不同品系芍藥對灰霉病及葉霉病的抗病性差異

鐘明志,陳 歡,姜媛媛,楊瑞武,張 利*

(1.四川農業大學 理學院，四川 雅安 625000；2.四川農業大學 生命科學學院，四川 雅安 625000)

植物在生長發育過程中，由于自身防御手段有限及外界環境的影響，往往會受到病原菌的侵染，導致植物生長發育過程受阻[1].特別是一些經濟作物，受病害影響導致產量下降、質量降低，嚴重影響經濟效益.在植物與病原菌長期相互作用的過程中，植物自身逐漸形成了以生理生化反應為主要手段抵御病原菌侵染的防御機制[2].植物體內存在的一些防御酶均與植物抗病性密切相關，如超氧化物岐化酶(SOD)、過氧化物酶(POD)、多酚氧化酶(PPO)、苯丙氨酸解氨酶(PAL)、過氧化氫酶(CAT)等[3].

芍藥(PaeonialactifloraPall.)為芍藥科(Paeoniaceae)芍藥屬(PaeoniaL.)，是多年生宿根草本植物[4].以干燥根入藥，具有平抑肝陽、柔肝止痛、養血調經、斂陰止汗等功效[5].灰霉病和葉霉病是致植物壞死病原菌[6]，擁有廣譜的寄生對象，易侵襲老、傷或衰弱的植物[7].芍藥生長周期較長，抗逆性較差，干旱和水澇等易導致芍藥植株枯萎衰敗直至死亡；此外，在生長過程中還易受到灰霉病和葉霉病病原菌的侵染，導致其發育受到影響，嚴重影響經濟效益.Gastón等[8]在智利南部7個地點采集芍藥灰霉病病葉，從中分別分離到了灰霉病菌(Botrytiscinerea)、芍藥芽孢桿菌(Botrytispaeoniae)和葡萄孢霉菌(Botrytispseudocinerea)，在溫室接種試驗中發現3種病原菌都能對芍藥造成損害.Zhao等[9]采集了2個對灰霉病抗性有顯著性差異的芍藥品種“紫峰玉”和“大富貴”，進行了sRNA測序，鑒定出了4個miRNA可能參與芍藥對灰霉病的應答，為芍藥抗灰霉病的分子機制提供依據.芍藥葉霉病最早經藍瑩等[10]鑒定病原為芍藥枝孢霉(CladospriumpaeoniaePass.)，主要危害芍藥的葉和莖，導致芍藥葉片或莖表面生成暗紫紅色小斑點，最終導致植株枯焦甚至死亡，嚴重影響芍藥的經濟價值.李麗等[11]利用rDNA-ITS以及形態學鑒定手段對芍藥葉霉病病原菌進行鑒定，確定山東省芍藥葉霉病是由鏈格孢(Alternaria alternata)和細極鏈格孢(Alternariatenuissima)兩種病原菌引起的復合侵染，為芍藥葉霉病的防治提供了理論基礎.

針對灰霉病和葉霉病對芍藥生長發育帶來的不利影響，課題組經專題調研、種質資源收集與評價，對白花川芍藥等4個品系藥用芍藥分別進行灰霉病和葉霉病病原菌接種，觀察接種后葉片發病情況及其生理生化指標變化，比較不同品系藥用芍藥在抗病方面的差異.本研究旨在評價紅花川芍藥和白花川芍藥的抗病差異，為川芍藥抗病育種的深入研究和新品種選育提供一定的理論依據.

1 材料與方法

1.1 試驗材料

所用芍藥包含4個品系，分別由本課題組2008年在四川省中江縣自主選育“紅花川芍藥”(CSY-H)品系和“白花川芍藥”(CSY-B)品系；引種至中江縣的“杭芍藥”(HSY)和“亳芍藥”(BSY)，分別來自浙江磐安和安徽亳州，經四川農業大學生命科學學院楊瑞武教授鑒定為芍藥科芍藥屬(PaeonialactifloraPall.)“杭芍藥”和“亳芍藥”.

1.2 試驗方法

1.2.1 栽培方法 采用盆栽育苗的方式，選用下底直徑18 cm、上口直徑25 cm、高27.5 cm的盆栽盆，在盆底鋪設砂礫，每盆裝載土壤約3 kg，并于底部裝入適合的接水盤.將芍頭分切至大小均勻的3個芽頭，于2017年12月13日在盆中種植芍頭，次年葉片展開時接種灰霉病和葉霉病病原菌.

