高效液相色譜串聯傅里葉變換離子回旋共振質譜法鑒定二丁顆粒的化學成分

石松安,張瓚,韓靜,韓飛

(沈陽藥科大學藥學院,遼寧 沈陽 110016)

二丁顆粒是由紫花地丁、半邊蓮、蒲公英、板藍根4味藥材組成的中藥成方制劑,是清火解毒的常用藥,多用于火熱毒盛所致的熱癤癰毒、咽喉腫痛、風熱火眼等[1]。除了常用的清熱解毒功能外,二丁顆粒還有抑菌抗炎的作用,在臨床上被用于治療急性咽炎和慢性支氣管炎[2-4]。研究表明,秦皮甲素、秦皮乙素是君藥紫花地丁主要活性成分,具有抗炎、抗腫瘤作用[5-7],且秦皮乙素作為二丁顆粒的質量控制指標收錄于2020年版《中國藥典》中[1]。表告依春是板藍根中抗病毒的主要活性成分之一[8-9]。此外,蒲公英中含有的單咖啡酰酒石酸、菊苣酸、咖啡酸和阿魏酸等有效成分具有抑菌、抗炎、抗氧化、保肝利膽等藥理作用,臨床用于治療疔瘡腫毒、乳癰、瘰疬、目赤、咽痛、濕熱黃疸等疾病[10-12]。為了全面闡明二丁顆粒的藥效物質基礎,有必要開展其化學成分的鑒定研究。

高效液相色譜串聯傅里葉變換離子回旋共振質譜(HPLC-FT-ICR-MS)具有極高的分辨率、準確度和靈敏度,可以提供最可靠的元素組成和分子式,是測定小分子精確分子量及結構解析的首選方法[13]。本研究采用HPLC-FT-ICR-MS技術對二丁顆粒所含的化學成分進行了分析,為進一步闡釋其藥效物質基礎提供了依據。

1 材料

1260高效液相色譜儀(美國Agilent公司),AG285型十萬分之一天平(瑞士METTLER TOLEDO公司),FA2004型電子天平(上海舜宇恒平科學儀器有限公司),KQ-700DE型數控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司),Solarix 7.0T FT-ICR MS質譜儀(德國Bruker公司),Data Analysis軟件(德國Bruker公司)。

L-精氨酸(純度≥98.0%，批號:MKBD3032V)、鳥苷(純度≥98.0%，批號:AJ0609NA14)、L-苯丙氨酸(純度≥98.0%，批號:H02J11H117318)、秦皮乙素(純度≥98.0%，批號:C25J7Y18390)、地奧司明(純度≥95.0%，批號:Y18S6H1)、漢黃芩苷(純度≥98.0%，批號:R27M10F89336)、L-蘋果酸(純度≥98.0%，批號:S08J12I136815)、原兒茶酸(純度≥98.0%，批號:Z30M6L1)、無水檸檬酸(純度≥98.0%，批號:SM0425GA14)、秦皮甲素(純度≥98.0%，批號:KA0422CA14)、蘆丁(純度≥98.0%，批號:T20N11Z131674)、類葉升麻苷(純度≥98.0%，批號:W14O10C100217)、金絲桃苷(純度≥98.0%，批號:P12S11F124379)、芹菜素(純度≥98.0%，批號:T30A11F112008)購自上海源葉生物科技有限公司;蒙花苷(純度：98.0%，批號:AF9081822)、葒草苷(純度：98.0%，批號:AF20091007)、單咖啡酰酒石酸(純度：98.0%，批號:AF20121103)、黨參炔苷(純度：98.0%，批號:AF20051902)購自成都埃法生物科技有限公司;木犀草苷(純度：99.8%，批號:MUST-15012204)、菊苣酸(純度：99.4%，批號:MUST-15011614)購自成都曼斯特生物科技有限公司;木犀草素(供含量測定用,批號:111520-200201)購自中國藥品生物制品檢定所;腺苷(純度≥98.0%，批號:FY20141101)購自南通飛宇生物科技有限公司。乙腈、甲醇(色譜純,美國Fisher公司)，甲酸(色譜純,成都市科隆化學品有限公司)，純凈水(杭州娃哈哈集團有限公司)。

本研究所用的二丁顆粒由修正藥業集團長春高新制藥有限公司提供,批號:200423D,每袋20 g。

2 方法與結果

2.1 樣品的制備與前處理

2.1.1 對照品溶液的制備 分別取L-精氨酸、鳥苷、L-苯丙氨酸、秦皮乙素、地奧司明、漢黃芩苷、L-蘋果酸、原兒茶酸、無水檸檬酸、秦皮甲素、蘆丁、類葉升麻苷、金絲桃苷、芹菜素、蒙花苷、葒草苷、單咖啡酰酒石酸、黨參炔苷、木犀草苷、菊苣酸、木犀草素、腺苷對照品適量,精密稱定,置于5 mL容量瓶中,用甲醇溶解并定容至刻線,搖勻,制成各對照品貯備液。精密移取各儲備液適量至同一量瓶中,甲醇溶解并定容至刻線,搖勻,制成混合對照品溶液。

