微波輻射對雌性小鼠卵巢功能的近期影響

王晶晶，陳書強，董 杰，雷 暉，王曉紅

空軍軍醫大學第二附屬醫院 婦產科生殖醫學中心，陜西西安 710038

微波通常指頻率為300 MHz～ 300 GHz 的電磁波，是一種非電離性電磁輻射。既往研究表明，微波輻射所屬的電磁波區域是輻射產生生物學效應的關鍵區域[1]。微波技術在國防、通訊、醫療和日常生活等領域的廣泛應用(雷達L 波段1～2 GHz、S 波段2～ 4 GHz，手機1.8～ 2 GHz，微波爐915～ 2 450 MHz)，在給人們工作生活帶來便利的同時，也對人們的健康造成了潛在危害。卵巢是女性的重要生殖腺，也是微波輻射作用敏感的靶器官之一[2]。有研究報道，不同頻率的微波輻射可以影響生殖細胞的形態、功能以及細胞的凋亡，高頻微波輻射可以明顯增加不孕不育風險，甚至導致死胎、畸胎、流產和發育畸形[3-5]。目前微波輻射及其生殖損傷的研究主要集中在男性，對女性的研究相對較少，微波輻射對女性生殖系統的損傷是亟須解決的一個重要問題。本研究主要探討2 GHz(屬于S 波段雷達和手機的工作頻率)微波輻射暴露對雌性小鼠卵巢及功能的近期影響。

材料與方法

1 實驗動物 ICR 小鼠64 只購自西安交通大學動物實驗中心，飼養環境溫度保持在23℃左右，濕度保持在50%左右，飼料為Co60照射的全價營養飼料。室內照明采用12 h/12 h 明暗交替。

2 實驗分組 將64 只性成熟雌性ICR 小鼠按照輻射強度隨機分為4 組，每組16 只，對照組不進行輻射(0 w/m2)。輻射組采用高功率連續波微波輻射裝置(由西北核技術研究所提供。信號源：美國安捷倫Agilent 公司；功率放大器：德國波恩BONN 公司)，頻率設置為2 GHz(屬于雷達S 波段和手機的工作頻率)，設置3個輻射梯度：0.5 w/m2(低劑量組)，1.5 w/m2(中劑量組)，2.5 w/m2(高劑量組)。每天固定在8：00 -9：00 進行1 h 輻射，連續輻射14 d。

3 血清激素水平檢測 連續微波輻射14 d 后，每組隨機選擇6 只雌鼠稱重，之后取雌鼠眼球血置于1.5 mL 的EP 管中，室溫靜置6 h，3 000 r/min離心10 min，取上清移至新的潔凈EP 管中，于-80℃保存。按照試劑盒說明書(武漢賽培生物)，采用酶聯免疫吸附法(ELISA) 檢測雌鼠血清促卵泡激素(follicle stimulating hormone，FSH)、促黃體激素(luteinizing hormone，LH)、雌二醇(estradiol，E2)水平。

4 卵巢指數分析及卵巢HE 染色 脫頸法處死雌鼠，分離卵巢組織，用濾紙吸干表面水分后稱重。卵巢指數=卵巢重量(mg)/體質量(g)×100%。一側卵巢置于3%多聚甲醛中固定24 h，之后包埋切片并進行蘇木精-伊紅染色(HE 染色)，分析卵巢的組織形態結構變化。

5 卵巢氧化應激水平檢測 另一側卵巢進行勻漿，按照試劑盒步驟(南京建成生物)，通過化學比色法，檢測卵巢組織中超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)、過氧化氫酶(catalase，CAT)的活性和丙二醛(malondialdehyde，MDA)濃度。

6 子宮指數分析及相關因子檢測 分離子宮，用濾紙吸干表面水分后稱重。子宮指數=子宮重量(mg)/體 質 量(g)×100%。采 用qRT-PCR 檢 測 小鼠子宮中血管內皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF) 及血管內皮生長因子受體2(vascular endothelial growth factor receptor 2，VEGFR2)的表達水平，嚴格按照試劑盒說明書提取子宮組織總RNA，反轉錄成cDNA，以β-actin 作為內參基因，采用2-ΔΔCt法計算目的基因在mRNA 相對表達水平，引物由上海生工生物有限公司合成，引物序列見表1。

