HPLC 法測定阿扎胞苷中殘留溶劑二甲基亞砜含量

趙成欣，王金玲，李丹丹，李泉妙

（國藥一心制藥有限公司，長春 130000）

阿扎胞苷為嘧啶核苷胞苷類似物，屬于一類被稱為低甲基化藥物（Hypomethylatingagents）的表觀遺傳學（Epigenetic）抗腫瘤藥。由Pharmion 制藥公司研制開發，持證商為Celgene 公司，于2004 年5 月在美國批準上市，上市規格為 100 mg，商品名“Vidaza?”，是第一個骨髓增生異常綜合征的治療藥物[1]。

阿扎胞苷原料合成工藝使用了二甲基亞砜（Dimethyl sulfoxide DMSO），根據2020 年版《中國藥典》和ICHQ3C 殘留溶劑指導原則相關要求，需要對原料合成過程中使用的殘留溶劑進行去除，并對殘留溶劑進行檢查[2-3]。目前，有關阿扎胞苷原料中殘留溶劑二甲基亞砜檢測方法方面的研究，國內尚未見報道。本文采用高效液相色譜法（HPLC）建立了阿扎胞苷原料中殘留溶劑二甲基亞砜含量的檢測方法。通過專屬性、重復性、準確度等試驗結果表明，該方法操作簡單，準確性，重現性良好，為阿扎胞苷原料質量標準的建立提供依據。

1 儀器與試劑

Waters e2695 高效液相色譜儀，配置二極管陣列檢測器；Aglient 1260 高效液相色譜儀；

阿扎胞苷原料藥（自制，180301 批、180201 批、x-180307 批）；二甲基亞砜（SIGMA，色譜純）；超純水（本公司自制，電阻率為18.2 MΩ·cm）；乙腈為色譜純。

2 方法與結果

2.1 色譜條件

色 譜 柱Agilent ZORBAX C8（5 μm，4.6×250 mm）；流 動 相 水- 乙 腈95∶5（V∶V）；流 速1.0 mL/ min；進樣量5 μL；檢測波長214 nm。

2.2 溶液配制

空白溶液：超純水。

對照品貯備液：取二甲基亞砜約50.60 mg，精密稱定，用超純水溶解并定量稀釋制成每1 mL 含二甲基亞砜約2.17 μg 的溶液，為對照品貯備液。

對照品溶液：精密量取2.2 節中對照品貯備液1 mL 置100 mL 量瓶中，用超純水定量稀釋至刻度，為對照品溶液。

線性溶液：精密量取2.2 節中對照品貯備液0.25 mL、0.5 mL、1.0 mL、1.2 mL、1.6 mL、2.0 mL、2.4 mL 分別置10 mL 量瓶中，用超純水定量稀釋定容至刻度，制成每1 mL 含二甲基亞砜分別約為5.060、10.120、20.240、24.288、32.384、40.480、48.576 μg/mL 線性溶液。

供試品溶液：稱取阿扎胞苷原料約40 mg，精密稱定，置10 mL 量瓶中，加入適量超純水溶解后定容至刻度，為供試品溶液。

系統適用性溶液：稱取阿扎胞苷原料約40 mg，精密稱定，置10 mL 量瓶中，用超純水適量溶解后，加入對照品貯備液0.2 mL，再用超純水定量稀釋定容至刻度，為系統溶液。

2.3 方法學考察

2.3.1 專屬性

取2.2 節中的空白溶液、對照品溶液、系統適用性溶液、供試品溶液，按2.1 節中色譜條件進樣測定，記錄色譜圖。結果見圖1，可見空白溶液不干擾供試品中二甲基亞砜檢測；阿扎胞苷與二甲基亞砜分離度為3.4，大于2.0，拖尾因子小于1.5，理論板數大于4 000；表明該方法專屬性良好。

圖1 空白溶液、供試品溶液、二甲基亞砜照溶液與系統溶液對比圖Fig.1 Comparison of blank solution， test solution， dimethyl sulfoxide reference solution and system solution

2.3.2 定量限與檢測限

取2.2 節中對照品溶液，用超純水逐級稀釋，以信噪比（S/N）大于10 為定量限，以信噪比（S/ N）大于3 為檢測限，按2.1 節中色譜條件進樣測定，記錄色譜圖。定量限為5.060 μg/mL，檢測限為0.12 μg/ mL。

取以信噪比（S/N）大于10 的定量限溶液，按2.1節中色譜條件連續進樣6 針，記錄色譜圖。二甲基亞砜保留時間的RSD 值為0.38%，小于1.0%，峰面積的RSD 值為1.34%，小于2.0%，表明定量限重復性良好。