2.1.2 供試品溶液的制備 稱取二丁顆粒2.5 g，置于50 mL具塞錐形瓶中,加入60%乙醇10 mL,稱質量,超聲震蕩30 min,放冷至室溫,再次稱質量,用60%乙醇補足減失的質量,搖勻,12 000 r·min-1離心4 min,上清液采用0.22 μm微孔有機濾膜過濾,即得供試品溶液。

2.2 實驗條件

2.2.1 色譜條件 色譜柱:Kinetex 2.6 μm C18色譜柱(150 mm×4.6 mm,2.6 μm),流動相為乙腈(A)-0.1%甲酸水溶液(B),梯度洗脫:0～5 min,5%～10%A;5～10 min,10%A;10～11 min,10%～17%A;11～23 min,17%A;23～33 min,17%～42%A;33～43 min,42%A;43～50 min,42%～55%A;50～55 min,55%A。流速1.0 mL·min-1,柱溫30 ℃,進樣量10 μL。

2.2.2 質譜條件 電噴霧電離(ESI)源;正、負離子掃描模式;質量范圍:m/z100～1 500;毛細管電壓:正離子模式(-4.5 kV)/負離子模式(4.5 kV);霧化氣(N2)壓力:2.0 bar;干燥氣(N2)流速:6 L·min-1;傳輸毛細管溫度:220 ℃;掃描次數:1次;離子飛行時間:0.8 ms;終板補償電壓:-500 V(正離子模式)/500 V(負離子模式);初始碰撞能:20 V,隨離子動態調整;數據采集系統:FTMS Control 2.1,數據處理系統:Data Analysis 4.4。

2.3 HPLC-FT-ICR-MS法鑒定二丁顆粒的化學成分

取二丁顆粒樣品,按“2.1.2”項下方法制備供試品溶液,按“2.2”項下的色譜和質譜條件進樣分析,二丁顆粒供試品溶液和對照品溶液分別在正、負離子2種模式下進樣分析,其基峰離子流色譜圖如圖1～2所示。通過高分辨質譜信號解析、與對照品及文獻數據比對[14-18],在二丁顆粒中共表征了106個化學成分,其中包含33個黃酮類、27個生物堿類、23個有機酸類、7個香豆素類、4個木質素類、3個倍半萜類、1個炔類以及8個其它類型化合物，詳細數據見表1。通過與對照品的保留時間、精確分子量和二級質譜信息比較,準確鑒定了22個化合物,其中黃酮類化合物9個,分別是葒草苷(46號峰)、蘆丁(67號峰)、金絲桃苷(70號峰)、木犀草苷(72號峰)、地奧司明(87號峰)、蒙花苷(93號峰)、木犀草素(95號峰)、漢黃芩苷(96號峰)、芹菜素(100號峰)。生物堿類化合物4個,分別是L-精氨酸(1號峰)、腺苷(5號峰)、鳥苷(6號峰)和L-苯丙氨酸(7號峰)。有機酸類化合物6個,分別是L-蘋果酸(3號峰)、檸檬酸(4號峰)、原兒茶酸(8號峰)、單咖啡酰酒石酸(11號峰)、類葉升麻苷(74號峰)、菊苣酸(99號峰)。香豆素類化合物2個,分別是秦皮甲素(14號峰)和秦皮乙素(28號峰)。炔類化合物1個,為黨參炔苷(88號峰)。

注：A.供試品;B.混合標準品圖1 二丁顆粒供試品和混合標準溶液在正離子模式下的基峰離子流色譜圖Fig. 1 Base peak ion flow chromatograms of Erding Granules and mixed standard solution in positive ion mode

注：A.供試品;B.混合標準品圖2 二丁顆粒供試品和混合標準溶液在負離子模式下的基峰離子流色譜圖Fig. 2 Base peak ion flow chromatograms of Erding Granules and mixed standard solution in negative ion mode

表1 HPLC-FT-ICR-MS鑒定的二丁顆粒中化學成分

(續表一)

(續表二)

(續表三)