表1 基因引物序列Tab.1 Primer sequences of genes

7 定點交配 輻射14 d 后，將各組剩余的10 只雌性小鼠，與既往曾交配過的正常雄性小鼠(9 周齡) 合籠(雌雄比例=2∶1)。次日上午8：00 左右觀察雌鼠陰道口是否出現陰栓，如觀察到陰栓則視為交配成功，記作妊娠0.5 d。若未見陰栓，可于下午5：00 左右繼續合籠交配，持續1 周。

8 雌鼠生育力評估 妊娠18.5 d 后將孕鼠脫頸法處死，解剖后記錄每只孕鼠窩仔數，并統計受孕率(受孕數/雌鼠總數)。根據胎鼠肛門與生殖器的距離以及形態鑒別子代性別(雌鼠肛門距生殖器較近，肛門和生殖器之間形態為縫狀；雄鼠肛門距生殖器較遠，肛門和生殖器之間形態為柱狀)。

9 統計學方法 所有數據通過SPSS 20.0 統計學軟件進行分析，計量資料以表示，多組間行單因素方差分析，兩兩比較采用HSD-q檢驗；計數資料用率(%) 表示，進行χ2檢驗；P＜0.05 為差異有統計學意義。

結 果

1 微波輻射暴露對雌鼠激素水平的影響 比較四組雌鼠的性激素水平，LH 和FSH 水平均無統計學差異(P＞0.05)。E2及卵巢指數均有統計學差異(P＜0.05)。與對照組相比，3個暴露組的血清LH、FSH 水平略有升高，但差異無統計意義(P＞0.05)，高劑量組血清E2及卵巢指數明顯降低，和其他各組的差異多有統計學意義(P＜0.05)。見表2。

表2 微波輻射暴露對雌鼠激素水平的影響(n=6)Tab.2 Effect of microwave radiation exposure on the hormone level of estrogen in mice (n=6)

2 微波輻射暴露對雌鼠卵巢的影響 比較雌鼠的卵巢組織結構，對照組小鼠卵巢結構清晰完整，各級卵泡豐富且發育良好，顆粒細胞層次多且排列整齊，閉鎖卵泡很少(圖1A)；暴露組卵巢結構出現不同程度的損傷，HE 染色表現黃體數目減少，顆粒細胞層變薄且層次紊亂，顆粒細胞數目減少，成熟卵泡個數明顯減少，閉鎖卵泡個數明顯增多(圖1B～ 圖1D)。

圖1 微波輻射暴露對雌鼠卵巢結構的影響(200×。黑色箭頭示正常卵泡；黃色箭頭示閉鎖卵泡)A：對照組；B：低劑量組；C：中劑量組；D：高劑量組Fig.1 Effect of microwave radiation exposure on the ovarian structure of female mice (200×.Black arrows:normal follicles;yellow arrows:atretic follicles)A:control group;B:low-dose group;C:middle-dose group;D:high-dose group

3 微波輻射暴露對雌鼠卵巢氧化應激水平的影響 比較四組雌鼠卵巢的氧化應激水平，SOD、CAT和MDA 水平均有統計學差異(P＜0.05)。與對照組相比，高劑量組暴露后，雌鼠卵巢組織中SOD和CAT 含量顯著降低，MDA 水平顯著升高，差異均有統計學意義(P＜0.05)。見表3。

表3 微波輻射暴露對雌鼠卵巢氧化應激的影響(n=6)Tab.3 Effect of microwave radiation exposure on the oxidative stress in the ovaries of female mice (n=6)

4 微波輻射暴露對雌鼠子宮的影響 比較四組雌鼠子宮指數和子宮組織中標志分子的表達水平，子宮指數和子宮組織中VEGF 的水平均有統計學差異(P＜0.05)，子宮組織中VEGFR2 的水平無統計學差異(P＞0.05)。與對照組相比，低劑量組和中劑量組的子宮指數、子宮組織中VEGF 和VEGFR2 的表達水平無明顯變化(P＞0.05)；高劑量組輻射暴露后，雌鼠子宮指數、子宮組織中VEGF 和VEGFR2 的表達水平均明顯降低，差異均有統計學意義(P＜0.05)。見表4。

表4 微波輻射暴露對雌鼠子宮的影響(n=6)Tab.4 Effect of microwave radiation exposure on the uterus of female mice (n=6)

5 微波輻射暴露對子代窩仔數和性別比的影響 比較四組雌鼠的受孕率和窩仔數，受孕率無統計學差異(P＞0.05)，窩仔數有統計學差異(P＜0.05)。與對照組相比，高劑量組的受孕率和窩仔數顯著降低，中劑量組和高劑量組的窩仔數顯著降低，差異均有統計學意義(P＜0.05)。比較各組雌鼠和雄鼠的數量，差異均統計學意義(P＜0.05)。比較雌鼠的比例，各組之間無統計學差異(P＞0.05)。見表5。

