2型糖尿病氣陰兩虛患者血清膽汁酸代謝物的多元分析研究

陳冰婷，楊 建，白 鈺，伊麗則熱·艾拜杜拉，譚惠文，馬曉麗

（新疆醫科大學1藥學院，烏魯木齊 830011；2第四附屬醫院內分泌科，烏魯木齊 830011）

2型糖尿病(T2DM)是一種以血糖持續升高為臨床表現的代謝性疾病，其發病呈現年輕化趨勢,已經成為全球重大健康問題之一[1-2]。中醫將2型糖尿病列為“消渴病”范疇,對糖尿病的辨證分型主要包括陰虛熱盛型、氣陰兩虛型、陰陽兩虛型、血瘀氣滯型,其中氣陰兩虛型最為常見[3-5]。中醫對糖尿病的辨證分型較為主觀，采用現代醫學的技術手段幫助中醫病癥分型是有必要的[6]。膽汁酸（BA）可通過影響腸道激素的分泌參與調節葡萄糖代謝和胰島素分泌[7]，其代謝譜的變化是糖尿病等代謝性疾病發生發展的靈敏指標。進一步完善膽汁酸代謝譜的研究，對糖尿病的診斷及中醫證型研究具有重要的指導意義。本研究采用超高效液相色譜-質譜聯用技術分析研究糖尿病氣陰兩虛患者和正常氣陰兩虛者血清中膽汁酸的含量差異，為氣陰兩虛型糖尿病的臨床診斷和治療提供一種新思路。

1 資料與方法

1.1 一般資料以2015年1月-2018年12月新疆醫科大學第四附屬醫院內分泌科收治的30例2型糖尿病氣陰兩虛患者為糖尿病氣陰兩虛組，其中男16例，女14例，年齡40～65歲，平均年齡（49.87±10.03）歲;選擇同時期25例氣陰兩虛證患者為正常氣陰兩虛組，其中 男10例，女15例，年齡35～60歲，平 均 年齡（48.13±9.49）歲?；颊呔炇鹬橥鈺?，本研究經新疆醫科大學第四附屬醫院倫理委員會通過（20140304-133）。

1.2 診斷標準

1.2.1 西醫診斷標準參照2019年世界衛生組織（WHO）[8]中的診斷標準：（1）有糖尿病癥狀（典型癥狀：多飲、多食、多尿、體質量下降），隨機血糖≥11.1mol/L；（2）空腹血糖≥7.0mmol/L；（3）進行葡萄糖耐量試驗（OGTT）后，餐后2 h血糖≥11.1mmol/L。凡符合上述標準中的任一條者可診斷為糖尿病。

1.2.2 中醫辨證標準參照《中藥新藥治療糖尿病的臨床研究指導原則》[9]中的氣陰兩虛證標準,進行中醫辨證分型,氣陰兩虛型:倦怠乏力,自汗盜汗,氣短懶言,口渴喜飲,五心煩熱,心悸失眠,渡赤便秘,舌紅少津,舌體胖大,苔薄或花剝,脈弦細或細數。

1.3 納入與排除標準

1.3.1 納入標準參照“1.2診斷標準”明確診斷為2型糖尿病氣陰兩虛患者。

1.3.2 排除標準I型糖尿病患者或其他疾病引起的血糖升高；嚴重糖尿病并發癥者；有嚴重的心、肝、腎等并發癥或合并其他嚴重原發性疾病者；妊娠期或哺乳期患者；精神病患者；不愿意配合者。

1.4 血清中膽汁酸含量的測定采集兩組患者早餐前空腹靜脈血，3 000 r/min離心10 min，分離血清，保存于-80℃冰箱中待測。采用超高液相串聯質譜（UPLC-MS/MS）技術的代謝組學方法[10]，建立血清中29種膽汁酸的定量檢測方法，在進行系統的方法學考察后，測定血清中膽汁酸的含量。

1.5 統計學處理采用SPSS 22.0統計學軟件對數據進行統計學分析，計量資料若符合正態分布，采用均數±標準差（±s）表示；不符合正態分布采用中位數（四分位數），以P＜0.05為差異有統計學意義。采用SIMCA軟件(V15.0.2)對數據進行對數轉換加UV格式化處理，對第一主成分進行OPLS-DA建模分析，用交叉驗證后得到的R2Y（模型對分類變量Y的可解釋性）和Q（2模型的可預測性）對模型有效性進行評判，通過置換檢驗對模型有效性做進一步的檢驗。根據變量投影重要度（VIP）＞0及P＜1篩選差異代謝物，對差異代謝物的定量值計算歐式距離矩陣，以完全連鎖方法對差異代謝物進行聚類，并以層次聚類圖進行展示，采用ROC分析以尋找潛在的生物標志物，ROC曲線下的面積（AUC）值越接近1，臨床診斷效能越大，可認為該差異代謝物是潛在的生物標志物。

2 結果

2.1 兩組一般資料的比較兩組間患者性別、年齡、體質指數差異無統計學意義（P＞0.05）。與正常氣陰兩虛組比較，2型糖尿病氣陰兩虛組患者空腹血糖升高，差異有統計學意義（P＞0.05），見表1。