1.2.2 抗病性鑒定 在中國林業微生物菌種保藏管理中心購買編號分別為cfcc87910和cfcc86571的芍藥枝孢霉(CladospriumpaeoniaePass.)和灰葡萄孢(BotrytiscinereaPers.)菌株，并接種在PDA培養基上，于25 ℃恒溫培養箱中避光培養.

借鑒鄧立寶等[12]和李喜玲等[13]的方法，用打孔器將培養的灰葡萄孢菌打成直徑4 mm的菌餅，菌絲一面貼在芍藥葉片傷口處，用濕潤的脫脂棉固定，套袋保濕3 d，分別于接種前(第0 d)及接種后5,10,20,30 d時采集芍藥葉片，觀察各品系芍藥葉片發病情況.采用氮藍四唑(NBT)法[14]測定SOD活性,采用愈創木酚法[14]測定POD酶活性,采用高錳酸鉀滴定法[14]測定CAT活性,參考李忠光等[15]的方法測定PPO活性,參考Tovar等[16]的方法測定PAL活性,采用硫代巴比妥酸法[17]測定MDA含量.

參考石顏通等[18]、李樹德[19]的分級標準評定芍藥葉片灰霉病病斑等級(表1)，并計算病情指數:

表1 芍藥灰霉病葉部病斑分級標準

參考楊德翠[20]的方法，用毛刷將PDA培養基上芍藥枝孢霉的病原孢子刷下，用無菌水配成3.5×106個·mL-1的孢子懸浮液，將孢子懸浮液噴于芍藥葉片的正反面，直至滴水為止，套袋保濕3 d，分別在接種前(第0 d)以及接種后5,10,15,20,30 d時采集各品系芍藥葉片，測定葉片的SOD,POD,CAT,PPO,PAL活性和MDA含量，觀察各品系芍藥葉片發病情況，并參考楊德翠[20]、李樹德[19]的分級標準評定芍藥葉霉病葉部病斑等級(表2)，計算病情指數:

表2 芍藥葉霉病葉部病斑分級標準

各品系芍藥在感染葉霉病和灰霉病的第30 d，根據病情指數進行抗性水平評價(表3)[18].

表3 芍藥灰霉病和葉霉病的抗性水平分類

1.3 數據處理

利用Excel 2016進行數據處理，SPSS 22.0進行顯著性分析和方差分析，Origin 9.1進行繪圖.

2 結果與分析

2.1 不同品系芍藥葉片灰霉病和葉霉病發生程度

如圖1和圖2所示，在感染灰霉病、葉霉病30 d后，各品系芍藥葉片都出現一定的受損和病斑，HSY葉片受損程度及病斑數量和大小均顯著高于其他品系.而BSY受灰霉病和葉霉病影響最小，其次是CSY-H和CSY-B.

圖1 接菌30 d后不同品系芍藥葉片灰霉病發生程度

圖2 接菌30 d后不同品系芍藥葉片葉霉病發生程度

2.2 灰霉病和葉霉病對芍藥葉片生理特性的影響

2.2.1 灰霉病和葉霉病對芍藥葉片抗氧化酶系統的影響 如圖3所示，隨著感染灰霉病天數增加，4個品系芍藥的SOD活性、 CAT活性以及HSY和BSY的POD活性均呈先上升后下降趨勢；感染葉霉病芍藥的SOD和POD活性基本呈上升趨勢，CAT活性先上升后下降.

在灰霉病感染下第10 d時，HSY的SOD和POD活性以及BSY與CSY-H的CAT活性均達到峰值，隨后開始下降.在第30 d時，CSY-H和CSY-B的POD活性達到最大值，BSY,CSY-B和CSY-H的CAT活性下降到接種前水平，而HSY的CAT活性顯著低于接種前(P<0.05).

在接種葉霉病第5～30 d期間，BSY的SOD活性都高于其他品系芍藥，在第10～30 d期間，各品系芍藥POD活性均顯著增加(P<0.05)，在第20 d時CSY-H和CSY-B的CAT活性達到峰值，在第30 d時，4個品系芍藥的POD活性都達到最大值；整體來說BSY的SOD和POD活性上升幅度更大，且保持了較好的活性.