2.3.3 系統適用性試驗

取2.2 節中對照品溶液，按2.1 節中色譜條件連續進樣6 針，記錄色譜圖。二甲基亞砜保留時間的RSD 值為0.29%，小于1.0%，峰面積RSD 值為0.67%（n= 6）。表明該方法系統適用性良好。

2.3.4 線性與范圍

精密量取2.2 節中線性溶液，按2.1 節中色譜條件進樣測定，記錄色譜圖。以溶液濃度（μg/mL）為橫坐標（X軸）、峰面積（A）為縱坐標（Y軸），繪制標準曲線，所得線性方程見圖2，二甲基亞砜在5.06 ～ 48.58 μg/mL 內線性關系良好。

圖2 二甲基亞砜線性Fig.2 Calibration curve of dimethyl sulfoxide standard solution

2.3.5 重復性和中間精密度

取同一批次阿扎胞苷原料，按2.2 節中方法制備的供試品溶液6 份，按2.1 節中色譜條件進樣測定，以外標法計算每份樣品中二甲基亞砜含量。結果顯示，含量測定值的RSD（n= 6）為0.8%，表明本方法重復性良好。

由不同人員、在不同時間、使用不同的儀器，重復上述操作，按外標法計算每份樣品中的二甲基亞砜含量。結果顯示，含量測定值的RSD 值（n= 6）為1.5%。

2.3.6 回收率試驗

精密量取9 份已知二甲基亞砜含量的阿扎胞苷原料約40 mg，精密稱定，分別置10 mL 量瓶中，分別加入2.2 節中的對照品貯備液0.025 mL、0.1 mL、0.2 mL 各3 份，按2.2 節中的供試品溶液配制方法制備不同水平的回收率供試品溶液。按2.1 節中色譜條件進行測定，按外標法計算回收率。結果顯示，不同加樣水平條件下的二甲基亞砜的平均回收率（n= 9）為100.5%，RSD 值為0.9%。

2.3.7溶液穩定性

取2.2 節中的供試品溶液，在室溫下放置，分別于0h、1h、2h、4h、16h，按2.1 節中色譜條件進行測定，記錄色譜圖，計算RSD。結果顯示，16 h 內供試品溶液中二甲基亞砜峰面積的RSD 值為1.9%，小于2.0%，表明在室溫條件下供試品溶液放置16 h 穩定。

2.4 二甲基亞砜含量測定

取各批次阿扎胞苷原料，按2.2 節中方法制備對照品及供試品溶液，按2.1 節中色譜條件進行測定，以外標法計算二甲基亞砜含量，結果見表1。

表1 阿扎胞苷原料中二甲基亞砜含量測定結果（n = 2）Tab.1 Determination results of dimethyl sulfoxide in azacitidine （n = 2）

3 討論

3.1 方法選擇

據報道，目前二甲基亞砜的檢測方法主要有氣相色譜法、元素分析法等。但由于二甲基亞砜是極性物質，沸點為189℃，125℃時開始分解，采用氣相色譜法靈敏度低，且采用水為溶劑時，對色譜柱損耗嚴重；而元素分析法操作繁瑣、靈敏度低，不適合用于殘留溶劑的檢測。高效液相色譜法靈敏度高、準確性好，操作簡便[6]。本文通過實驗證明，采用高效液相色譜法檢測阿扎胞苷原料中二甲基亞砜，具有靈敏度高、準確性好等優點。

3.2 溶劑選擇

阿扎胞苷略溶于水，同時二甲基亞砜易溶于水，通過實驗可知，采用水為溶劑，當供試品溶液濃度為4 mg/mL 時，溶解性良好。進一步通過專屬性試驗結果表明，空白溶劑不干擾樣品檢測，二甲基亞砜與主峰分離度良好，故選擇水為溶劑。

3.3 色譜條件的確定

阿扎胞苷和二甲基亞砜均在214 nm 有紫外吸收，故選擇波長為214 nm；同時，根據阿扎胞苷和二甲基亞砜的理化性質，初步選擇流動相為乙腈和水，通過方法可知，當流動相中乙腈-水（95∶5）時，二甲基亞砜與阿扎胞苷及其相鄰雜質峰分離度良好，拖尾因子及理論塔板數均符合規定，故流動相為乙腈-水（95∶5）；根據二甲基亞砜定量限濃度及《中國藥典》中殘留二甲基亞砜殘留限度要求（≤0.5%），最終確定供試品濃度為4 mg/mL、進樣量5 μL。

本文建立了一種阿扎胞苷原料殘留溶劑二甲基亞砜的高效液相檢測方法，實驗結果表明，本方法操作簡單、專屬性強、靈敏度高、重復性、準確性好，能夠準確測定阿扎胞苷原料中二甲基亞砜的含量，為阿扎胞苷原料質量標準制定提供依據。