物源防腐劑處理組（BP處理組）的核酸含量是陰性對照的3倍，且比純精油的無花果精油處理組（2#處理組）增加接近1倍，但低于陽性對照組。說明植物源防腐劑增加了菌體細胞膜的通透性，導致在正常狀態下處于胞內的核酸大分子通過細胞膜滲漏到胞外，與電導率的變化趨勢一致[16]，李琪孟等[17]研究所得馬鈴薯胰蛋白酶抑制劑的抑菌機理也是通過改變細菌細胞膜的通透性導致核酸滲漏增加，與本試驗研究結果一致。

2.4 SDS-PAGE測定結果

不同試驗處理組對大腸桿菌菌體蛋白質表達的影響如圖4所示。

圖4 不同試驗處理組對大腸桿菌蛋白質表達的影響Fig.4 Effects of different treatment groups on protein expression of Escherichia coli

在作用時間1、3、6 h后，大腸桿菌的蛋白質表達發生顯著變化，表現為條帶由多變少，3個試驗組均能較好地抑制大腸桿菌蛋白質的表達，且由泳道1、2條帶的變化可知，植物源防腐劑對蛋白質表達的影響大于無花果精油，究其原因，可能是植物源防腐劑對大腸桿菌菌體相關蛋白酶的活性有所抑制[18]。

2.5 掃描電鏡結果

圖5為不同試驗處理組大腸桿菌掃描電鏡圖。

圖5 不同試驗處理組大腸桿菌掃描電鏡圖Fig.5 Scanning electron microscopy of Escherichia coli in different experimental groups

由圖5a和圖5b可知，正常生長的大腸桿菌呈棒狀、表面光滑；經植物源防腐劑處理過的大腸桿菌表面出現明顯突起，部分菌體有明顯的扭曲變形（圖5c和圖5d），表明植物源防腐劑可破壞大腸桿菌細胞壁的完整性，從而抑制其生長繁殖；同時無花果精油處理組和陽性對照組也對大腸桿菌細胞壁有較強的破壞作用。究其原因可能是植物源防腐劑含有精油成分，精油類物質脂溶性較強，細菌細胞膜主要由磷脂雙分子層及蛋白質構成，親脂性較強的植物源防腐劑作用于大腸桿菌導致細胞壁被破壞，細菌細胞質膜失去細胞壁保護極易被破壞[19-20]。

3 結論

通過初篩和組合復配，開發出一款由連翹精油、無花果精油、丁香精油和紫蘇提取物組成的植物源防腐劑，其配方為0.062 5%連翹精油-0.031 25%無花果精油-0.125%丁香精油-1%紫蘇提取物，體積比為1∶1∶1∶1；并對植物源防腐劑的抑菌機理進行初步探究，與單一植提物相比，經復配后的植物源防腐劑抑菌能力更強。初步推測植物源防腐劑的抑菌機理為破壞細菌的細胞形態及細胞膜的滲透壓，改變其通透性，再破壞細菌的遺傳物質、蛋白質等結構達到抑菌防腐的目的。本研究說明植物源防腐劑在天然抑菌劑方面有一定的發展前景。