表1 2型糖尿病氣陰兩虛患者和正常氣陰兩虛患者一般資料比較

2.2 血清膽汁酸含量的比較與正常氣陰兩虛組比較，2型糖尿病氣陰兩虛組患者血清中甘氨氨熊脫氧膽酸、?；蛆Z脫氧膽酸、膽酸含量降低，差異有統計學意義（P＜0.05），見表2。

表2 2型糖尿病氣陰兩虛患者和正常氣陰兩虛患者的膽汁酸含量的比較/（nmol/L）

2.3 血清膽汁酸的多元統計分析糖尿病氣陰兩虛組和正常氣陰兩虛組的樣本區分顯著,兩組的R2=0.018 7,Q2=-0.278，Q2的回歸線與縱軸的截距小于零，表明該模型具有良好的穩健性，適合于后續分析的優化,見圖1、2。

圖1 OPLS-DA模型得分散點圖

圖2 OPLS-DA模型的置換檢驗結果圖

2.4 血清膽汁酸差異代謝物的篩選與正常氣陰兩虛組（NH）相比，2型糖尿病氣陰兩虛組（DH）的膽酸、甘氨熊脫氧膽酸、?；蛆Z脫氧膽酸、異石膽酸、熊脫氧膽酸、甘氨鵝脫氧膽酸的含量下降，其中膽酸、甘氨熊脫氧膽酸、?；蛆Z脫氧膽酸變異重要性（VIP）＞1，在兩組間起著重要的作用，見表3。

表3 2型糖尿病氣陰兩虛組和正常氣陰兩虛組的膽汁酸差異代謝物的篩選表

2.5 血清膽汁酸表達量的層次聚類分析圖與正常氣陰兩虛組相比，2型糖尿病氣陰兩虛組中的膽酸、甘氨熊脫氧膽酸、?；蛆Z脫氧膽酸、異石膽酸、熊脫氧膽酸、甘氨鵝脫氧膽酸呈現低表達的趨勢，而石膽酸、脫氧膽酸、12-酮基石膽酸、甘氨膽酸、鵝脫氧膽酸呈現高表達的趨勢，見圖3。

圖3 血清膽汁酸的層次聚類分析圖

2.6 血清膽汁酸生物標志物預測能力評估甘氨熊脫氧膽酸（AUC=0.71）、?；蛆Z脫氧膽酸（AUC=0.66）、膽酸（AUC=0.67），臨床診斷效能較大,被認為是糖尿病氣陰兩虛型患者的潛在生物標志物，能為氣陰兩虛型糖尿病進一步研究提供更多信息，見圖4。

圖4 血清膽汁酸的ROC曲線分析

3 討論

中醫將糖尿病稱為“消渴”，臨床癥狀表現為多飲、多食、多尿、消瘦及疲乏等特征[11]。2型糖尿病(消渴病)中,氣陰兩虛證是本研究中占比最大的證型且最為常見，氣陰兩虛證患者發病年齡小且病程較其他證型長。在連續血糖監測系統中，氣陰兩虛證型的血糖較其他證型難監測[12]，因此建立一個靈敏的診斷方法對及時干預對糖尿病及并發癥的發生發展和治療起著重要作用。

血清膽汁酸(BA)是脂質吸收和膽固醇代謝的重要調控因子，越來越被認為參與調節與代謝疾病相關途徑，包括脂質和葡萄糖代謝、能量消耗和炎癥等[13-15]。本研究發現12種膽汁酸包括甘氨熊脫氧膽酸、甘氨鵝脫氧膽酸、甘氨脫氧膽酸、甘氨膽酸、?；蛆Z脫氧膽酸、膽酸、熊去氧膽酸、12-酮基石膽酸、鵝脫氧膽酸、脫氧膽酸、異石膽酸、石膽酸承載了氣陰兩虛糖尿病組與正常組的重要信息。

Shimak等[16]的研究證明?；切苋パ跄懰?TUDCA)在嚙齒動物模型和T2DM患者中具有抗炎和改善胰島素敏感性的作用，Liu等人[17]的研究表明膽酸在調節BA動態平衡方面有著重要的作用。本研究結果顯示，甘氨熊脫氧膽酸、?；蛆Z脫氧膽酸、膽酸的含量在2型糖尿病氣陰兩虛組顯著降低，且在ROC分析中甘氨熊脫氧膽酸、?；蛆Z脫氧膽酸、膽酸臨床診斷的效能較大,被認為是2型糖尿病氣陰兩虛型患者的潛在生物標志物。有研究表明[18]，通過外源性補充甘氨熊脫氧膽酸能夠拮抗FXR受體進而起到降低血糖的作用。膽酸是人類主要的膽汁酸，膽酸的缺乏可能會引起多種疾病，可作為受膽汁酸合成障礙影響的患者的治療藥物[19]。有研究[20]認為?；撬峤Y合的膽汁酸在T2DM患者中含量較高，然而在我們的研究中TCDCA表現出下調趨勢。

綜上所述，甘氨熊脫氧膽酸、?；蛆Z脫氧膽酸、膽酸在2型糖尿病氣陰兩虛患者中的含量降低，能為2型糖尿病氣陰兩虛型的現代化診斷和治療提供新的思路。