2.3.1 黃酮類化合物的質譜解析 化合物72保留時間為18.35 min,在正、負離子一級全掃描模式下分別檢測到其準分子離子峰[M+H]+m/z449.107 81(誤差0.07×10-6)和[M-H]-m/z447.093 39(誤差-0.23×10-6),通過DataAnalysis軟件預測其分子式為C21H20O11。在負離子模式下對其進行碰撞裂解,得到相關的二級碎片離子m/z327.051 31 [M-H-C4H8O4]-和m/z285.040 68 [M-H-C6H10O5]-。裂解方式與文獻報道一致[19],經對照品比對后,確認該化合物為木犀草苷,其裂解方式如圖3所示。

圖3 木犀草苷的碎片離子譜圖(A)和裂解方式(B)Fig. 3 Fragment ion spectrum (A) and cleavage mode (B) of luteolin

2.3.2 有機酸類化合物的質譜解析 化合物4保留時間為1.66 min,在負離子一級全掃描模式下檢測到其準分子離子峰 [M-H]-m/z191.019 99(誤差-1.37×10-6),通過DataAnalysis軟件預測其分子式為C6H8O7。在負離子模式下對其進行碰撞裂解,得到相關的二級碎片離子m/z173.009 20 [M-H-H2O]-、m/z129.019 35 [M-H-CO2]-和m/z111.008 79 [M-H-H2O]-。裂解方式與文獻報道一致[20],經對照品比對后,確認該化合物為檸檬酸,其裂解方式如圖4所示。

圖4 檸檬酸的碎片離子譜圖(A)和裂解方式(B)Fig. 4 Fragment ion spectrum (A) and cleavage mode (B) of citric acid

2.3.3 香豆素類化合物的質譜解析 化合物28保留時間為9.61 min,在正、負離子一級全掃描模式下分別檢測到其準分子離子峰[M+H]+m/z179.033 90(誤差-0.08×10-6)和[M-H]-m/z177.019 49(誤差-0.86×10-6),通過DataAnalysis軟件預測其分子式為C9H6O4。在負離子模式下對其進行碰撞裂解,得到相關的二級碎片離子m/z133.029 36 [M-H-CO2]-。裂解方式與文獻報道一致[18],經對照品比對后,確認該化合物為秦皮乙素,其裂解方式如圖5所示。

圖5 秦皮乙素的碎片離子譜圖(A)和裂解方式(B)Fig. 5 Fragment ion spectrum (A) and cleavage mode (B) of Esculetin

2.3.4 生物堿類化合物的質譜解析 化合物6保留時間為2.26 min,在正、負離子一級全掃描模式下分別檢測到其準分子離子峰[M+H]+m/z284.099 27(誤差-1.13×10-6)和[M-H]-m/z282.084 93(誤差-1.90×10-6),通過DataAnalysis軟件預測其分子式為C10H13N5O5。在正離子模式下對其進行碰撞裂解,得到相關的二級碎片離子m/z152.056 09 [M+H-C5H8O4]+。裂解方式與文獻報道一致[21],經對照品比對后,確認該化合物為鳥苷,其裂解方式如圖6所示。

圖6 鳥苷的碎片離子譜圖(A)和裂解方式(B)Fig. 6 Fragment ion spectrum (A) and cleavage mode (B) of guanosine

3 討論

3.1 色譜條件選擇

本實驗考察了不同流動相洗脫行為,分別為甲醇-0.1%甲酸水溶液、乙腈-0.1%甲酸水溶液、甲醇-0.05%甲酸水溶液、乙腈-0.05%甲酸水溶液,發現乙腈-0.1%甲酸水溶液作為流動相洗脫時各成分色譜峰分離度較好,出峰時間適中;考察了柱溫25、30、35 ℃,發現30 ℃時分離度、峰形較好。綜上所述,最優色譜條件為Kinetex C18色譜柱(150 mm×4.6 mm,2.6 μm);流動相：乙腈(A)-0.1%甲酸水溶液(B);柱溫：30 ℃;進樣量：10 μL。

3.2 提取條件選擇

本實驗考察了不同提取溶劑對二丁顆粒的提取效率的影響。提取溶劑分別為甲醇[22]、70%甲醇[23]、水、乙醇、60%乙醇[5],發現以60%乙醇為提取溶劑時各成分綜合提取率最高;考察了超聲提取和回流提取2種提取方式,發現超聲提取效率優于回流提取;還考察了不同提取時間(15、30、45 min)和提取溶劑體積(10、20、30 mL),發現提取溶劑體積為10 mL,提取時間為30 min時各成分基本提取完全。綜上所述,最優提取條件為10 mL 60%乙醇超聲提取30 min。

本研究采用HPLC-FT-ICR-MS指認出二丁顆粒中106個化合物,準確鑒定了其中22個化合物,推測了84個化合物的結構,初步闡釋了二丁顆粒的化學物質組成,為其進一步的藥效物質基礎研究提供了依據。