圖3 灰霉病和葉霉病對芍藥葉片SOD、POD和CAT活性的影響

2.2.2 灰霉病和葉霉病對芍藥防御酶系統的影響 如圖4所示，感染灰霉病后，CSY-B和CSY-H的PPO活性和PAL活性、HSY的PPO活性以及BSY的PAL活性均呈先上升后下降趨勢；HSY的PAL活性則呈先上升后下降再上升趨勢，BSY的PPO活性呈持續上升趨勢.在接種灰霉病前，BSY的PPO活性顯著低于其他3個品系芍藥(P<0.05)，感染第5～20 d時，4個品系芍藥的PPO活性都顯著上升，其中CSY-B和CSY-H的上升速率高于HSY.接種20 d后4個品系芍藥PAL活性均達最大值，BSY的PAL活性提升程度高于其他3個品系芍藥.

接種葉霉病后，HSY,BSY和CSY-B的PPO活性先增高后下降再增高，CSY-H的PPO,PAL以及CSY-B的PAL逐漸增加，HSY和BSY的PAL活性先升高后降低.CSY-B的PPO活性和PAL活性以及BSY的PPO活性在染病第10 d時達到第一個峰值，隨后下降又上升.在第20 d時，BSY和CSY-H的PAL活性達到最大值，30 d時下降到感病前水平，CSY-H的PPO活性在30 d時達到最大值.

圖4 灰霉病和葉霉病對芍藥葉片PPO和PAL活性的影響

2.2.3 灰霉病和葉霉病對芍藥葉片MDA含量的影響 如圖5所示，在感染灰霉病時，4個品系的芍藥MDA含量均表現出先上升后下降趨勢.在第20 d時達到峰值，且CSY-B,CSY-H以及HSY的MDA含量顯著高于BSY(P<0.05).第30 d時，各品系芍藥MDA含量開始顯著下降(P<0.05)，且CSY-B的MDA含量顯著高于BSY和CSY-H(P<0.05)，與HSY之間差異不顯著(P>0.05).在感染葉霉病后，HSY,BSY和CSY-B的MDA含量整體呈上升趨勢，而CSY-H的MDA含量先增高后降低.第30 d時，CSY-B,HSY和BSY的MDA含量達到峰值.CSY-H在第5 d時MDA含量達到了最大值，總體來說BSY的MDA含量增加最少.

圖5 灰霉病和葉霉病對芍藥葉片丙二醛含量影響

2.3 不同品系芍藥對灰霉病和葉霉病的抗性水平

由表4和表5可以看出，隨著感病時間的延長，各品系芍藥灰霉病和葉霉病病情均不斷加重.在感染灰霉病的情況下，HSY病情發展最快，其次是CSY-B和CSY-H，最后是BSY.在染病的各個時期，BSY和CSY-H病情指數都顯著低于HSY和CSY-B.接種灰霉病第30 d時，發現HSY表現為中感，BSY，CSY-B和CSY-H均表現為中抗.

在接種葉霉病第5 d時，發現HSY染病率和感病程度顯著低于CSY-H和CSY-B，但隨后其病情指數開始不斷上升，且病情發展最快.BSY染病最晚，病情發展最慢，其病情指數在各時期均顯著低于其他芍藥.在接種前期，CSY-H和CSY-B染病最早，病情指數顯著高于BSY和HSY，隨后兩者病情發展緩慢.根據接種葉霉病第30 d時的病情指數，HSY表現為高感，BSY為中抗，CSY-B和CSY-H均為中感.整體上看，BSY對灰霉病和葉霉病抗性最強，其次是CSY-H和CSY-B，HSY對灰霉病和葉霉病的抗性最弱.

表4 不同品系芍藥灰霉病病情發展及抗性水平

表5 不同品系芍藥葉霉病病情發展及抗性水平

3 討論

大量研究表明，病原菌侵染植物后，植株體內會產生過量的活性氧物質，從而影響自身正常的生理活動，這時保護酶系統則起到了清除活性氧自由基及過氧化物的作用[21].本研究發現，各品系芍藥在感染灰霉病后，其SOD,POD和CAT活性發生了先增高后降低的變化，說明在灰霉病感染前期，病原菌復制數量較低，各品系芍藥抗性均較強，芍藥處于防御應激階段，抗氧化酶活性較為活躍.而隨著病原菌入侵時間增加，各品系芍藥抗氧化酶活性開始緩慢下降，說明病原菌復制數量增多，在植物細胞局部位置積累，進而使得芍藥體內代謝過程紊亂，生物膜功能受到不利影響，從而抑制了芍藥體內抗氧化酶活性[22].