表5 微波輻射暴露對子代窩仔數和性別比的影響(n=10)Tab.5 Influence of microwave radiation exposure on litter size and sex ratio of offspring (n=10)

討 論

目前，電磁輻射已經成為繼大氣污染、水資源污染、噪聲污染后的“第四大環境污染源”，其給人們生活帶來便利的同時，也對人們及后代的健康構成威脅[6]。據世界衛生組織(WHO) 調查顯示，世界范圍內育齡夫婦不孕不育發病率高達8%～ 12%，其中女性因素約占40%，且呈逐年遞增趨勢[7]。研究證實，女性生殖腺卵巢是微波輻射敏感的靶器官之一，容易遭受微波輻射的損傷，但微波電磁輻射對女性生殖功能的影響及其相關機制尚未闡明。

目前國內外有關微波輻射對雌性生殖功能的影響及相關機制研究，主要基于動物模型。馬惠榮等[8-9]的研究結果顯示，輻射組大鼠血清E2水平較正常組顯著降低，卵泡和黃體直徑均小于正常組，顆粒細胞層數和數量減少。Roshangar等[10]在對暴露于低頻電磁場的孕鼠子代進行研究時發現，發育期暴露于電磁場中會影響雌鼠的卵母細胞分化和卵泡生成，并可能通過減少卵巢儲庫而導致生育能力下降。Sagioglou 等[11]發現，手機微波輻射可以加速小鼠卵母細胞凋亡。以上研究表明微波輻射可以影響雌性生殖健康。本研究同樣發現2 GHz 微波輻射暴露可以導致雌鼠血清E2水平顯著降低且卵巢結構出現不同程度的損傷，同時降低受孕率和子代窩仔數，導致雌鼠生育力降低。

VEGF 是一種高度特異性的血管內皮細胞有絲分裂因子，通過與VEGFR 結合引起一系列的信號反應，可釋放多種細胞因子與生長因子，刺激血管內皮細胞的增殖與遷移，進而促進血管生成，在胚胎植入及妊娠維持過程中發揮重要作用[12]。本研究發現，2 GHz 微波輻射暴露可以導致雌鼠的子宮指數顯著降低，且子宮組織中VEGF 和VEGFR2 的表達水平均受到抑制，說明微波輻射暴露可影響子宮組織的血管生成，進而影響胚胎植入和妊娠維持。

關于微波輻射對雌性生育力影響的機制，國內外研究主要集中在微波輻射可導致氧化應激反應和產生過量氧自由基，引起細胞毒性進而損傷生殖功能[13-14]。孫靈嬌等[15]發現，妊娠期900 MHz(370 μW/cm2) 手機頻率電磁輻射可引起大鼠不良妊娠結局，可能與胎盤組織SOD 和谷胱甘肽過氧化物酶活力降低，胎盤組織氧化損傷存在密切關系。Shahin 等[16]研究顯示，2.45 GHz 微波照射暴露小鼠卵巢組織中NO 水平和抗氧化酶活性顯著降低，并影響小鼠胚胎著床。Sangun 等[17]的同樣發現2.45 GHz 微波照射暴露后，雌性Wistar 大鼠大腦和卵巢組織中總氧化狀態和氧化應激指數顯著增加，進而影響其生殖功能。而抗氧化藥物(如褪黑素、輔酶Q10、維生素C/E)的應用，可以有效緩解微波輻射所造成的女性生育力損傷[18-19]。本研究同樣發現2 GHz 微波輻射暴露可以導致雌鼠卵巢組織中SOD 和CAT 含量顯著降低，MDA水平顯著升高。

綜上可知，本研究發現2 GHz 微波輻射可對雌性ICR 小鼠生殖功能造成一定程度損傷，主要體現在血清E2水平降低、卵巢結構紊亂、子宮指數降低、子宮血管生成受到抑制、受孕率降低和子代窩仔數減少。探究其原因，可能是因為微波輻射誘導氧化應激產生過多氧自由基，引起細胞毒性進而損傷雌鼠生殖功能，但具體機制尚未闡明。同時，本研究也存在一些不足之處，如納入樣本量較少且未進行深入的機制研究，后期可以從線粒體功能層面對損傷機制進行深入探索。