在長期自然選擇和人為選育的干預下，抗病品種抗氧化酶的活性和合成效率往往高于感病品種[23].本研究中，BSY無論在感染灰霉病還是葉霉病的情況下，其抗氧化酶活性在達到峰值時的增加幅度都高于其他品系，且下降速度較慢.楊翠徳[20]在研究牡丹感染紅斑病后抗氧化酶活性變化的過程中，發現抗病性較強的“魯菏紅” SOD,POD和CAT活性的上升幅度大于易感病的“趙粉”.張成玲等[24]曾利用鐮刀菌侵染不同品種甘薯，最終發現SOD,POD和CAT酶活性增加率高低與甘薯品種的抗性呈正相關.

多數植物都存在抵御病原菌侵染的酶，如PPO可以促進醌類化合物生成，對病原菌起到毒害作用，以此來抑制病原菌的侵染[25]，PAL參與苯丙烷的代謝，誘導植物產生多種抗菌物質[26].在本研究中，各品系芍藥接種葉霉病和灰霉病后PPO和PAL活性都顯著高于對照組，且抗病性最強的BSY接種灰霉病后PPO和PAL活性增幅最大.陳夕軍等[27]在研究黃瓜感染白粉病后其防御酶活性變化的過程中發現，抗性品種接種后PPO活性迅速上升，而感病品種防御活性酶的上升幅度緩慢.王生榮等[28]曾說明，植物在抵御病原菌入侵的過程中，其PAL活性會增強，抗病品種體內的PAL活性相對感病品種上升幅度更大，活性持續時間更長，積累更多抗菌物質.

大量研究表明，植物受到病原菌入侵后，代謝過程會紊亂，MDA會在植物中積累，而過量的MDA含量會導致感染病原菌細胞的膜系統受到損害[29].因此，MDA含量是病原菌入侵程度的間接反映.本研究中，各品系芍藥在灰霉病和葉霉病的感染前期MDA含量開始積累，但由于芍藥體內清除活性氧的SOD和POD活性也顯著增強，二者協同作用使得MDA含量在感染的后期開始下降.灰霉病和葉霉病抗性更強的BSY，其MDA含量低于其他品系.李捷[30]研究也發現，枸杞感染根腐病后，抗病品種MDA含量的凈增加值顯著低于感病品種.

系統選育抗病性強的藥用植物品種能夠減輕藥材在生長發育過程中受病原菌影響程度，增加最終產量和藥用成分質量，從而增加該藥材產業的經濟效益.新品種的選育是一個長期復雜的過程，而要選育出抗病性較強的優良品種則需要在選育過程中進行抗病性鑒定和研究.對選育對象直接接種病原菌則是檢驗選育對象抗病性強弱的有效手段.張恩慧[31]等采用苗期室內人工接種鑒定和田間自然誘發鑒定相結合的方法將TuMV、黑腐病、CMV病原體分別接種于不同品種的甘藍中，并篩選出了2種抗病性較強的甘藍材料.陳夕軍[32]等利用5個水稻品種“Lemont”、“武育粳3號”、“Jasmine85”、“C418”和“YSBR1”分別于溫室苗期接種30個不同的水稻紋枯病菌株，發現各品種抗病性和不同菌株致病力均存在極顯著差異，證明5個水稻品種均可作為抗水稻紋枯病鑒定材料.本研究中，接種灰霉病和葉霉病后，BSY，CSY-B和CSY-H表現出的抗病性均強于HSY，且都對灰霉病表現為中抗，而川產道地藥材CSY-H和CSY-B藥用品質優良、產量高，且目前對川芍藥的抗病研究較少[33].因此，CSY-B和CSY-H均可作為進行系統選育的優良抗病候選品系，對于后續川芍藥抗病育種的深入研究具有重要意義.

4 結論

本研究通過鑒定CSY-B，CSY-H，HSY，BSY對灰霉病和葉霉病抗性差異，初步明確BSY的抗性最強，對灰霉病和葉霉病均表現為中抗；其次是CSY-B和CSY-H，對灰霉病表現為中抗；HSY抗病性最弱，分別對灰霉病和葉霉病表現為中感和高感.由于CSY-B和CSY-H藥用品質較高且研究較少，認為CSY-B和CSY-H均可作為抗病育種研究和新品種推廣應用的候選品系.